畢 爽，馬文君，李 楊，齊寶坤，王中江，江連洲*

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

脈沖電場(chǎng)-超聲波作用對(duì)黑豆球蛋白功能性質(zhì)的影響

畢 爽，馬文君，李 楊，齊寶坤，王中江，江連洲*

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

研究了脈沖電場(chǎng)（15 kV/cm）與低頻高強(qiáng)度超聲波（150、300、450 W）在不同的時(shí)間條件下（18、36 min）的協(xié)同作用對(duì)黑豆球蛋白功能性質(zhì)的影響。結(jié)果表明：不同脈沖電場(chǎng)-超聲波條件處理的黑豆球蛋白具有不同的性質(zhì)，當(dāng)處理?xiàng)l件為脈沖電場(chǎng)強(qiáng)度15 kV/cm、超聲波時(shí)間36 min、超聲波功率300 W時(shí)，黑豆分離蛋白具有最高的持水性（75.69%）和凝膠硬度（45.126 g）。同時(shí)，溶解度也有所提升。在熱誘導(dǎo)凝膠流變實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)超聲波處理（36 min，300 W）的黑豆分離蛋白4號(hào)樣品最終形成的凝膠彈性模量最高；在頻率掃描流變學(xué)實(shí)驗(yàn)中，該條件下形成的凝膠具有一種類似于固體的凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；掃描電子顯微鏡的結(jié)果顯示此條件下形成的黑豆蛋白凝膠更加規(guī)則。

黑豆球蛋白；脈沖電場(chǎng)-超聲波；凝膠性質(zhì)；流變學(xué)性質(zhì)；持水性

我國(guó)黑豆資源豐富，分布很廣，全國(guó)各地都有種植和生產(chǎn)［1］。黑豆是植物中營(yíng)養(yǎng)最豐富的保健佳品。據(jù)研究統(tǒng)計(jì)，黑豆含粗蛋白質(zhì)34%，比人們常食的肉類還要高。黑豆中氨基酸種類豐富，且黑豆蛋白質(zhì)的氨基酸組成與動(dòng)物蛋白類似，必需氨基酸含量占氨基酸總量的40%以上［2］。其中生物活性物質(zhì)含量高，兼具營(yíng)養(yǎng)價(jià)值與藥用價(jià)值［3］。

在脈沖電場(chǎng)作用下，水分子配位能力增大，同時(shí)，當(dāng)脈沖電場(chǎng)作用于蛋白質(zhì)時(shí)，蛋白質(zhì)表面的離子會(huì)受到電場(chǎng)作用力，其方向與大小均隨時(shí)間變化而改變，對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生影響。超聲波既是一種波動(dòng)形式，又是一種能量形式，在傳播過(guò)程中與媒介相互作用產(chǎn)生超聲效應(yīng)［4］。超聲波與蛋白質(zhì)相互作用可分為機(jī)械作用、空化作用和熱作用。超聲波能夠提高蛋白質(zhì)的溶解性。

本實(shí)驗(yàn)在傳統(tǒng)黑豆球蛋白加工基礎(chǔ)上先采用脈沖電場(chǎng)處理，再采用超聲波處理黑豆球蛋白。研究脈沖電場(chǎng)（強(qiáng)度15 kV/cm）協(xié)同不同超聲波（150、300、450 W）以及不同的時(shí)間（18、36 min）處理?xiàng)l件，對(duì)黑豆球蛋白的功能性質(zhì)和結(jié)構(gòu)性質(zhì)的影響，得到最好的脈沖電場(chǎng)-超聲波處理?xiàng)l件，以期為黑豆球蛋白及其開(kāi)發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑豆，由北大荒綠野食品有限公司提供。

Lowry法蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒 上海荔達(dá)生物科技有限公司；鹽酸、氫氧化鈉、葡萄糖酸內(nèi)酯（gluconoδ-lactone，GDL）、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、正己烷等試劑 北京新光化工試劑廠；所有試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 儀器與設(shè)備

pHS-25型酸度計(jì) 上海偉業(yè)儀器廠；電子分析天平 梅勒特-托利多儀器（上海）有限公司；低速離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；精密電動(dòng)攪拌機(jī) 江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；電熱恒溫水浴鍋 余姚市東方電工儀器廠；錘片式粉碎機(jī) 中國(guó)天津泰斯特儀器有限公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；超聲波儀 寧波新芝生物科技股份有限公司；分光光度計(jì) 尤尼柯中國(guó)（上海）公司；流變儀英國(guó)馬爾文儀器公司；掃描電子顯微鏡 日立高新技術(shù)公司；脈沖電場(chǎng)-超聲波處理器（具有超聲波發(fā)生器、脈沖電場(chǎng)發(fā)生器，待處理溶液裝入圓形柱不銹鋼容器。脈沖電場(chǎng)發(fā)生器外表面涂有聚四氟乙烯層作為絕緣層以保證安全） 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院自制。

1.3 方法

1.3.1 黑豆蛋白的制備

1.3.1.1 脫脂黑豆粉的制備

工藝流程：黑豆清理→粉碎→過(guò)篩→脫脂。

具體操作為：選取新鮮干凈的黑豆置于托盤中，放入55 ℃的烘干機(jī)中烘干12 h，烘干后去皮、磨粉并過(guò)60 目篩，所得的黑豆粉與正己烷以料液比1∶3（m/V）混合，在室溫下攪拌3 h。將所得混合物在4 ℃、10 000×g的條件下離心20 min，棄去上層油脂，再重復(fù)離心過(guò)程3 次，室溫條件下風(fēng)干備用。

1.3.1.2 黑豆蛋白的提取

工藝流程：脫脂黑豆粉→加堿液調(diào)pH值至8.0→離心分離→取上清液→加酸液調(diào)pH值至4.0→離心分離→取沉淀→反復(fù)水洗和離心→黑豆蛋白。

具體操作參考O'donnell等［5］的方法。將脫脂黑豆粉按1∶10（m/V）與蒸餾水混合，然后用2 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)溶液的pH值至8.0，在50 ℃攪拌l.5 h后，將其懸浮液在4 ℃、10 000×g的條件下離心20 min，取離心后所得的上清液再用2 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH值至4.0。靜置后在4 ℃、6 000×g的條件下離心20 min，將離心所得的黑豆蛋白沉淀水洗2 次，最后將沉淀分散于水中并用2 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.0。將此時(shí)得到的黑豆蛋白溶液置于-40 ℃的冰箱中預(yù)凍48 h，然后進(jìn)行冷凍干燥，蛋白溶液冷凍干燥后粉碎即得粉末狀黑豆分離蛋白。黑豆分離蛋白于4 ℃冰箱保存。

1.3.2 脈沖電場(chǎng)-超聲波處理黑豆球蛋白樣品

脈沖電場(chǎng)參數(shù)：場(chǎng)強(qiáng)為 15 kV/cm，波形為衰減波，頻率1.02 Hz，脈寬1.4 μs。超聲波處理參數(shù)：頻率 20 kHz，功率0～450 W，連續(xù)可調(diào)；脈沖電場(chǎng)-超聲波處理?xiàng)l件如表1所示。超聲波在5 ℃條件下進(jìn)行，將裝有樣品的燒杯置于冰水浴中，每5 min更換一次冰水，以維持低溫。

1.3.3 溶解性的測(cè)定

精確稱取10 mg左右樣品，溶解于10 mL的去離子水中，室溫下磁力攪拌溶解1 h，3 000 r/min離心15 min，上清液經(jīng)適度稀釋，采用Lowry法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)物繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。蛋白質(zhì)的溶解度表示為上清液蛋白質(zhì)量濃度占總蛋白質(zhì)量濃度的百分比［6］。

1.3.4 流變學(xué)性質(zhì)測(cè)定

1.3.4.1 溫度掃描

將黑豆球蛋白溶于50 mmol/L的磷酸鹽緩沖溶液中（100 mg/mL），用磁力攪拌儀均勻攪拌1 h，然后將蛋白溶液加于流變儀底部的平板上，平板直徑：40 mm，探頭型號(hào)：pp20 mm。設(shè)定上下探測(cè)平行板之間的距離為1 mm，當(dāng)平板間完全充滿蛋白溶液時(shí)，擦去多余的液體，并且將兩板四周用注射器滴加石蠟油，以防止樣品的水分蒸發(fā)。參數(shù)設(shè)定：起始溫度25 ℃，以5 ℃/min的速率升溫至90 ℃，保持90 ℃ 30 min，再以5 ℃/min的速率降溫至25 ℃，整個(gè)過(guò)程中，保持角頻率在0.63 rad/s，固定形變0.0［7］。在整個(gè)加熱及冷卻過(guò)程中，都記錄下彈性模量G'以及損耗模量G''及其他參數(shù)數(shù)值的變化。

1.3.4.2 頻率掃描

將溫度掃描形成的凝膠（加熱-冷卻循環(huán)之后）于25 ℃的條件下，對(duì)凝膠進(jìn)行頻率掃描（0.1～10.0 Hz），固定形變?yōu)?.01。

1.3.5 酸誘導(dǎo)黑豆球蛋白凝膠的形成

工藝流程：黑豆球蛋白→溶解→加GDL→加熱→冷藏→陳化→凝膠。

將黑豆蛋白用50 mmol/L的磷酸鹽緩沖溶液溶解后混勻，分散液質(zhì)量濃度100 mg/mL，然后加入GDL（0.3 g/100 mL）輕輕攪拌2 min，將分散液在90 ℃的條件下加熱20 min，然后冷卻至室溫形成酸誘導(dǎo)黑豆蛋白凝膠，將其在4 ℃的條件下冷藏24 h以完全形成凝膠。隨后取出陳化30 min，測(cè)定其持水性、質(zhì)構(gòu)性質(zhì)。

1.3.6 持水性的測(cè)定

黑豆球蛋白凝膠的持水性測(cè)定根據(jù)Tang Chuanhe等［8］的方法，且稍做改動(dòng)。將凝膠樣品放在5 mL的離心管中，使用離心機(jī)在室溫、800 r/min的條件下離心20 min，將試管倒轉(zhuǎn)，甩去多余的水分仔細(xì)用紙移出，分別將離心前與離心后移出多余水分的試管稱質(zhì)量，持水性（water holding capacity，WHC）的計(jì)算公式如下。

式中：m1為樣品離心前與離心管的質(zhì)量/g；m2為樣品離心除水后與離心管的質(zhì)量/g。

1.3.7 凝膠質(zhì)構(gòu)特性的測(cè)定

采用穿刺模式對(duì)凝膠進(jìn)行測(cè)定。將黑豆球蛋白分散液在燒杯中形成凝膠（直徑為40 mm，高35 mm，每個(gè)燒杯內(nèi)盛裝10 g凝膠）。使用TA-XT2質(zhì)構(gòu)儀進(jìn)行測(cè)定，采用P/0.5的探頭。測(cè)定時(shí)，直接使用凝膠形成時(shí)所用的燒杯，不需要將它們從燒杯中移出再進(jìn)行測(cè)定。探頭下行速率為1 mm/s，進(jìn)入凝膠檢測(cè)過(guò)程中的速率為1 mm/s，檢測(cè)時(shí)的觸發(fā)力為7 g，壓縮變形為樣品高度的30%，測(cè)定溫度為室溫，每個(gè)樣品重復(fù)3 次測(cè)定，取其平均值作為最終結(jié)果，且同一樣品測(cè)定的3 個(gè)凝膠破裂強(qiáng)度值和質(zhì)構(gòu)其他方面性質(zhì)數(shù)值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）小于2.50%。

1.3.8 掃描電子顯微鏡觀察

將黑豆蛋白用0.05 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液溶解后混勻，分散液質(zhì)量濃度為100 mg/mL。脈沖電場(chǎng)-超聲波處理后，將分散液在90 ℃條件下加熱20 min，然后冷卻至室溫形成黑豆蛋白凝膠，將其在4 ℃的條件下冷藏24 h以完全形成凝膠。進(jìn)行樣品前處理，將制好的凝膠切成塊狀，浸泡在固定劑溶液中（戊二醛溶液）固定24 h。然后用pH值為7.2的磷酸鹽緩沖液清洗3 次，每次10 min。用不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液依次洗脫，選擇表面較為平整的凝膠塊切成小片狀，用冷凍干燥機(jī)進(jìn)行干燥。干燥后的凝膠脆斷處理、鍍金。鍍金方法：離子濺射；鍍金條件：15 kV、15 mA、2.5 min。最后將樣品置于掃描電子顯微鏡（15 kV）下觀察其顯微結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 溶解度

溶解度是衡量蛋白質(zhì)變性和聚集的一種實(shí)用方法，同時(shí)也能夠反映蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)。由圖1可知，未經(jīng)脈沖電場(chǎng)-超聲波處理的黑豆球蛋白具有良好的溶解度，經(jīng)超聲波處理后溶解度普遍減小，但隨著超聲波強(qiáng)度的增加，黑豆蛋白的溶解性先增加后降低，這與Jambrak等［9］提出的理論是一致的。這是由于超聲波導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子部分打開(kāi)增加了蛋白質(zhì)和水分子之間的交互作用，且因?yàn)槌暡ǖ目栈饔靡约懊}沖電場(chǎng)對(duì)蛋白表面電荷性質(zhì)增強(qiáng)的作用，使蛋白質(zhì)的溶解性提高［10］。另一種可能的原因是，超聲波處理還可以降低黑豆蛋白的粒徑，從而增加了黑豆蛋白的溶解性［11］。但當(dāng)超聲波強(qiáng)度達(dá)到450 W時(shí)，黑豆蛋白溶液的溶解性下降，可能是由于超聲波處理功率的增加和超聲波處理時(shí)間的延長(zhǎng)，黑豆蛋白疏水基團(tuán)暴露而巰基被掩埋在分子內(nèi)部，通過(guò)非共價(jià)鍵形成了蛋白質(zhì)聚集體，從而降低了黑豆蛋白的溶解度。

2.2 流變學(xué)性質(zhì)

2.2.1 溫度掃描

圖2為黑豆蛋白分散液的彈性模量（G'）在加熱及冷卻過(guò)程中隨時(shí)間變化的流變圖。儲(chǔ)能模量是凝膠在形變過(guò)程中由于彈性形變而儲(chǔ)存的能量，它是衡量凝膠強(qiáng)度的一種尺度，而損耗模量（G''）反映的是凝膠在形變過(guò)程中因黏性形變而以熱的形式損耗的能量，這些能量是由于分子間的摩擦產(chǎn)生的，它反映樣品的黏性［12］。

如圖2所示，隨著超聲波條件的變化，黑豆蛋白溶液表現(xiàn)出不同的流變學(xué)性質(zhì)。所有黑豆蛋白樣品，在升溫過(guò)程中（25～90 ℃）的G'變化很小或幾乎不變。此時(shí)，黑豆蛋白分子發(fā)生解離和變性，分子部分展開(kāi)，功能基團(tuán)暴露，功能性質(zhì)發(fā)生一定的改變。但還不會(huì)形成凝膠，因此G'沒(méi)有增加。在90 ℃保溫后期G'開(kāi)始有增加的趨勢(shì)，但趨勢(shì)不明顯，這是由于蛋白質(zhì)分子正在經(jīng)歷前凝膠階段，分散液中的黑豆蛋白分子空間結(jié)構(gòu)在升溫及保溫的過(guò)程中逐漸打開(kāi)，并發(fā)生了一定的相互作用［13］。剛開(kāi)始冷卻時(shí)，可以觀察到分散液的彈性模量突然下降，馬上又出現(xiàn)上升的趨勢(shì)，這是由于溶液中相鄰的蛋白質(zhì)分子通過(guò)氫鍵、疏水相互作用、靜電吸引、二硫鍵等化學(xué)作用力結(jié)合到一起形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，將水以及溶液中其他物質(zhì)包容起來(lái)，形成凝膠。彈性模量開(kāi)始上升的點(diǎn)是凝膠形成的開(kāi)始點(diǎn)，因?yàn)樗袠悠罚?～6號(hào)）都在相同的條件下被加熱，因此這個(gè)點(diǎn)可以用來(lái)比較各種樣品的凝膠能力［14］。隨著降溫過(guò)程（90～25 ℃）的延長(zhǎng)，分散液的彈性模量顯著遞增，說(shuō)明蛋白質(zhì)分子充分展開(kāi)，凝膠形成［15］。

對(duì)比降溫結(jié)束時(shí)各個(gè)樣品的彈性模量可以發(fā)現(xiàn)，4號(hào)樣品與0號(hào)樣品形成凝膠的過(guò)程最相似。但經(jīng)過(guò)脈沖電場(chǎng)-中等超聲強(qiáng)度處理的4號(hào)樣品凝膠強(qiáng)度大于未經(jīng)脈沖電場(chǎng)-超聲波處理的0號(hào)樣品。這說(shuō)明適當(dāng)?shù)拿}沖電場(chǎng)-超聲波處理?xiàng)l件（超聲波頻率20 kHz、超聲波時(shí)間36 min、超聲波功率300 W）有助于提高黑豆球蛋白分散液的凝膠能力。因?yàn)槌暡ň哂锌栈案邏簺_擊波作用，使蛋白質(zhì)分子鏈選擇性地打開(kāi)，蛋白質(zhì)得二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，凝膠能力增強(qiáng)［16］。但當(dāng)脈沖電場(chǎng)協(xié)同低強(qiáng)度超聲波時(shí)，空化作用不明顯，不足以使樣品形成較高彈性模量。當(dāng)脈沖電場(chǎng)協(xié)同高強(qiáng)度超聲波時(shí)，因?yàn)楹诙沟鞍椎娜芙庑缘?，因此G'降低。

2.2.2 頻率掃描

如圖3所示，4號(hào)樣品的G'和G''不隨頻率變化，且互相平行。這說(shuō)明它們不受頻率大小的影響，樣品具有較好的穩(wěn)定性［17］。同時(shí)，4號(hào)樣品的G'和G''較高，且兩者間的間距也較大，G'比G''高出一個(gè)數(shù)量級(jí)，這說(shuō)明其凝膠彈性很好，“固體”性質(zhì)相對(duì)明顯，該凝膠具有一種類似于固體的凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，可能是由于脈沖電場(chǎng)-超聲波作用使黑豆球蛋白溶液中聚集體粒度降低，黑豆蛋白溶解性提高，脈沖電場(chǎng)-超聲波作用的促溶機(jī)制提高了黑豆蛋白溶液的流變學(xué)性質(zhì)。1號(hào)樣品的G'和G''較小，說(shuō)明其凝膠彈性部分所占比例較小，“固體”性質(zhì)不明顯。樣品所形成的凝膠G'和G''對(duì)頻率有一定的相關(guān)依賴性，即隨著頻率的增加，剪切模量（G'、G''）會(huì)隨之呈上升的趨勢(shì)，說(shuō)明此黑豆球蛋白在相對(duì)較高振蕩頻率下，才具有凝膠特性［18］。其他的樣品的彈性模量值同1號(hào)樣品相似，這也與質(zhì)構(gòu)的測(cè)量結(jié)果相吻合。

2.3 質(zhì)構(gòu)特性

質(zhì)構(gòu)特性是品評(píng)食品優(yōu)劣程度的重要因素之一，因?yàn)槠渲苯佑绊懙绞澄镌诳谥薪o人的感覺(jué)［19］。采用TA-XT2質(zhì)構(gòu)儀模擬口腔的咀嚼運(yùn)動(dòng)，對(duì)樣品進(jìn)行兩次壓縮，給出力-時(shí)間的關(guān)系曲線，通過(guò)計(jì)算機(jī)處理分析給出質(zhì)構(gòu)特性的各個(gè)參數(shù)如表2所示。

脈沖電場(chǎng)-超聲波處理時(shí)間對(duì)凝膠破裂強(qiáng)度 的影響非常明顯。由表2可知，超聲波處理18 min的1、3、5號(hào)樣品的硬度值分別為26.383、38.050、29.909 g，而經(jīng)過(guò)36 min超聲處理的2、4、6號(hào)樣品，它們的凝膠硬度值分別30.681、45.126、27.495 g，可見(jiàn)每組樣品當(dāng)超聲波處理功率相同時(shí)，延長(zhǎng)超聲波處理的時(shí)間可升高凝膠的硬度值，因?yàn)槟z的過(guò)程是緩慢過(guò)程，超聲波處理時(shí)間延長(zhǎng)即空化作用時(shí)間延長(zhǎng)，蛋白質(zhì)分子鏈充分打開(kāi)，形成了凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。但是5號(hào)樣品的硬度大于6號(hào)樣品，這是由于脈沖電場(chǎng)-超聲波處理功率過(guò)大導(dǎo)致黑豆球蛋白的分子結(jié)構(gòu)發(fā)生了不可逆性變化變化，繼續(xù)延長(zhǎng)超聲波處理時(shí)間，易形成不溶性蛋白質(zhì)聚集體［20］，進(jìn)而影響凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的形成構(gòu)建。

如表2所示，1、3、5號(hào)樣品的超聲波時(shí)間相同，超聲波功率依次增大，形成凝膠的硬度、內(nèi)聚性及回復(fù)性等質(zhì)構(gòu)特性在300 W（3號(hào)）超聲波功率時(shí)最佳，由于5號(hào)樣品超聲波功率過(guò)高，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子發(fā)生變性，使其性質(zhì)隨之下降。同比其他樣品，4號(hào)樣品表現(xiàn)出最好的凝膠性質(zhì)，凝膠強(qiáng)度與蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)緊密相關(guān)，說(shuō)明該脈沖電場(chǎng)-超聲波處理?xiàng)l件可以顯著降低蛋白質(zhì)的粒度、加速蛋白質(zhì)變性、提高蛋白的溶解性使蛋白質(zhì)形成致密的空間結(jié)構(gòu)［21］。

2.4 持水性

持水性是最重要的凝膠特性之一，在不同的食物體系中都會(huì)發(fā)生這種具有意義的蛋白質(zhì)與水之間的反應(yīng)。不同凝膠樣品的持水性情況如圖4所示，4號(hào)黑豆蛋白凝膠樣品的持水性最強(qiáng)，而1號(hào)的持水性最弱。由此可說(shuō)明，超聲波時(shí)間36 min、超聲波功率300 W，可以顯著提高蛋白凝膠的持水性。這可能是因?yàn)槊}沖電場(chǎng)-超聲波處理增加了蛋白質(zhì)的溶解性，同時(shí)減小了黑豆分離蛋白的粒徑，使蛋白凝膠形成了密集且均一的凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)［22］。這種密集且均一的微觀結(jié)構(gòu)有助于凝膠結(jié)合水分。Wei Wu等［23］曾有結(jié)論表明，提高蛋白質(zhì)的溶解性、減少分離蛋白的粒徑大小可以提高凝膠的持水性。另一個(gè)可能的原因是：隨著超聲波強(qiáng)度增加，蛋白質(zhì)疏水基團(tuán)暴露更多。曾有研究發(fā)現(xiàn)凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)具有重要作用的是疏水基團(tuán)的暴露［24］。蛋白質(zhì)分子的疏水基團(tuán)暴露從而形成的聚集體是形成蛋白質(zhì)凝膠的主導(dǎo)因素，超聲波對(duì)于疏水基團(tuán)的作用可能是在處理過(guò)程中加速了蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)聚集體的產(chǎn)生，因此最終形成的凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)具有良好的持水性［25］。但是高強(qiáng)度的超聲波處理（超聲波總時(shí)間36 min，超聲波功率450 W）會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)發(fā)生不可逆性改變，降低其凝膠持水性［18］。

2.5 掃描電子顯微鏡觀察結(jié)果

經(jīng)過(guò)脈沖電場(chǎng)-超聲波處理的黑豆分離蛋白形成凝膠后，在掃描電子顯微鏡下放大1 000 倍的微觀結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖5。未經(jīng)超聲波處理的天然蛋白凝膠結(jié)構(gòu)不均勻，表面不平整且出現(xiàn)一些細(xì)小的孔洞。經(jīng)過(guò)脈沖電場(chǎng)協(xié)同中強(qiáng)度超聲波處理的凝膠空間結(jié)構(gòu)與未處理樣品有顯著差異，凝膠結(jié)構(gòu)更為致密、均一，表面平整，呈現(xiàn)出層狀結(jié)構(gòu)。而經(jīng)過(guò)高強(qiáng)度、長(zhǎng)時(shí)間超聲波處理的凝膠空間結(jié)構(gòu)表面不均一且出現(xiàn)較大的空洞。原因可能是適宜強(qiáng)度的超聲波處理可以加速黑豆蛋白凝膠聚集體的形成，與Zuniga等［26］結(jié)果一致。黑豆蛋白空間結(jié)構(gòu)展開(kāi)，功能基團(tuán)（如疏水基團(tuán)）暴露，立即彼此發(fā)生相互作用從而形成蛋白質(zhì)聚集體，呈現(xiàn)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。已有研究［16］表明，凝膠性和聚集體是有緊密聯(lián)系的，熱誘導(dǎo)形成的聚集體越多，凝膠性質(zhì)越強(qiáng)。也可能是因?yàn)槌曁幚頊p少了蛋白質(zhì)的粒度，因?yàn)槟z結(jié)構(gòu)與蛋白質(zhì)的大小和形狀有關(guān)。粒度小，在凝膠過(guò)程中就會(huì)形成小聚合物，可以更好地填充在蛋白質(zhì)的凝膠網(wǎng)絡(luò)空間內(nèi)，使凝膠的空間結(jié)構(gòu)更加致密、均一。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)采用不同的脈沖電場(chǎng)-超聲波條件，對(duì)黑豆球蛋白進(jìn)行處理。經(jīng)過(guò)特定的處理?xiàng)l件（脈沖電場(chǎng)強(qiáng)度15 kV/cm、超聲波時(shí)間36 min、超聲波功率300 W）可以顯著提高黑豆球蛋白的溶解性、凝膠性、持水性和凝膠強(qiáng)度。從熱凝膠過(guò)程來(lái)看，經(jīng)過(guò)此處理?xiàng)l件的黑豆蛋白分散液更易形成凝膠，而且所得的凝膠動(dòng)態(tài)黏彈性也高于其他脈沖電場(chǎng)-超聲波處理以及未經(jīng)超聲波處理的情況。因此，脈沖電場(chǎng)協(xié)同中等強(qiáng)度（300 W）的超聲波處理可顯著提高黑豆蛋白的功能性質(zhì)，但協(xié)同低強(qiáng)度（150 W）超聲波和高強(qiáng)度（450 W）超聲波會(huì)降低黑豆蛋白的功能性質(zhì)。此結(jié)果為黑豆球蛋白在食品工業(yè)中的應(yīng)用提供了一定的借鑒意義。

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Combined Effect of Pulse Electric Field and Ultrasound on Functional Properties of Black Soybean Globin

BI Shuang， MA Wenjun， LI Yang， QI Baokun， WANG Zhongjiang， JIANG Lianzhou*
（College of Food Science， Northeast Agricultural University， Harbin 150030， China）

The effect of combined pulsed electric field （15 kV/cm） and low-frequency ultrasound （150， 300 or 450 W）treatments for different time periods on functional properties of black soybean globin was addressed in this study. Functional properties of black soybean globin varied among different treatments. The highest water-holding capacity （75.69%） and gel strength （45.126 g） were obtained when black soybean globin was treated with pulsed electric field at 15 kV/cm in combination with ultrasound irradiation at 300 W for 36 min. Moreover， its solubility also increased after the combined treatment， and its elastic modulus was the highest as indicated by rheological test. Frequency sweep rheological experiments revealed that a solid-like gel network was formed from black soybean globin under the above treatment conditions. The microstructure of the gel was more regular under scanning electron microscopy （SEM）.

black soybean globin； combined ultrasound-pulse electric field treatment； gel properties； rheological properties；water-holding capacity

10.7506/spkx1002-6630-201609002

TS214.9

A

1002-6630（2016）09-0007-06

畢爽， 馬文君， 李楊， 等. 脈沖電場(chǎng)-超聲波作用對(duì)黑豆球蛋白功能性質(zhì)的影響［J］. 食品科學(xué)， 2016， 37（9）： 7-12. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201609002. http：//www.spkx.net.cn

BI Shuang， MA Wenjun， LI Yang， et al. Combined effect of pulse electric field and ultrasound on functional properties of black soybean globin［J］. Food Science， 2016， 37（9）： 7-12. （in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/spkx1002-6630-201609002. http：//www.spkx.net.cn

2015-05-05

國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31301501）；“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2014BAD22B00）；黑龍江博士后科研啟動(dòng)基金項(xiàng)目（LBH-Q13018）；黑龍江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目重點(diǎn)項(xiàng)目（ZD201302）；高等學(xué)校博士生學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金博導(dǎo)類資助課題（20132325110013）

畢爽（1992—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)榧Z食、油脂及植物蛋白工程。E-mail：13163436989@163.com

*通信作者：江連洲（1960—），男，教授，博士，研究方向?yàn)榧Z食、油脂及植物蛋白工程。E-mail：jlzname@yeah.net