歐陽(yáng)文，朱曉艾，蘇 磊，陳雪香，葉淑敏，曹 庸,

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410208；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東 廣州 510642）

番石榴葉中廣寄生苷和番石榴苷的降糖作用

歐陽(yáng)文1，朱曉艾2，蘇 磊1，陳雪香2，葉淑敏1，曹 庸2,*

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410208；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東 廣州 510642）

目的：研究番石榴葉、廣寄生苷和番石榴苷的降糖活性和相關(guān)性。方法：采用反相高效液相色譜法測(cè)定不同月份番石榴葉中番石榴苷和廣寄生苷的含量；建立降糖脂肪細(xì)胞模型，測(cè)定不同季節(jié)番石榴葉提取物的降糖活性；給藥干預(yù)后，測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液中游離脂肪酸的含量，采用Western blotting法測(cè)定脂肪細(xì)胞膜葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4（glucose transporter 4，GLUT4）表達(dá)。結(jié)果：6ü9月份番石榴葉中番石榴苷和廣寄生苷的含量較高，同時(shí)6ü9月份番石榴葉的降糖活性也最好，降糖活性與化合物含量存在正相關(guān)性。番石榴葉提取物、番石榴苷和廣寄生苷均能顯著促進(jìn)脂肪細(xì)胞膜上GLUT4蛋白的表達(dá)；番石榴葉提取物、番石榴苷和廣寄生苷均能顯著抑制游離脂肪酸的釋放，降糖活性和抑制脂肪分解也存在正相關(guān)性。結(jié)論：番石榴苷和廣寄生苷兩種黃酮苷類化合物是番石榴葉降糖、抑制游離脂肪酸釋放的主要活性物質(zhì)基礎(chǔ)。

番石榴葉；番石榴苷；廣寄生苷；降糖活性；葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4；游離脂肪酸

番石榴（Psidium guajava Linn.）為桃金娘科（Myrtaceae）番石榴屬果樹(shù)[1]。因具有降糖、抗氧化、止血、抗菌、抗病毒等多種藥用功效，番石榴不僅是一種食物，更作為一種民間醫(yī)藥，在全世界亞熱帶地區(qū)被廣泛使用[2]。番石榴葉含有多種類型的化學(xué)成分，目前已經(jīng)報(bào)道的有鞣質(zhì)、黃酮、三萜、多糖、揮發(fā)油、倍半萜、雜萜醛類等[3-4]。

番石榴葉的降糖效果已被國(guó)內(nèi)外學(xué)者廣為接受，大量的科學(xué)研究亦證明其無(wú)毒副作用。在日本，特定保健用食品（Food for Specified Health Uses，F(xiàn)OSHU）已有批準(zhǔn)作為防治2型糖尿病的含番石榴提取物的番石榴茶上市[5]。Mukhtar等[6]證明250 mg/kg的番石榴葉水提物對(duì)四氧嘧啶誘導(dǎo)的糖尿病小鼠具有顯著的降血糖作用，但對(duì)正常小鼠的血糖水平無(wú)明顯改變。Ojewole[7]發(fā)現(xiàn)番石榴葉水提物不僅可降低鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的高血糖小鼠血糖水平，還可使Dahl鹽敏感小鼠的血壓和心率降低。馬山等[8]證明番石榴葉水煎劑可使各組大鼠空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG）水平降低，空腹胰島素（fasting insulin，F(xiàn)INS）水平下降，胰島素敏感指數(shù)（insulin sensitivity index，ISI）升高，與模型組比較有顯著差異。王波等[9]研究表明攀枝花地區(qū)野生番石榴葉水提物、65%和95%乙醇提取物對(duì)葡萄糖性、腎上腺素性和鏈脲佐菌素性高血糖小鼠的降血糖效率分別為36.3%、33.5%和31.3%。Hsieh等[10]研究發(fā)現(xiàn)番石榴葉能抑制低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）的糖基化，對(duì)于由糖基化所引起的各種糖尿病并發(fā)癥如心血管疾病和神經(jīng)病變都能起到很好的治療效果。Oh等[11]發(fā)現(xiàn)通過(guò)給不同年齡的 Leprdb/Leprdb小鼠腹腔注射10 mg/kg的番石榴葉甲醇提取物，呈現(xiàn)顯著的降血糖效果，其機(jī)制可能在于番石榴葉甲醇提取物顯著抑制了蛋白酪氨酸磷酸酶-1B（protein tyrosine phosphatase-1B，PTP-1B）的活性，而PTP-1B是導(dǎo)致胰島素抵抗和肥胖的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

近些年來(lái)，科研者不再滿足于粗提取物水平的研究，進(jìn)而對(duì)番石榴確切的降糖物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制進(jìn)行了深入研究。王婧茹等[12]報(bào)道番石榴葉總?cè)颇茱@著降低2型糖尿病大鼠的血糖和血脂水平，明顯改善糖尿病動(dòng)物的糖脂代謝紊亂，升高血清胰島素水平，提高胰島素敏感指數(shù)；其作用機(jī)制可能與增加過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator activated receptor γ，PPARγ）蛋白的表達(dá)有關(guān)。蔡丹昭等[13]以鏈脲佐菌素性高血糖小鼠為模型，觀察番石榴葉總黃酮對(duì)高血糖小鼠血糖、血脂水平的影響，比較給藥前后小鼠體質(zhì)量及心臟、肝臟、腎臟和胰腺的臟器指數(shù)變化，發(fā)現(xiàn)番石榴葉總黃酮能降低鏈脲佐菌素性高血糖小鼠的血糖水平。吳建中等[14]報(bào)道番石榴多糖能夠顯著降低糖尿病小鼠血糖水平，提高其抗氧化能力。Wang Hui等[15]通過(guò)活性跟蹤分離純化，發(fā)現(xiàn)番石榴葉提取物中槲皮素、山奈酚和楊梅酮對(duì)α-麥芽糖酶和α-淀粉酶具有很強(qiáng)的抑制效果。魏明[16]發(fā)現(xiàn)番石榴葉三萜化合物PGL-15能促進(jìn)3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化，顯著增加細(xì)胞葡萄糖消耗量和抑制游離脂肪酸的產(chǎn)生，并能顯著增加細(xì)胞內(nèi)PPARγ及葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4（glucose transporter 4，GLUT4）mRNA的表達(dá)。Eidenberger等[17]報(bào)道番石榴葉醇提取物分離得到的黃酮苷類化合物具有顯著的抑制血糖平衡關(guān)鍵酶二肽基肽酶的活性，是番石榴具有降糖活性的物質(zhì)基礎(chǔ)。

本研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)建立以葡萄糖消耗為特征的脂肪細(xì)胞模型，采用活性追蹤模式對(duì)番石榴葉降糖活性物質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)行了系統(tǒng)的分離純化研究，初步證明番石榴葉降糖活性物質(zhì)基礎(chǔ)主要為番石榴苷和廣寄生苷兩個(gè)化合物[18-19]，在此基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)擬進(jìn)一步研究這兩種化合物的降糖活性，并考察其與番石榴葉降糖作用的相關(guān)性，為番石榴葉降糖功能提取物的開(kāi)發(fā)研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與動(dòng)物

番石榴葉，采自廣東省茂名市林業(yè)局，原植物經(jīng)湖南吉首大學(xué)廖博儒教授鑒定為桃金娘科番石榴屬植物，植物標(biāo)本現(xiàn)存于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院天然活性物工程技術(shù)研究中心。番石榴苷和廣寄生苷結(jié)晶為自制，面積歸一化法測(cè)定結(jié)果表明兩者純度均大于99%。

葡萄糖測(cè)定試劑盒 廣州科方生物技術(shù)有限公司；游離脂肪酸測(cè)定試劑盒 北京普利來(lái)基因技術(shù)有限公司；Ⅰ型膠原酶 美國(guó)Sigma公司；去酚紅Hanks緩沖液、青霉素-鏈霉素雙抗 杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司；腎上腺素 日本TCI化成工業(yè)株式會(huì)社；胎牛血清 杭州四季青生物工程材料有限公司；兔抗GLUT4多克隆抗體、羊抗兔IgG 武漢博士德生物工程有限公司；硝酸纖維素膜 廣州威佳科技有限公司；乙腈（色譜純） 德國(guó)Merck公司；水為超純水，其他試劑均為分析純。

SPF級(jí)雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，體質(zhì)量120～150 g，購(gòu)自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)為SCXK（粵）2011-0015。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-20AT高效液相色譜儀 日本島津公司；萬(wàn)分之一電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司；酶標(biāo)儀美國(guó)PE公司；SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司；TC-2323二氧化碳培養(yǎng)箱 美國(guó)Sheldon公司；移液器（各種規(guī)格）、電泳儀、轉(zhuǎn)印儀 美國(guó)伯樂(lè)公司；5417R高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 不同月份番石榴葉中番石榴苷和廣寄生苷含量測(cè)定

1.3.1.1 反相高效液相色譜條件

色譜柱：島津Shim-pack VP-ODS C18柱（150 mmh4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：水-乙腈（82∶18，V/V）；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：257 nm；柱溫：30 ℃；流速：1 mL/min，進(jìn)樣體積：10 μL。

1.3.1.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取3.9 mg番石榴苷，溶解定容于25 mL容量瓶中，加色譜甲醇溶解，過(guò)0.45 μm微孔濾膜，即得0.156 mg/mL的番石榴苷對(duì)照品溶液；精密稱取4.3 mg廣寄生苷，溶解定容于25 mL容量瓶中，加色譜甲醇溶解，過(guò)0.45 μm微孔濾膜，即得0.172 mg/mL的廣寄生苷對(duì)照品溶液。

1.3.1.3 樣品溶液的制備

精密稱取10 g番石榴葉，以10 倍體積50%乙醇回流提取3 次，60 ℃減壓濃縮，定容至100 mL容量瓶中。過(guò)0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液作為樣品溶液。

1.3.1.4 線性關(guān)系考察

分別精密吸取番石榴苷對(duì)照品和廣寄生苷對(duì)照品溶液1、2、4、6、8、20 μL，注入液相色譜儀，按1.3.1.1節(jié)的色譜條件測(cè)定峰面積，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，番石榴苷對(duì)照品和廣寄生苷對(duì)照品峰面積值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.1.5 精密度實(shí)驗(yàn)

精密吸取番石榴苷對(duì)照品和廣寄生苷對(duì)照品溶液10 μL，按照1.3.1.1節(jié)的色譜條件測(cè)定，重復(fù)進(jìn)樣5 次。

1.3.1.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

分別取同一批番石榴葉粉末5 份，按1.3.1.3節(jié)方法操作，按1.3.1.1節(jié)的色譜條件進(jìn)行測(cè)定。

1.3.1.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取同一份樣品溶液，室溫條件下放置，分別于0、2、4、6、8 h測(cè)定峰面積值。

1.3.1.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

精密稱取6 份已知含量的3月份番石榴葉粉10.0 g左右，分別按照1∶1（m/m）比例加入自制番石榴苷、廣寄生苷對(duì)照品，按照1.3.1.3節(jié)方法制備供試品，取10 μL進(jìn)樣分析，測(cè)定并計(jì)算回收率。

1.3.2 不同月份番石榴葉乙醇提取物降糖活性測(cè)定

1.3.2.1 脂肪細(xì)胞的分離純化

[20]略作修改：大鼠脫頸處死，乙醇浴后無(wú)菌開(kāi)腹。取附睪外層脂肪組織，Hanks緩沖液漂洗兩次并剔除附帶血管，再剪碎至體積約1 mm3，加入適量0.1% Ⅰ型膠原酶溶液37 ℃水浴消化1.5 h后，2～3 倍體積的胎牛血清終止消化。將細(xì)胞懸液1 200 r/min離心10 min，棄下層溶液，上層脂肪細(xì)胞同法加Hanks緩沖液洗滌細(xì)胞兩次，通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)板，加入Hanks液調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度。

1.3.2.2 大鼠脂肪細(xì)胞降糖模型

參考文獻(xiàn)[21]略作修改：在96 孔板中建立200 μL反應(yīng)體系：100 μL 2h106個(gè)/mL的細(xì)胞懸液、30 μL葡萄糖溶液（質(zhì)量濃度1 mg/mL）、30 μL胎牛血清、40 μL樣品溶液。在此模型中用體積分?jǐn)?shù)0.1%二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）Hanks緩沖液作對(duì)照組，胰島素為陽(yáng)性對(duì)照組。200 μL反應(yīng)體系培養(yǎng)30 min后，每孔加入終濃度為10–5mol/L的腎上腺素，繼續(xù)培養(yǎng)3 h后，冰浴終止反應(yīng)。然后每孔精密吸取2 μL上清液，采用微量葡萄糖氧化酶法[22]顯色，在酶標(biāo)儀上505 nm波長(zhǎng)處讀數(shù)，測(cè)定并計(jì)算各孔葡萄糖濃度，通過(guò)建立工作曲線，并和對(duì)照組比較計(jì)算各樣品葡萄糖的消耗量，由此評(píng)價(jià)番石榴葉乙醇提取物或兩種化合物攝取葡萄糖的能力，具體計(jì)算公式如下。

葡萄糖攝取水平/（mmol/L）= cctrl－ccompound

式中：cctrl為對(duì)照組的葡萄糖濃度/（mmol/L）；ccompound為樣品或分離得到的有效成分經(jīng)過(guò)3 h培養(yǎng)后殘留培養(yǎng)基中的葡萄糖濃度/（mmol/L）。

1.3.2.3 供試樣品的制備與降糖活性測(cè)定

將不同月份的番石榴葉粉碎成粗粉，10 倍體積50%乙醇回流提取3 次，每次1 h，提取液60 ℃減壓濃縮、冷凍干燥，用體積分?jǐn)?shù)0.5% DMSO配制成1.2 mg/mL的溶液進(jìn)行降糖活性檢測(cè)。

1.3.3 Western blotting法分析GLUT4表達(dá)水平

1.3.3.1 膜蛋白的提取與定量

在脂肪細(xì)胞模型上，各種藥物干預(yù)后（廣寄生苷、番石榴苷與番石榴葉乙醇提取物質(zhì)量濃度均為100 μg/mL，胰島素濃度為8 nmol/L），采用Hanks緩沖液漂洗脂肪細(xì)胞3 次，收集脂肪細(xì)胞，參考文獻(xiàn)[23]制備脂肪細(xì)胞的膜蛋白：藥物干預(yù)后細(xì)胞用TES緩沖液反復(fù)洗滌3 次，每孔加入200 μL TES緩沖液，小心將細(xì)胞刮出，重復(fù)樣品合并，放入EP管，在冰上采用玻璃勻漿器勻漿，1 000hg離心，去掉沉淀，上清液再16 000hg、4 ℃離心20 min，收集沉淀，TES緩沖液溶解，－70 ℃保存即為粗膜蛋白溶液，采用Bradford法（考馬斯亮藍(lán)法）檢測(cè)其蛋白質(zhì)濃度。

1.3.3.2 電泳、轉(zhuǎn)膜、雜交和顯色

在細(xì)胞膜蛋白樣品中加入等體積的2×十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）凝膠上樣緩沖液，煮沸10 min，用微量加樣器上樣。60 μg等份的各組膜蛋白溶液，采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離，在150 V電壓條件下，轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜（nitrocellulose，NC）膜120 min，NC膜先用封閉液（5%脫脂奶粉配制的TBST溶液）封閉1 h，然后以TBST溶液洗4 次，每次10 min，雜一抗兔抗GLUT4多克隆抗體溶液中（用抗體稀釋液1∶130（V/V）稀釋）4 ℃孵育過(guò)夜，37 ℃緩搖1.5 h，取出后洗膜3 次，洗滌步驟同上。把NC膜浸于辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG中（用抗體稀釋液1∶2 000（V/V）稀釋），37 ℃緩搖1.5 h，取出膜后同上方法洗滌3 次。將NC膜置于DAB底物液中顯色反應(yīng)5 min，棄去反應(yīng)液，用水沖洗膜，終止反應(yīng)，觀察結(jié)果。應(yīng)用IMAGE J圖像分析軟件對(duì)NC膜上的條帶進(jìn)行灰度值比較分析。

1.3.4 抑制游離脂肪酸釋放活性測(cè)定

1.3.4.1 游離脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

精確稱取16.4 mg棕櫚酸標(biāo)準(zhǔn)品，溶于游離脂肪酸抽提液中，配制為終體積1 mL、終濃度64 mmol/L的溶液，－20 ℃保存。制備標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，用抽提液將64 mmol/L標(biāo)準(zhǔn)品稀釋為3.2、1.6、0.8、0.4、0.2、0.1 mmol/L，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)方法，分別加入銅試劑和顯色劑進(jìn)行操作（標(biāo)準(zhǔn)品的空白對(duì)照為對(duì)應(yīng)抽提液），在550 nm波長(zhǎng)處比色。

1.3.4.2 樣品中游離脂肪酸含量測(cè)定

建立細(xì)胞活性檢測(cè)模型，各種藥物干預(yù)后，細(xì)胞液經(jīng)過(guò)培養(yǎng)和冰浴終止反應(yīng)，取50 μL細(xì)胞液（樣品空白對(duì)照為對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)液），加入抽提液150 μL和銅試劑50 μL，振蕩2 min，室溫靜置10 min后，4 ℃條件下12 000 r/min離心5 min，取80 μL上層清液置于96 孔酶標(biāo)板，加入150 μL顯色劑，振蕩5 s，室溫靜置5 min，在550 nm波長(zhǎng)處比色。代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程測(cè)定游離脂肪酸的含量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

2 結(jié)果與分析

2.1 反相高效液相色譜分析結(jié)果

2.1.1 供試品反相高效液相色譜純度分析

圖1 番石榴苷（a）、廣寄生苷（b）、番石榴葉乙醇提取物（c）反相高效液相色譜圖Fig.1 HPLC profiles of guaijaver （a）， avicularin （b） and guava leaf ethanol extract (c)

由圖1可知，本實(shí)驗(yàn)室自制的番石榴苷和廣寄生苷化合物純度高，番石榴葉乙醇提取物中兩種化合物分離度好，即可采用反相高效液相色譜法對(duì)兩種化合物進(jìn)行準(zhǔn)確的含量分析。

2.1.2 線性關(guān)系結(jié)果

以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，番石榴苷對(duì)照品和廣寄生苷對(duì)照品峰面積值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明，番石榴苷在0.156～3.12 μg范圍內(nèi)線性良好，線性回歸方程為y=22.532 0x+0.369 5（R2=0.999 2）。廣寄生苷在0.172～3.44 μg范圍內(nèi)線性良好，線性回歸方程為y= 22.242 0x－0.433 5（R2=0.999 5）。

2.1.3 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

精密吸取番石榴苷對(duì)照品和廣寄生苷對(duì)照品溶液10 μL，按照1.3.1.1節(jié)的色譜條件測(cè)定，重復(fù)進(jìn)樣5 次，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）分別為1.35%和1.12%，表明此方法的精密度高。

2.1.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

分別取同一批番石榴提取液，按1.3.1.1節(jié)的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得番石榴苷和廣寄生苷峰面積值的RSD分別為1.76%和1.09%，說(shuō)明方法的重現(xiàn)性好。

2.1.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

取同一份樣品溶液，分別于室溫條件下放置0、2、4、6、8 h后測(cè)定峰面積值，結(jié)果表明，番石榴苷標(biāo)準(zhǔn)品和廣寄生苷標(biāo)準(zhǔn)品在8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好，RSD分別為1.93%和0.93%。

2.1.6 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表1 廣寄生苷、番石榴苷加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果（）Table 1 Results of recovery tests (

表1 廣寄生苷、番石榴苷加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果（）Table 1 Results of recovery tests (

實(shí)驗(yàn)次數(shù)稱樣量/g原有量/mg 加入量/mg 實(shí)測(cè)量/mg 回收率/% 平均回收率/%（RSD/%）番石榴苷廣寄生苷番石榴苷廣寄生苷番石榴苷廣寄生苷番石榴苷廣寄生苷 番石榴苷 廣寄生苷1 9.69210.26411.853 10.02312.012 20.356 23.058 100.68 93.28 2 9.81710.39612.006 10.79112.084 21.093 23.971 99.12 99.01 3 9.98510.57412.212 10.60512.045 21.796 23.670 105.81 95.13 4 9.71610.28911.883 10.37812.099 20.400 23.711 97.42 97.76 5 9.80110.37911.987 10.29912.109 20.701 24.315 100.22 101.81 6 9.55310.11711.683 10.24512.073 20.521 22.843 101.55 92.44 100. 81（2.83）96.57（3.59）

由表1可知，番石榴苷平均回收率為100.81%，RSD為2.83%；廣寄生苷平均回收率為96.57%，RSD為3.59%。說(shuō)明可通過(guò)該方法準(zhǔn)確測(cè)定材料中兩種化合物的含量。

2.1.7 不同月份番石榴葉中番石榴苷和廣寄生苷含量

表2 不同月份的番石榴葉中廣寄生苷和番石榴苷含量Table 2 Guaijaverin and avicularin contents in guava leaves in different months mg/g

由表2可知，番石榴苷和廣寄生苷在不同月份番石榴葉中含量差異較大，主要表現(xiàn)為在溫度較高的月份含量高，溫度較低的月份含量偏低，兩種化合物均在7月份的番石榴葉中含量達(dá)到最高，分別為（3.405f0.124）、（3.332f0.134） mg/g，含量最低均在1月份，分別為（0.136f0.034）、（0.405f0.024） mg/g。另外，番石榴苷在5ü8月份、廣寄生苷在5ü10月份的番石榴葉中含量均超過(guò)了2 mg/g。

2.2 不同月份番石榴葉乙醇提取物降糖活性

2.2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

利用血糖測(cè)定試劑盒和酶標(biāo)儀檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中葡萄糖濃度。標(biāo)準(zhǔn)品濃度和吸光度之間線性回歸方程為y=0.034 8x－0.013 3（R2=0.999）。以上結(jié)果說(shuō)明可通過(guò)比色測(cè)定吸光度從而準(zhǔn)確計(jì)算出細(xì)胞培養(yǎng)液中的葡萄糖濃度。

2.2.2 番石榴葉乙醇提取物、廣寄生苷和番石榴苷的降糖活性

圖2 番石榴葉乙醇提取物、番石榴苷和廣寄生苷的降糖活性Fig.2 Hypoglycemic activity of guava leaf ethanol extract， guaijaverin and avicularin

以大鼠脂肪細(xì)胞為模型，觀察番石榴葉50%乙醇提取物、廣寄生苷和番石榴苷（以8 nmol/L胰島素為陽(yáng)性對(duì)照）的降糖效果，結(jié)果見(jiàn)圖2。對(duì)照組葡萄糖濃度為（10.87f0.19） mmol/L，相比之下，8 nmol/L的胰島素能夠極顯著促進(jìn)葡萄糖的攝?。≒＜0.01），同時(shí)番石榴葉50%乙醇提取物組、廣寄生苷組和番石榴苷組均可劑量依賴性地促進(jìn)葡萄糖攝取。100 μg/mL番石榴苷組和廣寄生苷組葡萄糖濃度分別為（9.07f0.25）、（8.57f0.38） mmol/L。以上結(jié)果說(shuō)明，該模型能夠用于評(píng)價(jià)物質(zhì)是否具有降糖效果，同時(shí)番石榴葉50%乙醇提取物、番石榴苷和廣寄生苷均具有良好的降糖效果。

2.2.3 不同月份番石榴葉乙醇提取物降糖活性

采集2012年全年的番石榴葉，經(jīng)50%乙醇提取，用脂肪細(xì)胞活性檢測(cè)模型對(duì)質(zhì)量濃度為1.2 mg/mL的各月份樣品進(jìn)行降血糖活性分析。

圖3 不同月份番石榴葉乙醇提取物降糖活性Fig.3 Hypoglycemic activity of ethanol extracts of guava leaves in different months

如圖3所示，在2012年全年的番石榴葉乙醇提取物中，以7月份的番石榴葉乙醇提取物的降糖效果最強(qiáng)，1月份的最弱。而6ü9月份番石榴葉乙醇提取物均可使細(xì)胞液中的葡萄糖濃度維持在較低水平。此外，1ü4月份的番石榴葉乙醇提取物降糖量呈現(xiàn)明顯的增加趨勢(shì)，9ü12月份表現(xiàn)為降糖量遞減變化趨勢(shì)。所以，2012年全年的番石榴葉乙醇提取物所對(duì)應(yīng)的葡萄糖攝取水平表現(xiàn)為一個(gè)開(kāi)口向下的拋物線。進(jìn)一步將葡萄糖攝取水平與不同月份番石榴苷和廣寄生苷兩種化合物總含量比較，結(jié)果見(jiàn)圖4。兩種化合物總含量在不同月份的變化中亦表現(xiàn)為一個(gè)開(kāi)口向下的拋物線，與葡萄糖攝取能力的變化趨勢(shì)基本一致，這說(shuō)明在脂肪細(xì)胞模型中，番石榴葉乙醇提取物的降糖能力和兩種化合物總含量緊密相關(guān)，即番石榴苷和廣寄生苷兩種化合物總含量越高，則降糖效果越好，這充分說(shuō)明番石榴苷和廣寄生苷是番石榴葉的主要降糖物質(zhì)基礎(chǔ)。

2.3 Western blotting結(jié)果

細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取量關(guān)鍵在于細(xì)胞外膜上GLUT4的數(shù)量，為研究各處理因素對(duì)GLUT4水平的影響，采用蛋白質(zhì)免疫印跡分析法檢測(cè)GLUT4的表達(dá)水平。如圖5所示，對(duì)照組GLUT4灰度值最低，廣寄生苷組GLUT4灰度值最高，為對(duì)照組的3.44 倍；其次是番石榴苷組，為對(duì)照組的2.85 倍；胰島素組和番石榴葉50%乙醇提取物組的GLUT4灰度值分別為對(duì)照組的2.64、1.90 倍。

圖5 各組大鼠脂肪細(xì)胞GLUT4蛋白質(zhì)印跡灰度值Fig.5 GLUT4 expression on fat cell membrane treated by avicularin or guaijaverin

結(jié)合圖2結(jié)果，分析番石榴葉50%乙醇提取物、廣寄生苷和番石榴苷以及8 nmol/L胰島素這4 組中葡萄糖攝取量和GLUT4含量的關(guān)系，結(jié)果見(jiàn)圖6。GLUT4含量越高，細(xì)胞對(duì)葡萄糖攝取量越多，兩者之間表現(xiàn)出明顯的正相關(guān)性。

圖6 不同樣品作用下細(xì)胞攝取葡萄糖水平和GLUT4含量的關(guān)系Fig.6 Relationship between glucose-uptake level and GLUT4 expression

2.4 抑制游離脂肪酸釋放活性

2.4.1 游離脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

以棕櫚酸為標(biāo)準(zhǔn)品，采用游離脂肪酸試劑盒和酶標(biāo)儀檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中游離脂肪酸濃度。棕櫚酸標(biāo)準(zhǔn)品濃度和吸光度之間線性回歸方程為y=0.598 3x+0.238 6（R2=0.999 1）。這說(shuō)明可通過(guò)比色測(cè)定吸光度來(lái)準(zhǔn)確計(jì)算出細(xì)胞培養(yǎng)液中的游離脂肪酸濃度。

2.4.2 番石榴葉乙醇提取物、廣寄生苷和番石榴抑制游離脂肪酸釋放活性

將番石榴葉50%乙醇提取物、廣寄生苷和番石榴苷干預(yù)后的細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行檢測(cè)分析，各組游離脂肪酸濃度如圖7所示。

圖7 脂肪細(xì)胞培養(yǎng)液中游離脂肪酸含量比較Fig.7 FFA content in the culture supernatant of fat cells

廣寄生苷組細(xì)胞培養(yǎng)液中游離脂肪酸含量最低，為（0.69f0.11） mmol/L，其次是番石榴苷組，為（0.89f0.15） mmol/L，8 nmol/L胰島素處理后細(xì)胞培養(yǎng)液中游離脂肪酸含量為（0.99f0.02） mmol/L；而番石榴葉50%乙醇提取物組培養(yǎng)液中游離脂肪酸含量較高，為（1.61f0.16） mmol/L，接近對(duì)照組的（1.87f0.13） mmol/L?？赡苁怯捎诜袢~50%乙醇提取物中有效成分的作用濃度較低，因此其抑制效果較弱。

結(jié)合各組樣品的降糖實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以對(duì)照組葡萄糖和游離脂肪酸含量為基準(zhǔn)值0，對(duì)各組細(xì)胞葡萄糖攝取活性和抑制游離脂肪酸釋放活性之間的關(guān)系進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)圖8，除番石榴葉乙醇提取物組外，其余各組的糖脂代謝呈現(xiàn)出相似的趨勢(shì)，即葡萄糖攝取活性和抑制游離脂肪釋放活性趨勢(shì)一致。

圖8 樣品對(duì)細(xì)胞攝取葡萄糖活性和抑制游離脂肪酸釋放的效果分析Fig.8 Relationship between glucose-uptake level and percent inhibition of FFA release

3 結(jié)論與討論

本實(shí)驗(yàn)采用反相高效液相色譜法測(cè)定番石榴葉中番石榴苷和廣寄生苷兩種化合物的含量，采用大鼠脂肪細(xì)胞模型對(duì)番石榴葉乙醇提取物、兩種主要黃酮苷——番石榴苷和廣寄生苷進(jìn)行了降糖、抑制游離脂肪酸活性的研究，結(jié)果表明：1）番石榴苷和廣寄生苷在不同月份番石榴葉中含量差異較大，以6ü9月份的番石榴葉中含量較高，最高在7月份，番石榴苷和廣寄生苷含量分別為（3.405f0.124）、（3.332f0.134） mg/g；2）不同月份番石榴葉提取物降糖效果差異較大，以6ü9月份效果較好，最佳的是7月份的番石榴葉提取物，此時(shí)葡萄糖攝取量為（1.58f0.09） mmol/L。同時(shí)不同月份番石榴葉乙醇提取物降糖效果與廣寄生苷和番石榴苷含量成正相關(guān)；3）番石榴苷和廣寄生苷均能顯著促進(jìn)GLUT4蛋白在脂肪細(xì)胞中的表達(dá)，從而起到降糖效果，且GLUT4蛋白的表達(dá)量與葡萄糖攝取量成正相關(guān)；4）番石榴苷和廣寄生苷均能顯著抑制大鼠脂肪細(xì)胞游離脂肪酸的釋放，且降糖活性與抑制游離脂肪的釋放活性成正相關(guān)。

游離脂肪酸升高（脂毒性）導(dǎo)致的胰島素抵抗已經(jīng)成為當(dāng)前該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。游離脂肪酸的增多將導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)絲/蘇氨酸激酶活性的增強(qiáng)，進(jìn)而導(dǎo)致胰島素受體底物（insulin receptor substrate，IRS）-1、IRS-2的絲/蘇氨酸殘基磷酸化，降低胰島素受體后信號(hào)通路，影響磷脂酰-3激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）的活化，結(jié)果使葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（GLUT）的活力及細(xì)胞內(nèi)其他胰島素信號(hào)逐漸消失，從而發(fā)生胰島素抵抗[24]。易屏等[25]研究證實(shí)，游離脂肪酸可抑制胰島素刺激的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)，其機(jī)制在于抑制IRS-1和PI3K蛋白的表達(dá)，但對(duì)GLUT4蛋白表達(dá)卻無(wú)影響，由此可見(jiàn)，游離脂肪酸對(duì)糖代謝作用在于影響胰島素介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，抑制GLUT4向細(xì)胞膜的遷移。本研究結(jié)果表明，番石榴苷和廣寄生苷可促進(jìn)GLUT4向脂肪細(xì)胞膜的遷移，其可能機(jī)制在于這兩種化合物能抑制游離脂肪酸釋放，避免了高濃度游離脂肪酸對(duì)胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的損傷。

番石榴葉的降血糖效果已得到了充分的肯定，具有較高的藥用價(jià)值，且原料來(lái)源豐富、成本較低，具有廣泛的應(yīng)用前景。本研究在初步確定番石榴苷和廣寄生苷為番石榴葉降糖活性物質(zhì)基礎(chǔ)上，進(jìn)一步圍繞物質(zhì)基礎(chǔ)展開(kāi)研究，在含量和降糖活性關(guān)系、GLUT4蛋白表達(dá)和抑制游離脂肪酸釋放層面上，進(jìn)一步證實(shí)了番石榴葉的降糖活性物質(zhì)主要來(lái)自番石榴苷和廣寄生苷這兩種黃酮苷，本研究結(jié)果為番石榴葉的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和利用打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。番石榴樹(shù)生長(zhǎng)所處的氣溫、光照、雨量等氣候環(huán)境使番石榴葉的內(nèi)質(zhì)生化成分包括各種功能活性化合物等會(huì)發(fā)生較大變化。在中國(guó)廣東地區(qū)，一般春季是在3ü5月，夏季是在6ü10月，秋季是11月，冬季是在12ü2月。從本研究結(jié)果來(lái)看，7月份番石榴葉降糖活性最高，6ü9月份這4 個(gè)月的番石榴葉活性基本持平，這可能與其活性物質(zhì)在光合作用和呼吸作用的合成和分解的強(qiáng)度差值達(dá)到最大有關(guān)。冬季氣溫低，且光照時(shí)間短、光照強(qiáng)度弱，導(dǎo)致番石榴葉體內(nèi)各種活性組分的合成能力降低，這可能是11ü2月份的番石榴葉降糖能力最差的原因。

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Hypoglycemic Activity of Avicularin and Guaijaverin in Guava Leaves

OUYANG Wen1， ZHU Xiaoai2， SU Lei1， CHEN Xuexiang2， YE Shumin1， CAO Yong2，*
（1. School of Pharmacy， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410208， China；2. College of Food Science， South China Agricultural University， Guangzhou 510642， China）

Objective： To study the hypoglycemic activity of avicularin and guaijaverin in guava leaves. Methods： Reversedphase high performance liquid chromatography （RP-HPLC） was used to determine the content of avicularin and guaijaverin in guava leaves in different months of the year. The fat cell model was established to evaluate hypoglycemic activity of the ethanol extract of guava leaves， avicularin and guaijaverin respectively. Western blotting was used to analyze GLUT4 expression on the fat cell membrane. Free fatty acids as another index were also determined using a fatty acid kit. Results：The contents of guaijaverin and avicularin in guava leaves showed great difference in different months， and guava leaves had higher contents and hypoglycemic activity both between June and September. The guava leaf extract， guajava and avicularin could all significantly promote GLUT4 protein expression on the fat cell membrane and significantly inhibit the release of free fatty acids. Conclusion： Guaijaverin and avicularin are the major bioactive components in guava leaves with hypoglycemic activity and inhibitory capacity against free fatty acid release.

guava leaves； guaijaverin； avicularin； hypoglycemic activity； glucose transporter 4 （GLUT4）； free fatty acid

10.7506/spkx1002-6630-201607031

TS201.2

A

1002-6630（2016）07-0168-07

歐陽(yáng)文， 朱曉艾， 蘇磊， 等. 番石榴葉中廣寄生苷和番石榴苷的降糖作用［J］. 食品科學(xué)， 2016， 37（7）： 168-174.

DOI：10.7506/spkx1002-6630-201607031. http：//www.spkx.net.cn

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2015-05-15

國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31201321）；湖南省教育廳優(yōu)秀青年基金項(xiàng)目（13B084）；湖南省“中藥學(xué)”重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目（湘教通［2011］ 76號(hào)）；湖南中醫(yī)藥大學(xué)中藥化學(xué)教學(xué)團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（TD-007）

歐陽(yáng)文（1981—），男，講師，博士，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物化學(xué)。E-mail：oyw810225@126.com

*通信作者：曹庸（1966—），男，教授，博士，研究方向?yàn)樘烊换钚晕镔|(zhì)。E-mail：caoyong2181@scau.edu.cn