李 茹，崔曉東，李玉英，李 晨，王轉(zhuǎn)花，，*

（1.山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030006；2.山西大學(xué) 化學(xué)生物學(xué)與分子工程教育部重點實驗室，山西 太原 030006）

黑豆脂氧合酶的制備及其酶學(xué)活性的鑒定

李 茹1，崔曉東2，李玉英2，李 晨1，王轉(zhuǎn)花1，2，*

（1.山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030006；2.山西大學(xué) 化學(xué)生物學(xué)與分子工程教育部重點實驗室，山西 太原 030006）

從黑豆種子中分離純化1 種黑豆脂氧合酶——bsLOX，對其酶學(xué)活性及降解花色苷等性質(zhì)進(jìn)行初步研究。采用緩沖液抽提、硫酸銨沉淀、透析、陽離子交換層析及凝膠層析等方法純化出具有β-葡萄糖苷酶活性的bsLOX；分別以亞油酸鈉和對硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（p-nitrophenyl β-D-glucopyranoside，pNPG）為反應(yīng)底物鑒定bsLOX的脂氧合酶活性和β-葡萄糖苷酶活性。從黑豆種子中純化獲得的bsLOX在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE）圖譜顯示單一條帶，分子質(zhì)量約為95 kD。酶活性分析表明，純化的bsLOX以亞油酸鈉為底物時，酶活力為13 U/mL；當(dāng)以pNPG為底物在405 nm波長處檢測到了對硝基苯酚的生成，從而推測bsLOX具有β-葡萄糖苷酶活性。高效液相色譜實驗結(jié)果表明bsLOX可以降解花色苷（矢車菊素-3-O-葡萄糖苷、矮牽牛素-3-O-葡萄糖苷）為花色素（矢車菊素、矮牽牛素）。由于降解作用不完全，繼而發(fā)現(xiàn)花色素能抑制bsLOX的酶活性。bsLOX是黑豆中的一種兼具β-葡萄糖苷酶功能的蛋白質(zhì)，而花色素可能是天然的bsLOX抑制劑。

黑豆；脂氧合酶；β-葡萄糖苷酶活性；花色苷；花色素

脂氧合酶（lipoxygenase，LOX，ECl.13.11.12），俗稱脂肪氧化酶、脂肪加氧酶、脂肪氧合酶或類胡蘿卜素氧化酶，廣泛存在于哺乳動物、植物和微生物中［1-3］。脂氧合酶在豆類中含量較為豐富，對豆類產(chǎn)品的營養(yǎng)成分及品質(zhì)會產(chǎn)生較大的影響。植物中LOX是一種非血紅素蛋白，它專門催化具有順，順-1，4-戊二烯結(jié)構(gòu)的不飽和脂肪酸的加氧反應(yīng)，其底物主要是亞油酸（linoleic acid）和亞麻酸（lionlenic acid）［4-5］。在LOX作用下，亞油酸和亞麻酸轉(zhuǎn)化成氫過氧化脂肪酸，然后在其他酶的作用下，產(chǎn)生具有特殊風(fēng)味的酯類物質(zhì)［6］。大豆中的脂氧合酶研究已經(jīng)較為透徹。大豆脂氧合酶是一種單一多肽鏈蛋白，存在著3 種同工酶［7］。大豆LOX-1最適pH值為9.0左右，對亞油酸活性較高，LOX-2和LOX-3對亞油酸甲酯活性比亞油酸稍高，最適pH值分別為6.5和7.0［8］。此外大豆LOX-1能與水溶性硫酸亞油酸酯反應(yīng)，但LOX-2和LOX-3對硫酸亞油酸酯的催化活性較弱［9］。在大豆產(chǎn)品中，脂肪氧合酶能催化脂肪氧化生成n-己醛和n-戊醛，這些產(chǎn)物是形成豆腥味的主要成分。

黑豆是豆科植物大豆的黑色種子，是一種食藥兩用的作物。古代醫(yī)書記載，黑豆具有烏發(fā)、補腎、解毒、延年益壽等功效［10］；現(xiàn)代中醫(yī)學(xué)也表明黑豆可烏發(fā)、活血解毒、明目、軟化血管、治療不孕等［11］。從營養(yǎng)學(xué)角度看，黑豆富含蛋白質(zhì)、脂肪、維生素、微量元素等多種營養(yǎng)成分，同時又具有多種生物活性物質(zhì)，如異黃酮、皂苷、黑豆色素等［12］。本實驗以黑豆種子為原材料，分離純化得到黑豆脂氧合酶（black soybean lipoxygenase，bsLOX），同時發(fā)現(xiàn)bsLOX還具有β-葡萄糖苷酶活性，可以將黑豆種皮中的花色苷水解為等分子花色素和葡萄糖，進(jìn)而水解的花色素可以抑制脂氧合酶及糖苷酶活性，這為深入研究脂氧合酶的生物學(xué)功能及尋找天然的LOX抑制劑提供了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑豆種子，由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院饋贈。

亞油酸鈉 美國Sigma公司；對硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（p-nitrophenyl β-D-glucopyranoside，pNPG）生工生物工程（上海）股份有限公司；矢車菊素-3-O-葡萄糖苷、矮牽牛素-3-O-葡萄糖苷、飛燕草素葡萄糖苷、矢車菊素、矮牽牛素、飛燕草素 美國Sigma公司；乙腈、甲酸為色譜純試劑；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

?KTA Explorer蛋白質(zhì)純化系統(tǒng) 美國General Electric公司；Agilent 1200系列高效液相色譜儀安捷倫科技有限公司；Lambda 35型紫外-可見分光光度計美國Perkin Elmer公司；Lx800酶標(biāo)儀 美國Bio-Tek公司。

1.3 方法

1.3.1 LOX的分離純化

黑豆粉經(jīng)過緩沖液抽提、鹽析、脫鹽、離子交換層析、凝膠層析等步驟，獲得電泳純的目的蛋白。采用Folin-酚法測定蛋白濃度［13］，分裝純化的蛋白，放置于-20 ℃冰箱備用。

1.3.2 脂氧合酶活性的測定

參照Axelrod等［8］的方法，略作修改，具體操作為：采用3 mL反應(yīng)體系，其中10 mmol/L亞油酸鈉母液50 μL（取28 μL亞油酸鈉，緩慢加入8 mL蒸餾水中，再加入36 μL吐溫-20，混勻，滴加2 mol/L氫氧化鈉至溶液澄清，然后以蒸餾水定容至10 mL），磷酸鹽緩沖液（20 mmol/L，pH 6.0）2.75 mL，LOX酶液200 μL。在室溫（25 ℃）下反應(yīng)，于234 nm波長處測定光密度值。加酶液15 s后開始計時，記錄3 min（每隔30 s測1 次）內(nèi)光密度值變化［14］，酶活力單位定義為每分鐘OD234nm增加0.01為1 個LOX活力單位（U/mL）［15-16］。

1.3.3 β-葡萄糖苷酶活性的測定［17］

采用250 μL反應(yīng)體系（在酶標(biāo)板內(nèi)進(jìn)行），其中67 mmol/L磷酸緩沖液（pH 5.0）100 μL，1 mg/mL谷胱甘肽溶液10 μL，0.116 mol/L pNPG溶液20 μL，45 ℃保溫10 min后，加入LOX溶液20 μL，反應(yīng)20 min，用0.1 mol/L Na2CO3溶液100 μL終止反應(yīng)，于405 nm波長處測定在酶的作用下對硝基苯酚的釋放量；用對硝基苯酚純品配制不同濃度（0、2、4、6、8、10、12 μmol/L）的標(biāo)準(zhǔn)溶液，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；得出回歸方程y=kx+b，其中y為A405nm，x為對硝基苯酚濃度/（μmol/L），k為斜率，b為截距。利用公式計算被測樣品的酶活力。酶活力單位定義為每毫升酶液1 min內(nèi)水解產(chǎn)生1 μmol對硝基苯酚為1 個活力單位（U/mL）。酶活力計算公式如下：

式中：k為對硝基苯酚-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率；b為對硝基苯酚-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距；A405nm為405 nm波長處的吸光度；V為反應(yīng)體系中酶液體積/mL；N為粗酶液的濃縮倍數(shù)；t為反應(yīng)時間/min。

1.3.4 脂氧合酶對花色苷的降解

脂氧合酶對花色苷的降解采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法分析。標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備：精確稱取一定質(zhì)量的花色苷（矢車菊素-3-O-葡萄糖苷、矮牽牛素-3-O-葡萄糖苷、飛燕草素葡萄糖苷）和花色素（矢車菊素、矮牽牛素、飛燕草素）標(biāo)準(zhǔn)品，用酸性甲醇（色譜級）溶解，配制質(zhì)量濃度為 0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品儲備液，避光（錫箔紙包裹），-20 ℃保存。

樣品溶液的制備：67 mmol/L磷酸鉀緩沖液（pH 5.0）70 μL，1 mg/mL谷胱甘肽溶液10 μL、1 mg/mL的色素糖苷（矢車菊-3-O-葡萄糖苷、矮牽牛素-3-O-葡萄糖苷、飛燕草素葡萄糖苷）溶液50 μL，45 ℃保溫20 min后加入1 mg/mL的β-葡萄糖苷酶溶液20 μL，反應(yīng)30 min，用0.1 mol/L的Na2CO3溶液100 μL終止反應(yīng)。上樣前均用孔徑為0.22 μm的濾膜過濾。

實驗采用梯度洗脫程序：流動相A：5%的甲酸溶液（色譜級）；流動相B：100%的乙腈（色譜級）；進(jìn)樣量為10 μL；檢測波長為513 nm；柱溫為25 ℃；流速為0.8 mL/min；洗脫梯度程序：90% A、10% B洗脫8 min，85% A、15% B洗脫15 min， 80% A、20% B洗脫17 min，直至最終洗脫完成。

1.3.5 花色素對脂氧合酶活性的影響

將純化的bsLOX分別與不同濃度的花色素（矢車菊素、矮牽牛素、飛燕草素）室溫孵育30 min，實驗組中花色素與bsLOX濃度比分別為0.1∶1、0.5∶1、1∶1，對照組不加花色素。分別按照1.3.2節(jié)和1.3.3節(jié)的方法測定并計算bsLOX的酶活力。

2 結(jié)果與分析

2.1 bsLOX的純化及活性測定結(jié)果

經(jīng)過粗提、硫酸銨沉淀、透析，獲得的粗蛋白經(jīng)離子交換層析和凝膠層析純化后獲得純度較高的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)經(jīng)10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE）分離后呈現(xiàn)單一條帶（圖1，泳道 4），分子質(zhì)量約為95 kD。

LOX可以專一地催化多元不飽和脂肪酸氧化形成具有共軛雙鍵的過氧化物，此化合物在234 nm波長處有特征吸收峰。分光光度法測定的是酶催化反應(yīng)的初期產(chǎn)物。吸收值的大小與酶活力呈正相關(guān)，可用分光光度計定量測定。該方法的顯著優(yōu)點是可連續(xù)測定。依據(jù)該實驗原理，按照1.3.2節(jié)的方法，檢測3 min內(nèi)A234nm的變化。由圖2可知，隨著時間的增加，A234nm值越來越大，說明生成的過氧化物也越來越多，計算得出bsLOX的酶活力為13 U/mL，顯示了較高的脂氧合酶活性。

2.2 β-葡萄糖苷酶的活性

為了判斷bsLOX的β-葡萄糖苷酶活性，本實驗選用pNPG作為反應(yīng)底物［18］。pNPG是一種小分子化合物，在β-葡萄糖苷酶催化下脫去一分子葡萄糖，生成的對硝基苯酚在405 nm波長處有特征吸收［19］。按照1.3.3節(jié)的方法繪制對硝基苯酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線，依據(jù)回歸方程y=0.007 8x+ 0.038 7（R2=0.964 4），求出反應(yīng)體系中在酶的催化下對硝基苯酚的生成，相應(yīng)酶活力為99.6 U/mL，表明bsLOX還兼有β-葡萄糖苷酶的活性。

2.3 bsLOX對花色苷的降解

采用HPLC檢測bsLOX對花色苷的降解作用。由圖3A～C可知，底物矢車菊素-3-O-葡萄糖苷和反應(yīng)產(chǎn)物矢車菊素的保留時間分別是15.728 min和31.204 min。向底物矢車菊素-3-O-葡萄糖苷溶液中加入bsLOX，反應(yīng)20 min后，HPLC色譜圖在保留時間31.286 min時出現(xiàn)峰值，確定為矢車菊素，表明LOX催化矢車菊素-3-O-葡萄糖苷生成了矢車菊素。同樣，由圖3D～F可知，bsLOX還可以催化矮牽牛素-3-O-葡萄糖苷（保留時間為19.353 min）降解為矮牽牛素（保留時間為34.458 min）。當(dāng)反應(yīng)時間逐漸延長至約60 min時，2 種底物含量都不再減少（圖 4）。由此可知，bsLOX可以水解矢車菊素-3-O-葡萄糖苷和矮牽牛素-3-O-葡萄糖苷中的糖苷鍵，具有β-葡萄糖苷酶活性。同時發(fā)現(xiàn)，隨著反應(yīng)時間的增長，bsLOX并不能將2 種底物徹底水解，猜想可能是產(chǎn)物矢車菊素和矮牽牛素對bsLOX的酶活有抑制作用，因此本實驗進(jìn)一步研究了花色素對bsLOX酶活性的影響。

2.4 花色素對bsLOX活性的影響

分別向bsLOX溶液中加入不同濃度的矢車菊素、矮牽牛素和飛燕草素，分別測定3 種花色素存在下對bsLOX 2 種酶活力的影響。由圖5A可知，隨著c（花色素）∶c（bsLOX）的比值增大，脂氧合酶的活性逐漸降低，當(dāng)濃度比為1∶1時，矢車菊素、矮牽牛素、飛燕草素對bsLOX的抑制率分別達(dá)到41.1%、33.8%和31.8%。同樣，由圖5B可知，β-葡萄糖苷酶的活性也在逐步減弱，當(dāng)c（花色素）∶c（bsLOX）的比值為1∶1時，矢車菊素、矮牽牛素、飛燕草素對bsLOX的β-葡萄糖苷酶活性的抑制率分別達(dá)到27.5%、23%和27%。由此說明，矢車菊素、矮牽牛素和飛燕草素都具有抑制bsLOX酶活力的功能，可能是bsLOX的天然抑制劑。

3 討 論

LOX普遍存在于高等植物中，與植物的成熟和衰老等有關(guān)，是影響新陳代謝和細(xì)胞分裂的信號分子，LOX與植物的成熟、衰老密切相關(guān)，在植物受到機械傷害和病蟲侵染時能產(chǎn)生信號分子進(jìn)行調(diào)節(jié)［20］。而大豆則被認(rèn)為是很好的脂氧合酶的來源。本實驗采用粗提及離子交換柱層析等步驟，從黑豆種子中獲得1 種分子質(zhì)量約為95 kD的bsLOX，純化的蛋白以亞油酸鈉為底物證明其具有脂氧合酶活性，分子大小及酶活性與Zhang Chong等［21］的報道相一致。脂氧合酶可能兼具多種酶功能，為了揭示和拓寬本實驗獲得的LOX的生物學(xué)功能，實驗以pNPG為底物，初步探討了bsLOX的β-葡萄糖苷酶活性。結(jié)果表明，bsLOX能水解底物中的葡萄糖苷鍵，具有β-葡萄糖苷酶的活性。之后又將bsLOX分別作用于矢車菊素-3-O-葡萄糖苷、矮牽牛素-3-O-葡萄糖苷等花色苷，發(fā)現(xiàn)bsLOX可以水解矢車菊素-3-O-葡萄糖苷和矮牽牛素-3-O-葡萄糖苷，分別產(chǎn)生矢車菊素和矮牽牛素。據(jù)文獻(xiàn)報道，塔羅科的西西里血橙的果汁和成熟的水果中的β-葡萄糖苷酶也可降解花色苷［22］。本實驗發(fā)現(xiàn)，雖然bsLOX具有水解糖苷鍵的功能，但水解作用不完全，由此猜想是否產(chǎn)生的花色素對bsLOX的酶活有反饋抑制作用。本實驗發(fā)現(xiàn)，花色素矢車菊素、矮牽牛素和飛燕草素對bsLOX的脂氧合酶以及β-葡萄糖苷酶的活性均有不同程度的抑制作用，證實來自黑豆中的bsLOX不僅兼有β-葡萄糖苷酶的活性，而且該酶的水解產(chǎn)物還可部分抑制酶的活性，從而在生物體內(nèi)起到了自我調(diào)節(jié)控制的作用。大量研究表明，脂氧合酶對于食品營養(yǎng)的影響主要表現(xiàn)為：其催化產(chǎn)物對VA有破壞作用；減少了食品中必需不飽和脂肪酸的含量；作用于必需氨基酸，降低了蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價值及功能特性［23］。因此，尋找一些天然的LOX抑制劑非常重要。本實驗發(fā)現(xiàn)矢車菊素、矮牽牛素和飛燕草素可能是bsLOX的天然抑制劑，但是其他物種來源的LOX是否也具有β-葡萄糖苷酶活性，以及催化產(chǎn)物對酶本身的調(diào)控作用有待深入的研究。

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Preparation and Identification of a Black Soybean Lipoxygenase

LI Ru1， CUI Xiaodong2， LI Yuying2， LI Chen1， WANG Zhuanhua1，2，*
（1. College of Life Science， Shanxi University， Taiyuan 030006， China； 2. Key Laboratory of Chemical Biology and Molecular Engineering， Ministry of Education， Shanxi University， Taiyuan 030006， China）

Objective： To extract and purify black soybean lipoxygenase （bsLOX） containing β-glucosidase activity and investigate its anthocyanins-degrading properties and enzymatic activity. Methods： Purification of bsLOX was carried out by buffer extraction， ammonium sulfate precipitation， dialysis， cation exchange chromatography and gel filtration chromatography. The activities of lipoxygenase and β-glucosidase in bsLOX were analyzed by using sodium linoleate and p-nitrophenyl β-D-glucopyranoside （pNPG） as substrates， respectively. An LOX from black soybean seeds was obtained，which showed a single band in SDS-PAGE， with approximate molecular weight of 95 kD. The purified protein had a lipoxygenase activity of approximately 13 U/mL， and could produce nitro phenol using pNPG as substrate as detected at 405 nm， suggesting that bsLOX had β-glucosidase activity. HPLC results showed that bsLOX could only degrade part of anthocyanins （cyanidin-3-O-glucoside and petunidin-3-O-glucoside） into aglycone anthocyanidins （cyanidin and petunidin）and glucose； in turn， the residual anthocyanidins could inhibit the activity of bsLOX. Conclusion： LOX in black soybean may be a kind of protein with a variety of enzymatic functions， while anthocyanidins may be a natural bsLOX inhibitor.

black soybean； lipoxygenase； β-glucosidase activity； anthocyanin； anthocyanidins

10.7506/spkx1002-6630-201609029

Q554

A

1002-6630（2016）09-0155-05

李茹， 崔曉東， 李玉英， 等. 黑豆脂氧合酶的制備及其酶學(xué)活性的鑒定［J］. 食品科學(xué)， 2016， 37（9）： 155-159. DOI：10.7506/ spkx1002-6630-201609029. http：//www.spkx.net.cn

LI Ru， CUI Xiaodong， LI Yuying， et al. Preparation and identification of a black soybean lipoxygenase［J］. Food Science， 2016，37（9）： 155-159. （in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/spkx1002-6630-201609029. http：//www.spkx.net.cn

2015-09-16

國家自然科學(xué)基金面上項目（31171659）；國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項目（31300653）；山西省科技創(chuàng)新項目（2014091028；2015021047）

李茹（1990—），女，碩士研究生，研究方向為生物活性物質(zhì)。E-mail：892790990@qq.com

*通信作者：王轉(zhuǎn)花（1956—），女，教授，博士，研究方向為蛋白質(zhì)工程與生物活性物質(zhì)。E-mail：zhwang@sxu.edu.cn