李亞東，吳名草，湯 宇，金邦荃，*，黃鶴勇，李 鋼，馮玉英

（1.南京師范大學(xué)金陵女子學(xué)院，江蘇 南京 210097；2.南京師范大學(xué)分析測(cè)試中心，江蘇 南京 210097）

豬心肌高鐵肌紅蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)信息的光譜指認(rèn)

李亞東1，吳名草1，湯 宇1，金邦荃1，*，黃鶴勇2，李 鋼2，馮玉英2

（1.南京師范大學(xué)金陵女子學(xué)院，江蘇 南京 210097；2.南京師范大學(xué)分析測(cè)試中心，江蘇 南京 210097）

本實(shí)驗(yàn)采用掃描電子顯微鏡、X射線衍射、拉曼、紅外等現(xiàn)代光譜技術(shù)和數(shù)據(jù)庫(kù)、計(jì)算軟件等，層層剖析豬心肌高鐵肌紅蛋白（pig metmyoglobin，pMetMb）凍干粉的結(jié)構(gòu)特征和分子動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)信息。結(jié)果表明，pMetMb凍干粉表觀呈明顯的棱狀結(jié)晶體，結(jié)晶度為（95.60±1.37）%，三晶胞軸長(zhǎng)不相等（a≠b≠c），可歸屬于高晶度含水單斜結(jié)晶體。根據(jù)晶體數(shù)據(jù)庫(kù)同類化合物比對(duì)，得到pMetMb肽鏈和heme-Fe的關(guān)鍵基團(tuán)來(lái)源；經(jīng)拉曼和紅外光譜解析和推算，pMetMb肽鏈均有α螺旋、β折疊、β轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲4 種蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)，分別占50%、14%、24%和12%；分別由3 個(gè)酰胺區(qū)中C=O、C=C、C—N、—COO-、C—H、N—H的不同振動(dòng)形式所產(chǎn)生；六配位低自旋的Fe—C—N形成heme-Fe3+。因此，pMetMb為六配位低自旋構(gòu)象，是結(jié)構(gòu)緊密、性質(zhì)穩(wěn)定的球狀蛋白質(zhì)。

單斜晶體；結(jié)構(gòu)域；動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)信息；光譜特征；豬心肌高鐵肌紅蛋白

肌紅蛋白（myoglobin，Mb）含有卟啉環(huán)鐵（heme-Fe）化學(xué)結(jié)構(gòu)，是心肌和骨骼肌細(xì)胞的胞漿呈色蛋白質(zhì)，也是生鮮肉和肉制品的主要呈色物質(zhì)［1-4］。它在活體內(nèi)以3 種化學(xué)態(tài)（Mb-MbO2-MetMb）的動(dòng)態(tài)平衡，維系畜肉及其肉食品的色澤穩(wěn)定和理想肉色［5-8］。因此，肌細(xì)胞內(nèi)Mb的主要生物學(xué)功能是在低氧分壓條件下，傳遞電子，攜帶和儲(chǔ)備氧氣（O2），以紅潤(rùn)的肉色展現(xiàn)良好的畜肉品質(zhì)和心肌功能［1-8］。

Mb或高鐵肌紅蛋白（metmyoglobin，MetMb）是物種進(jìn)化過程中一種高度穩(wěn)定的球狀蛋白質(zhì)，種間同源性很高［3，9-11］。隨著近年蛋白質(zhì)組學(xué)的快速發(fā)展，人們對(duì)于馬和人心肌肌紅蛋白的分子結(jié)構(gòu)和信息已有了較深入的了解［9-12］。馬心肌肌紅蛋白（hMb）作為生物標(biāo)記物，用于臨床診斷早期心肌損傷和肉質(zhì)摻假鑒別等，并取得長(zhǎng)足的進(jìn)步［3，13-14］；然而，hMb資源短缺，價(jià)格昂貴，難以進(jìn)一步拓展到肉品品質(zhì)的技術(shù)監(jiān)控。

本實(shí)驗(yàn)是在前期豬心肌高鐵肌紅蛋白（pig metmyoglobin，pMetMb）分子信息解析基礎(chǔ)上，采用光譜學(xué)手段，表征pMetMb高級(jí)動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)、功能域和晶體特征，為其作為肉品品質(zhì)監(jiān)控等研究的生物標(biāo)記物提供光譜學(xué)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

豬高鐵肌紅蛋白（pMetMb），棕紅色凍干粉，純度≥93%，分子質(zhì)量17 kD，南京師范大學(xué)金陵女子學(xué)院功能性食品實(shí)驗(yàn)室制備［15-16］。

1.2 儀器與設(shè)備

JSM-5610LV高分辨率掃描電子顯微鏡、JFC-1600濺射儀 日本電子公司；CH30RF200光學(xué)生物顯微鏡日本Olympus公司；D/max 2500VL/PC陽(yáng)極轉(zhuǎn)靶X射線衍射儀 日本理學(xué)公司；UVLABRAM HR800激光共焦顯微拉曼光譜儀 法國(guó)Jobin Yvon公司；NEXUS670傅里葉紅外光譜儀 美國(guó)Thermo Nicolet公司。

1.3 方法

1.3.1 pMetMb晶體結(jié)構(gòu)解析

于500、1 000、2 000、5 000 倍掃描電子顯微鏡下，分別觀察pMetMb凍干粉末晶體結(jié)構(gòu)的超微特征［17］。pMetMb凍干粉壓片后，直接陽(yáng)極轉(zhuǎn)靶X射線衍射（X-ray single crystal diffractometer，XRD）儀檢測(cè)和數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)。X射線（X-ray）工作條件：管壓40 kV、管流200 mA、狹縫寬度DS=SS=1°，布拉格衍射角（2θ）掃描范圍3°～85°，設(shè)定掃描速率0.12°/min和步進(jìn)間隔0.02°［18-19］。運(yùn)用XRD-PDF-2004數(shù)據(jù)庫(kù)和Jade5.0（MDI-R99100）計(jì)算軟件，對(duì)pMetMb X射線衍射峰數(shù)據(jù)進(jìn)行解析、計(jì)算和擬合，使擬合圖譜誤差R＜9%（P≥0.05），解讀其晶體高級(jí)結(jié)構(gòu)的重要化學(xué)基團(tuán)。

pMetMb晶粒直徑按Debye-Scherrer公式（1）計(jì)算［20-21］。

式中：dhkl為晶粒直徑/nm；λ為入射X射線衍射波長(zhǎng)/nm；β為衍射峰半高峰寬；θ為布拉格衍射角/（°）。

pMetMb結(jié)晶度按Debye-Scherrer公式（2）計(jì)算［21］。

1.3.2 pMetMb結(jié)構(gòu)信息的拉曼和紅外光譜指認(rèn)

用雙蒸水（ddH2O）將pMetMb稀釋至100 mg/mL，5 μL上樣量。

拉曼光譜工作條件：163型氬離子激光光源、激發(fā)線波長(zhǎng)（λ）514.15 nm、出射功率10 mW、分辨率2 cm-1，重復(fù)掃描3 次，由計(jì)算機(jī)作信號(hào)累加平均并繪圖輸出各樣品的拉曼譜圖，峰位誤差小于±3 cm-1［22-25］。

紅外光譜工作條件：KRS-5壓片法透射光譜測(cè)定法，采用DTGS型KBr探頭和4 cm-1分辨率，重復(fù)掃描32 次［26］。

運(yùn)用Microcal Origin 6.0（序列號(hào)：MA 01060）軟件，對(duì)pMetMb拉曼和紅外光譜的高級(jí)結(jié)構(gòu)解析；運(yùn)用NGSLabSpec軟件，以（1 005±1） cm-1處苯丙氨酸（Phe）特征峰強(qiáng)度為單位1，進(jìn)行歸一化處理。對(duì)于酰胺Ⅰ和Ⅲ特征區(qū)域采用兩點(diǎn)基線校正，用5點(diǎn)Savitsk-Golay函數(shù)平滑圖譜，做二階導(dǎo)數(shù)和傅里葉去卷積，手動(dòng)選定并估算各子峰的峰位和半峰寬，采用Gaussian函數(shù)進(jìn)行圖譜擬合，從而完全分辨開重疊在一起的不同譜帶，進(jìn)一步確定各子峰和不同二級(jí)結(jié)構(gòu)的對(duì)應(yīng)關(guān)系后，積分后根據(jù)峰面積計(jì)算各種二級(jí)結(jié)構(gòu)的相對(duì)比例。

2 結(jié)果與分析

2.1 pMetMb三維晶體結(jié)構(gòu)解析

2.1.1 結(jié)晶度和結(jié)晶態(tài)

由圖1可知，將pMetMb凍干粉平鋪于載玻片上，置于500～5 000 倍電子顯微鏡下掃描，可觀察到連接成片的晶狀體結(jié)構(gòu)；2 000和5 000 倍電子顯微鏡下，pMetMb呈典型的棱狀晶體，初步表明其為結(jié)晶態(tài)凍干粉。

對(duì)pMetMb凍干粉進(jìn)行陽(yáng)極轉(zhuǎn)靶X射線衍射，得到其X射線衍射峰圖譜。由圖2可知，pMetMb產(chǎn)生6 個(gè)XRD，圖形清晰陡直，X射線的信號(hào)強(qiáng)度高，無(wú)明顯干擾噪音，且基線平穩(wěn)，表明該凍干粉結(jié)晶度高、規(guī)整性好。

采用Debye-Scherrer公式（1）和公式（2）計(jì)算pMetMb晶粒直徑和結(jié)晶度，其晶粒平均直徑（dhkl）為（0.985±0.168）nm，平均結(jié)晶度達(dá)到（95.60±1.37）%（表1）。通過X射線衍射證明，pMetMb凍干粉具有極高的結(jié)晶度，可以進(jìn)一步分析它的結(jié)晶態(tài)［18-21］。

在15°～35°布拉格衍射角（2θ）范圍內(nèi)，pMetMb出現(xiàn)6 個(gè)尖銳2θ XRD，分別對(duì)應(yīng)19.196 °、20.276 °、23.501 °、25.360 °、27.442 °和31.799 °（簡(jiǎn)稱1～6），它們峰面積比值分別為2.2、4.5、2.0、1.3、8.9和81.1，并以第6 XRD信號(hào)最強(qiáng)（圖2）。將得到的6 個(gè)XRD 2θ等5 個(gè)參數(shù)輸入XRD-PDF-2004數(shù)據(jù)庫(kù)，計(jì)算pMetMb結(jié)晶態(tài)。由表2可知，3 個(gè)有機(jī)物XRD晶胞三軸長(zhǎng)均不相等，即a≠b≠c；而且其中氧化鉬銨蘋果酸水合物（ammonium molybdenum oxide malate hydrate，C8H22Mo4N4O21·H2O）含有水分子（H2O）。由此推論，pMetMb結(jié)晶態(tài)可能歸屬于含水單斜晶體結(jié)構(gòu)。

2.1.2 結(jié)構(gòu)中化學(xué)信息比對(duì)

將pMetMb X射線衍射采集到的6 個(gè)XRD信號(hào)，計(jì)算匹配化合物的品質(zhì)因子（figure of merit，F(xiàn)OM），并在數(shù)據(jù)庫(kù)中與已有高信噪比的化合物進(jìn)行比對(duì)，找到3 個(gè)有機(jī)化合物和3 個(gè)無(wú)機(jī)高匹配度化合物（表2，圖3）。

3 個(gè)高匹配度有機(jī)化合物分別對(duì)應(yīng)于對(duì)硝基苯胺（C6H6N2O2）、對(duì)氟苯氧乙酸（C8H7FO3）和氧化鉬銨蘋果酸水合物（C8H22Mo4N4O21·H2O），它們與pMetMb的FOM值為22.0、22.4和22.6，理論上它們化學(xué)結(jié)構(gòu)與pMetMb的十分接近［19-21］，因此本研究可用于解讀pMetMb化學(xué)結(jié)構(gòu)信息。

由表2、圖3a可知，該3 個(gè)有機(jī)化合物具有pMetMb化學(xué)結(jié)構(gòu)中所存在的苯環(huán)（C6H6）、甲胺基（CH3—NH—）、酰胺基（—CO—NH—）、羧甲基（—CH2COOH）和水分子（H2O）等基團(tuán)，它們的XRD信號(hào)與pMetMb有高度重疊，尤其在pMetMb第6 XRD（31.799 °）處。推測(cè)pMetMb在烷基化縮合過程中，可通過這些基團(tuán)形成肽骨架結(jié)構(gòu)，以及由咪唑基團(tuán)（C3H4N2）縮合而成卟啉環(huán)（heme）結(jié)構(gòu)［27-29］。

3 個(gè)高匹配度無(wú)機(jī)化合物可能來(lái)自KFeO2、Fe2SiV和Fe3Si，它們的FOM值分別是14.3、19.9和32.8，三者均為含鐵（Fe）化合物。它們?cè)?1.799 °處與pMetMb XRD高度重合（表2，圖3b）。由此證實(shí)pMetMb分子結(jié)構(gòu)中含有Fe配位基團(tuán)，當(dāng)與pMetMb中的heme螯合，就有可能形成了heme-Fe的電子傳遞核心結(jié)構(gòu)域［27-31］。

2.2 pMetMb二級(jí)結(jié)構(gòu)及官能團(tuán)的拉曼光譜指認(rèn)

由圖4可知，300～3 900 cm-1范圍內(nèi)得到pMetMb拉曼光譜，出峰良好，未經(jīng)平滑處理即可觀察到清晰的結(jié)構(gòu)域特征峰。

由圖4、表3可知，酰胺Ⅰ和酰胺Ⅲ的結(jié)構(gòu)域分別定位于1 640～1 690 cm-1和1 230～1 300 cm-1，前者1 654、1 666、1 682、1 662 cm-1特征峰分別歸屬α螺旋、β折疊、β轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)；后者4 種二級(jí)結(jié)構(gòu)特征峰對(duì)應(yīng)于1 267～1 281、1 238、1 304、1 247 cm-1［22-23］。二硫鍵（S—S）的結(jié)構(gòu)域（官能團(tuán)）位于507～540 cm-1，其中510 cm-1峰強(qiáng)度最大，為順式構(gòu)象，屬于天然蛋白質(zhì)的優(yōu)勢(shì)構(gòu)象；525 cm-1處還呈現(xiàn)一弱峰，為S—S反式構(gòu)象；推測(cè)pMetMb在純化過程中，S—S部分發(fā)生反轉(zhuǎn)，高級(jí)結(jié)構(gòu)出現(xiàn)微小改變［22-25］。卟啉環(huán)鐵（heme-Fe）的結(jié)構(gòu)域（Fe—C—N）出現(xiàn)在高頻區(qū)的1 354 cm-1（v4），1 463、1 559 cm-1（v3），226 cm-1（v2）。

根據(jù)拉曼光譜，pMetMb肽鏈含有酰胺Ⅰ和酰胺Ⅲ結(jié)構(gòu)域，其中包含多個(gè)α螺旋的4 種蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)；除heme-Fe（Fe—C—N）核心基團(tuán)外，其肽鏈中還包含色氨酸（Try）、酪氨酸（Trp）和苯丙氨酸（Phe）等芳香族氨基酸結(jié)構(gòu)域，和順式/反式S—S及C—H等鍵合結(jié)構(gòu)。

2.3 pMetMb高級(jí)結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)信息的紅外光譜指認(rèn)

對(duì)pMetMb水溶液進(jìn)行傅里葉紅外光譜掃描，在500～4 000 cm-1范圍內(nèi)進(jìn)一步解讀它的動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)信息，以補(bǔ)充對(duì)pMetMb高級(jí)結(jié)構(gòu)信息的認(rèn)識(shí)。研究觀察到，600～1 700 cm-1和2 900～3 500 cm-1是pMetMb特征峰的主要區(qū)域，且與拉曼光譜相互映證。

由圖5、表4可知，解析出3 個(gè)酰胺結(jié)構(gòu)域，即1 564～1 703 cm-1的酰胺Ⅰ，形成了以C=O和C=C等伸縮振動(dòng)為主的α螺旋肽骨架結(jié)構(gòu)紅外光譜吸收峰，這些主要來(lái)自肽鏈中谷氨酰胺（Gln）、谷氨酸（Glu）、組氨酸（His）、賴氨酸（Lys）、Trp和天冬氨酸（Asp）等氨基酸的鍵合行為；酰胺Ⅱ位于1 386～1 525 cm-1，跨度較大，呈現(xiàn)多種光譜振動(dòng)形式，有C=C、C—N、—COO-反式彎曲振動(dòng)和C—N、C—H、N—H伸縮振動(dòng)等，它們來(lái)自肽鏈中Lys、Tyr、Trp、脯氨酸（Pro）和His等；1 198～1 274 cm-1區(qū)域的酰胺Ⅲ的紅外光譜具有單酰胺模型特征，呈現(xiàn)β折疊二級(jí)結(jié)構(gòu)的振動(dòng)光譜，產(chǎn)生了源于Trp、Tyr和His等氨基酸的合并N—H彎曲和C—N伸縮振動(dòng)，并伴隨C=O平面內(nèi)彎曲和C=C伸縮振動(dòng)。從而表明pMetMb分子結(jié)構(gòu)至少含有3 個(gè)酰胺結(jié)構(gòu)域，通過C=O、C=C伸縮振動(dòng)或C=C、C—N反式彎曲振動(dòng)等，從動(dòng)態(tài)紅外光譜信息也證實(shí)其肽骨架具有了α螺旋和β折疊的二級(jí)結(jié)構(gòu)和化學(xué)鍵的氨基酸來(lái)源［26］。

運(yùn)用Microcal Origin 6.0軟件，進(jìn)一步對(duì)pMetMb的1 600～1 700 cm-1酰胺Ⅰ和1 200～1 300 cm-1酰胺Ⅲ特征區(qū)紅外光譜進(jìn)行高斯積分和精確定位，計(jì)算其峰面積和半峰寬。結(jié)果顯示，酰胺Ⅰ的1 616、1 631 cm-1，1 640、1 651 cm-1，1 659、1 668～1 690 cm-1等依次對(duì)應(yīng)為β折疊、無(wú)規(guī)卷曲、α螺旋和β轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)，其中1 659 cm-1是α螺旋紅外光譜振動(dòng)區(qū)；酰胺Ⅲ中的1 219、1 263 cm-1，1 280、1 284 cm-1，1 293、1 299 cm-1，1 307、1 327 cm-1處積分，分別指認(rèn)為β折疊、無(wú)規(guī)卷曲、β轉(zhuǎn)角和α螺旋結(jié)構(gòu)，α螺旋位于1 307、1 327 cm-1振動(dòng)區(qū)（圖6）。

經(jīng)NGSLabSpec軟件計(jì)算和解讀（表5），pMetMb 4 種二級(jí)結(jié)構(gòu)中，α螺旋、β折疊、β轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲的比例分別占二級(jí)結(jié)構(gòu)的50%、14%、24%和12%，因此pMetMb具有α螺旋為主型的球蛋白結(jié)構(gòu)；二級(jí)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差（standard deviation，SD）分析（SD＜0.03）表明，拉曼和紅外光譜對(duì)pMetMb二級(jí)結(jié)構(gòu)的指認(rèn)和比例分析的可信度高。

3 結(jié) 論

掃描電子顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，pMetMb凍干粉呈現(xiàn)明顯的棱狀結(jié)晶體。經(jīng)X射線衍射和胞晶計(jì)算，它的晶胞三軸長(zhǎng)不相等（a≠b≠c）且含有結(jié)晶水，可歸屬于單斜晶體結(jié)構(gòu)；由于dhkl為（0.985±0.168）nm，結(jié)晶度達(dá)到（95.60±1.37）%。根據(jù)它的布拉格衍射角（2θ）等參數(shù)計(jì)算，將它6 個(gè)XRD與晶體數(shù)據(jù)庫(kù)同類化合物比對(duì)，pMetMb肽鏈和heme-Fe等關(guān)鍵基團(tuán)來(lái)源均得到映證。

對(duì)pMetMb高級(jí)結(jié)構(gòu)的拉曼和紅外光譜解析，它肽鏈兼有α螺旋、β折疊、β轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲4 種蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)，分別占50%、14%、24%和12%，歸屬于α螺旋為主型球蛋白。它的結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)信息還顯示，其具有3 個(gè)酰胺區(qū)域，即酰胺Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ；其C=O、C=C、C—N、—COO-、C—H、N—H的不同振動(dòng)形式，產(chǎn)生了不同的二級(jí)結(jié)構(gòu)；由于它核心區(qū)域heme-Fe以Fe—C—N六配位低自旋，從而呈現(xiàn)MetMb構(gòu)象。

綜上所述，本研究的pMetMb球狀結(jié)構(gòu)緊密，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，可以作為生物標(biāo)記物用于肉品品質(zhì)等研究。

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Spectral Assignment of Dynamic Structure Information of Porcine Myocardial Metmyoglobin （pMetMb）

LI Yadong1， WU Mingcao1， TANG Yu1， JIN Bangquan1，*， HUANG Heyong2， LI Gang2， FENG Yuying2
（1. Ginling College， Nanjing Normal University， Nanjing 210097， China；2. Center of Analysis and Testing， Nanjing Normal University， Nanjing 210097， China）

The dynamic molecular structures and domains of porcine myocardial metmyoglobin （pMetMb） were studied and analyzed by scanning electron microscopy， X-ray diffraction， Raman and Infrared spectroscopy with matched databases and softwares. Obviously prismatic crystalline structures were observed on the surface of lyophilized pMetMb powder. The crystallinity of pMetMb was （95.60 ± 1.37）%， and it was highly crystalline and monoclinic powder because the lengths of its three-dimensional unit cell were inequality （a ≠ b ≠ c）. By comparison with crystal databases the source of heme-Fe domain in pMetMb was identified. The Raman and Infrared spectra proved that the peptide chain of pMetMb contained 50% α-helix，14% β-fold， 24% β-turn and 12% random coil， which came from the different shake forms C=O， C=C， C-N， -COO-，C-H and N-H in the amide I， II and III regions. The heme-Fe domain in pMetMb formed by imidazole group （C3H4N2）binding with Fe3+. So it belonged to globin with compact structure and stable properties.

monoclinic crystal； structural domain； dynamic structural information； spectral characteristics； porcine myocardial metmyoglobin （pMetMb）

10.7506/spkx1002-6630-201609021

TS251

A

1002-6630（2016）09-0111-06

李亞東， 吳名草， 湯宇， 等. 豬心肌高鐵肌紅蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)信息的光譜指認(rèn)［J］. 食品科學(xué)， 2016， 37（9）： 111-116. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201609021. http：//www.spkx.net.cn

LI Yadong， WU Mingcao， TANG Yu， et al. Spectral assignment of dynamic structure information of porcine myocardial metmyoglobin （pMetMb）［J］. Food Science， 2016， 37（9）： 111-116. （in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/ spkx1002-6630-201609021. http：//www.spkx.net.cn

2015-07-12

江蘇省六大人才高峰項(xiàng)目（184080H10202）；江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金項(xiàng)目（CX（11）1301）

李亞東（1989—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)槿馄房茖W(xué)。E-mail：ns_liyadong@163.com

*通信作者：金邦荃（1956—），女，教授，博士，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)。E-mail：jinbangquan@njnu.edu.cn