王曉丹，班世棟，周鴻翔，胡寶東，邱樹毅,

（1.貴州大學(xué) 貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州 貴陽 550025；2.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025；3.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽 550025）

貴州省遵義地區(qū)3 個醬香型大曲細(xì)菌群落的比較分析

王曉丹1,2,3，班世棟1,2，周鴻翔1,3，胡寶東1,3，邱樹毅1,3,*

（1.貴州大學(xué) 貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州 貴陽 550025；2.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025；3.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽 550025）

研究醬香型大曲主要產(chǎn)地遵義地區(qū)的細(xì)菌類群組成，并利用主成分分析法對這些細(xì)菌的類群和大曲的關(guān)系進(jìn)行評定。樣品采用454 FLX+平臺進(jìn)行測序，樣品中所測微生物為細(xì)菌，測序片段為16S rDNA V3～V5區(qū)，所有樣品的優(yōu)質(zhì)序列按97%的相似度進(jìn)行聚類，計算這些細(xì)菌類群的相對含量。用主成分分析法對細(xì)菌類群和大曲樣品進(jìn)行分析，結(jié)果顯示：從3 個大曲樣品中共檢測出6 個門49 個屬細(xì)菌，主要是厚壁菌門；樣品MT01以高溫放線菌屬（Thermoactinomyces）34.40%、芽孢桿菌屬（Bacillus）31.40%、Scopulibacillus 13.60%為主，占總量的79.40%，樣品ZJ01以高溫放線菌屬（Thermoactinomyces）34.80%、芽孢桿菌屬Bacillus 49.00%為主，占總量的84.80%，樣品ZX01以高溫放線菌屬（Thermoactinomyces）66.10%為主；對3 個大曲樣本進(jìn)行主成分分析，發(fā)現(xiàn)棒狀桿菌屬（Corynebacterium）、魏斯氏菌屬（Weissella）是影響樣品MT01與ZJ01距離最近，ZX01相對距離較遠(yuǎn)的細(xì)菌類群。

醬香型大曲；細(xì)菌；高通量測序；類群；主成分分析

高溫制曲工藝是大曲醬香白酒釀制所獨有的制曲方式。曲料被制成曲塊，其品溫達(dá)到60～65 ℃，先經(jīng)過40 d的發(fā)酵，再經(jīng)過6 個月以上貯藏才能使用。在整個制曲過程中形成了復(fù)雜的微生物群落結(jié)構(gòu)，主要有細(xì)菌、霉菌和酵母，其中細(xì)菌的數(shù)量最多，特別是耐高溫細(xì)菌的量最多[1]。目前對高溫大曲細(xì)菌種類和功能的研究包括：翁慶北等[2-3]從茅臺酒曲中分離出8 株產(chǎn)A2淀粉酶的優(yōu)良菌株，經(jīng)鏡檢和生化鑒定為芽孢桿菌屬，其中1 株能產(chǎn)最適溫度為80 ℃的高溫型淀粉酶；從習(xí)酒酒曲中分離出16 株產(chǎn)A2淀粉酶菌株，經(jīng)常規(guī)法鑒定均為革蘭氏陽性芽孢桿菌。廖建民等[4]從瀘州幾個名優(yōu)酒廠的曲中分離出125 株細(xì)菌并依據(jù)形態(tài)學(xué)和生理特征進(jìn)行了鑒定，發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌數(shù)量和種類均較多，球菌數(shù)量較少。胡桂林等[5]從大曲中分離到1 株細(xì)菌，利用 Biolog微生物自動分析系統(tǒng)鑒定為地衣芽孢桿菌。莊名揚等[6]從高溫大曲中分離到一株地衣芽孢桿菌醬香B3-1菌，實驗表明，該功能菌能增加游離氨基酸的種類和數(shù)量，促進(jìn)美拉德反應(yīng)迅速發(fā)生，利于白酒香味物質(zhì)的形成。因此，大曲中細(xì)菌的類群組成對大曲的品質(zhì)和功能影響至關(guān)重要。但是，自然界能培養(yǎng)的微生物只有1%，絕大部分微生物不可培養(yǎng)，所以用不可培養(yǎng)方法研究微生物能比較客觀地反映環(huán)境中微生物組成。以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction- denatured gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）分析福矛高溫大曲貯藏過程的群落結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，原核生物多樣性豐富，以芽孢桿菌最多，成品大曲中的微生物主要是耐熱的細(xì)菌、放線菌和少量霉菌[7]，研究酒曲中微生物時，檢測到傳統(tǒng)培養(yǎng)方法未發(fā)現(xiàn)的嗜麥芽窄食單胞菌、假單胞菌、Uncultured Propionibacteriaceae bacterium、Uncultured Weissella、Uncultured Cyanobacterium，并檢測到了工業(yè)釀酒重要的非釀酒酵母[8-9]。說明用免培養(yǎng)方法可以檢測到未發(fā)現(xiàn)的微生物，更加全面地了解大曲中的微生物。

隨著第二代測序技術(shù)的迅猛發(fā)展，科學(xué)界也開始越來越多地應(yīng)用第二代測序技術(shù)來解決生物學(xué)問題，能一次并行對幾十萬到幾百萬條DNA分子進(jìn)行序列測定而廣泛被一些專家學(xué)者用于土壤、腸道等微生物菌群豐富樣品的檢測[10-12]。作為中國傳統(tǒng)釀造的醬香型白酒大曲，其微生物菌群的豐富度是不言而喻的，運用現(xiàn)代分子生物技術(shù)——高通量測序技術(shù)，采用免培養(yǎng)的方法來檢測大曲中微生物的組成成為更高效、準(zhǔn)確的方法。

主成分分析（principal component analysis，PCA）是將多個變量通過線性變換以選出較少個數(shù)重要變量的一種多元統(tǒng)計分析方法。其優(yōu)點在于可以把樣本和變量同時做到一張圖解上，將樣品的大類及其屬性在圖上直觀表示。并且能對樣品直觀的分類指示分類主要參數(shù)及分類的依據(jù)。因此采用主成分分析法能直接展示對于大曲樣品以及復(fù)雜的微生物類群的關(guān)系。如采用主成分分析法確定貢獻(xiàn)率較大的細(xì)菌類群[13]。主成分分析法把原來眾多具有一定相關(guān)的多個指標(biāo)（比如P 個指標(biāo)）重新組合成一組新的互相無關(guān)的綜合指標(biāo)來代替原來的指標(biāo)，使復(fù)雜的問題簡單化，便于抓住主要矛盾進(jìn)行分析[14-15]。

本研究對選取的3 個醬香型大曲樣本進(jìn)行針對16S rDNA V3～V5區(qū)高通量測序，并對這些細(xì)菌的物種豐度信息利用主成分分析法對檢測的菌落組成及其含量和3 個醬香型大曲樣本分別進(jìn)行分析，對本實驗大曲樣中的優(yōu)勢菌群給以確認(rèn)，也對大曲樣品與細(xì)菌種群的關(guān)系進(jìn)行評定。這對今后研究大曲乃至大曲酒中微生物提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 樣品

本實驗采集3 組樣品。由于生產(chǎn)用高溫大曲為成品曲貯藏6 個月的陳曲，傳統(tǒng)的釀酒方法特別強調(diào)用陳曲，陳曲可使制曲過程中進(jìn)入的大量產(chǎn)酸多的細(xì)菌在比較干燥的條件下死去或失去繁殖能力，釀酒時酸度降低。同時，在貯藏過程中，酶活力下降，在同等條件下，發(fā)酵溫度上升平緩，釀出來的酒，香味較好[16]。因此采集樣品為貯藏6 個月的陳曲，生產(chǎn)車間使用粉碎待用。樣品產(chǎn)地為貴州遵義地區(qū)，尤其是茅臺鎮(zhèn)域內(nèi)是“世界醬香型白酒主產(chǎn)區(qū)”、“中國酒都核心區(qū)”，這里生產(chǎn)的貴州茅臺酒是大曲醬香型白酒的鼻祖，擁有悠久的歷史。

MT01樣品：來源于貴州茅臺酒股份有限公司茅臺酒生產(chǎn)車間生產(chǎn)用曲，產(chǎn)地位于黔北遵義地區(qū)赤水河畔的茅臺鎮(zhèn)。地處東經(jīng) 106°22′，北緯27°51′，海拔423 m。

ZJ01樣品：來源于貴州珍酒釀酒有限公司珍酒釀造車間生產(chǎn)用曲，前身是始建于1975年的“貴州茅臺酒易地試驗廠”，產(chǎn)地位于貴州省遵義市北郊十字鋪，東經(jīng)106°54′、北緯27°44′海拔933 m。這里地形與茅臺酒廠所在地十分相似，年平均氣溫、濕度等也比較相近。

ZX01樣品：來源于貴州中心釀酒集團(tuán)釀造車間生產(chǎn)用曲。是由茅臺酒前身“衡昌燒坊”發(fā)展而來。產(chǎn)地位于黔北遵義地區(qū)赤水河畔的茅臺鎮(zhèn)，與貴州茅臺酒股份有限公司直線距離300 m。

采集后的樣品迅速放入無菌保鮮袋中，－20 ℃保存。

1.2 試劑

DNA提取試劑盒 美國MP Biomedicals公司；MinElute PCR純化試劑盒 德國Qiagen公司；羅氏454 FLX+平臺 美國羅氏公司。

1.3 方法

大曲總DNA是用DNA提取試劑盒提取，所有過程參照試劑盒說明書。所有樣品采用454 FLX+平臺進(jìn)行測序，樣品中所測微生物為細(xì)菌，測序片段為16SrDNA V3～V5區(qū)，rDNA通用引物序列：正向引物5′-CCTACGGGAGGCAGCAG-3′，反向引物5′-CCGTCAATTCMTTTRAGT-3′[17]。融合引物：正向引物5′-454adapter-mid-CCTACGGGAGGCAGCAG-3′，反向引物5′-454adapter-CCGTCAATTCMTTTRAGT-3′。PCR體系為25 μL，包括8.75 μL超純水、5.00 μL 5hQ5 Buffer、5.00 μL 5hGC Enhancer、2.00 μL dNTP（2.5 mmol/L）、2.00 μL DNA（2 ng/μL）、1.00 μL引物F（10 μmol/L）、1.00 μL引物R（10 μmol/L）、0.25 μL Q5 DNA聚合酶，反應(yīng)程序為：98 ℃預(yù)變性3 min，98 ℃變性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，27 個循環(huán)后，72 ℃保持7 min。PCR產(chǎn)物用MinElute PCR純化試劑盒純化，再用1%的瓊脂糖凝膠電泳，所得樣品送上海佩森諾公司用GS-FLX（454 Life Sciences）測序系統(tǒng)進(jìn)行測序。

1.4 生物信息學(xué)分析

對測序得到的原始數(shù)據(jù)根據(jù)Index完全匹配統(tǒng)計每個樣品中的有效序列的數(shù)量，對有效序列整理和質(zhì)量控制，修剪、去除低質(zhì)量（堿基模糊大于1、引物堿基含2 個以上錯配、單堿基高度重復(fù)超過6、非特異性擴(kuò)增、序列長度在200～1 000 bp外的序列）的序列，最終獲得供精準(zhǔn)分析的優(yōu)質(zhì)序列。依據(jù)序列相似性，用軟件Qiime調(diào)用uclust[18]對所有樣品的優(yōu)質(zhì)序列按97%的相似度進(jìn)行聚類，將序列歸為1 個操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU），去除無法分類的OTU，選取每一類中最長的序列作為OTU的代表序列。采用BLAST的方法在Silva數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對注釋。

1.5 PCA分析

通過PCA可以觀察個體或群體間的差異。將細(xì)菌豐度數(shù)據(jù)錄入SPSS 19.0軟件，根據(jù)相關(guān)系數(shù)列出相關(guān)矩陣，求出特征根及其相應(yīng)的特征向量，從特征根中選出幾個較大的特征根及其特征向量，對累積貢獻(xiàn)率在85%以上的前幾個成分作為主成分進(jìn)行分析[13,19]，找出主要貢獻(xiàn)的細(xì)菌類群。課題組進(jìn)一步利用SPSS 19.0軟件做主成分分析，對3 個樣品屬水平上的分類及物種豐度進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 3 個大曲樣品細(xì)菌物種和群落結(jié)構(gòu)分析

通過454 FLX+平臺測序技術(shù)檢測醬香型高溫大曲中微生物細(xì)胞內(nèi)特定遺傳物質(zhì)，原核微生物16S rDNA這些遺傳物質(zhì)都具有一定的進(jìn)化保守性，保守區(qū)序列為所有同類微生物所共有，在保守序列之間存在由于進(jìn)化造成的物種之間序列差異的可變區(qū)域，因此通過這些序列可變區(qū)域的測定和對比，研究醬香型高溫大曲中細(xì)菌物種和群落結(jié)構(gòu)，結(jié)果見表1。

表1 大曲樣品中細(xì)菌的種群及相對含量Table 1 Bacterial populations and relative contents in Daqu %

由表1可知，利用高通量測序技術(shù)的16S V3～V5區(qū)測序技術(shù)，對3 種大曲的細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)進(jìn)行了鑒定和解析。從3 個大曲樣品檢測出6 個門49 個屬細(xì)菌，主要厚壁菌門為主，共有細(xì)菌種群為：高溫放線菌屬（Thermoactinomyces）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、Scopulibacillus、Thermoactinomycetaceae_G、Leuconostocaceae_G、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、Planococcaceae_G、乳桿菌屬（Lactobacillus）、乳球菌屬（Lactococcus）、Enterococcaceae_G、直絲菌屬（Planifilum）、Streptomycetaceae_G、紅球菌屬（Rhodococcus）、糖多孢菌（Saccharopolyspora）、鏈霉菌屬（Streptomyces）、Actinopolysporaceae_G、短桿菌屬（Brevibacterium）、Enterobacteriaceae_G、歐文氏菌屬（Erwinia）、不動桿菌屬（Acinetobacter）、Streptophyta_F_G。其中MT01主要以高溫放線菌屬（Thermoactinomyces）34.40%、芽孢桿菌屬（Bacillus） 31.40%、Scopulibacillus 13.60%為主，占總含量的79.40%，ZJ01主要以高溫放線菌屬（Thermoactinomyces）34.80%、芽孢桿菌屬（Bacillus）49.00%為主，占總含量的84.80%，ZX01以高溫放線菌屬（Thermoactinomyces）66.10%為主，它們的總和占細(xì)菌總量的80%以上。表明它們是大曲細(xì)菌微生物區(qū)系中的核心功能細(xì)菌微生物類群，通過長期馴化和發(fā)展，逐漸形成了以高溫放線菌為主的特定的細(xì)菌微生物種群結(jié)構(gòu)。

從整體來看MT01樣品中兩種優(yōu)勢菌屬高溫放線菌屬（Thermoactinomyces）與芽孢桿菌屬（Bacillus）約各占總量的1/3，其他細(xì)菌屬約占1/3，微生物相對豐度分布均勻。ZX01樣品中高溫放線菌屬（Thermoactinomyces）占總量的2/3，其他細(xì)菌屬占1/3。ZJ01樣品中芽孢桿菌屬（Bacillus）占總量的一半，高溫放線菌屬（Thermoactinomyces）占1/3。3 個樣品的細(xì)菌種群分布存在明顯的差異，優(yōu)勢菌屬的含量差異很大。

在屬的層次下對3 個樣品的物種進(jìn)行序列數(shù)統(tǒng)計并對屬的物種豐度統(tǒng)計見表1。從種群類別到相對豐度的對比分析來看，MT01樣品的細(xì)菌物種豐富，種類繁多，含量均衡。ZJ01樣品中細(xì)菌物種比較豐富，優(yōu)勢菌屬的含量較MT01樣品有較大差異。ZX01樣品細(xì)菌物種較少，含量差異很大。

從醬香型大曲制作工藝分析，其突出特點是高溫制曲，品溫在60 ℃以上，最高可達(dá)到65 ℃，制曲時間長，在曲房發(fā)酵培養(yǎng)40 d左右，并貯藏3 個月以上。制曲前期原料加水后，曲塊水分、氧氣充足，溫度適宜，此時細(xì)菌、酵母菌和霉菌均呈現(xiàn)一定程度的增長，同時隨著濕度增加，孢子開始萌芽[20-22]；升溫期曲塊入房培養(yǎng)2 d左右，品溫升至45 ℃，濕度也有所改變，各類微生物已適應(yīng)環(huán)境，細(xì)菌生長繁殖開始活躍，并且增長幅度較大，可達(dá)100～1 000 倍[23]；培養(yǎng)5～6 d后，曲塊品溫升至50 ℃以上。高溫環(huán)境影響了微生物的生長，大部分微生物數(shù)量從第3～4天開始下降，而耐高溫芽孢桿菌在該環(huán)境下數(shù)量有所增加[24]，細(xì)菌中耐熱菌株增加，不耐熱菌株減少，細(xì)菌總數(shù)下降。高溫期，在品溫維持55 ℃時，大多數(shù)微生物不能生長，各類微生物由于耐熱性不同，其下降趨勢也有所差別，在這個溫度下的固態(tài)發(fā)酵實驗發(fā)現(xiàn)，部分芽孢桿菌出現(xiàn)代謝產(chǎn)酸的現(xiàn)象。傳統(tǒng)分析認(rèn)為細(xì)菌群體主要由芽孢桿菌組成，呈緩慢下降的趨勢，但在高通量測序分析發(fā)現(xiàn)高溫放線菌與芽孢桿菌一樣為主要的優(yōu)勢菌群，甚至在發(fā)酵溫度超過60 ℃時，其數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于芽孢桿菌；降溫期，溫度降至45 ℃之前，微生物總數(shù)依然下降。當(dāng)溫度降到45 ℃以下時，存活的微生物活性提高，數(shù)量明顯增加。此階段大多數(shù)的芽孢細(xì)菌在此時形成了芽孢，乳酸菌數(shù)量下降[25]；成熟期，當(dāng)品溫逐漸接近環(huán)境溫度時，微生物的死亡率與繁殖率基本平衡，數(shù)量趨于穩(wěn)定。當(dāng)曲塊水分降到15%以下時，各類微生物數(shù)量變化越來越慢，最后基本保持穩(wěn)定。

從地理位置分析來看黔北赤水河畔的茅臺鎮(zhèn)地區(qū)生產(chǎn)的醬香大曲的優(yōu)勢微生物豐度較高，這與歷史上長期進(jìn)行醬香型白酒生產(chǎn)對于微生物積累和馴化有關(guān)。但整體看來，ZJ01與MT01的微生物多樣性更相近，這與ZJ01在母曲、生產(chǎn)工藝等與MT01相同有關(guān)。

通過高通量測序?qū)?xì)菌多樣性的分析，結(jié)合制曲工藝特點，不難分析出制曲各個階段的控制對微生物菌群的影響；并且還可以通過特定的培養(yǎng)方法（如高溫放線菌的培養(yǎng)方法、乳桿菌的培養(yǎng)方法），分離篩選除芽孢桿菌之外的優(yōu)勢菌，分析其功能性，為解釋傳統(tǒng)高溫大曲的發(fā)酵機(jī)理和微生物的代謝提供科學(xué)依據(jù)。

2.2 3 個大曲樣品種群主成分分析

表2 主成分的特征值及其貢獻(xiàn)率Table 2 Eigenvalues and contribution rates of principal components

利用軟件SPSS 19.0對3個大曲樣品的49 個屬的細(xì)菌進(jìn)行主成分分析，得到主成分的特征值和貢獻(xiàn)率，如表2所示。主成分確定一般根據(jù)因子的累計貢獻(xiàn)率、特征值的大小以及碎石圖拐點的變化趨勢等因素來確定[15]。根據(jù)表2，前2 個主成分特征值分別為32.55、16.51，方差貢獻(xiàn)率分別為66.43%、33.57%，其累計貢獻(xiàn)率達(dá)到100%，根據(jù)主成分分析一般提取主成分包含85%以上信息原理，前2 個主成分包含了49 個屬的絕大部分信息；根據(jù)圖1，前2 個主成分折線趨勢很陡，在第3個主成分開始折線開始變的平緩；由此可以確定取前2 個主成分說明49 個屬物種相對含量的變化趨勢，根據(jù)貢獻(xiàn)率的大小，依次定為第1、2主成分。

表3 主成分載荷矩陣Table 3 Factor load matrix of principal components

由表3可知，第1主成分反映的指標(biāo)主要有Thermoactinomyces、Bacillus、Leuconostocaceae_G、Bacillaceae_G、Lactobacillales_F_G、Planococcaceae_G、Lactobacillus、Leuconostoc、Lactococcus、Enterococcaceae_G、Weissella、Sporanaerobacter、 Planifilum、Lactobacillaceae_G、Streptomycetaceae_G、Corynebacterium、Rhodococcus、Saccharopolyspora、Actinopolysporaceae_G、Brevibacterium、Micrococcaceae_G、Sciscionella、Enterobacteriaceae_G、Caulobacteraceae_G、Acinetobacter、Aeromonadaceae_G、Acetobacter、Streptophyta_F_G、Leptotrichiaceae_G，主要指向厚壁菌門、放線菌門、變形菌門、梭桿菌門；第2主成分反映的指標(biāo)主要有Scopulibacillus、Thermoactinomycetacea_G、Sporolactobacillus、Bacillus、Virgibacillus、Bacillales_F_G、Nocardiopsaceae_G、Thiococcus、Rhodospirillales_F_G、Pseudomonadaceae_G、Sphingobacteriales_F_G，主要指向厚壁菌門、變形菌門。因此可以初步判斷以上細(xì)菌屬為大曲的主要細(xì)菌類群，主要指向厚壁菌門、變形菌門。

圖1 主成分分析碎石圖Fig.1 Scree plot of principal components

通過圖1主成分分析方法對3 種大曲的物種和群落結(jié)構(gòu)關(guān)系的解析，綜合圖2、3可知，3 個樣品的位置都在第一象限，距離相差不大。影響3 個樣品的細(xì)菌種群主要集中在第一象限，離原點較遠(yuǎn)的位置，按影響力大小依次為葡萄球菌屬（Staphylococcus）、Thermoactinomycetaceae_G、棒狀桿菌屬Corynebacterium、魏斯氏菌屬（Weissella）、Leuconostocaceae_G、乳球菌屬（Lactococcus）、不動桿菌屬（Acinetobacter）、Caulobacteraceae，為影響醬香大曲種群結(jié)構(gòu)的主要細(xì)菌種群。發(fā)現(xiàn)棒狀桿菌屬（Corynebacterium）、魏斯氏菌屬（Weissella）是影響樣品MT01與ZJ01距離最近，ZX01相對距離較遠(yuǎn)的細(xì)菌類群。

圖2 3 個大曲樣品的主成分散點圖Fig.2 Scattering plot of principal components for three Daqu

圖3 49 個屬的主成分散點圖Fig.3 Scattering plot of principal components for 49 genera

采用主成分分析的方法不僅能夠客觀地分析出大曲的主要類群，而且通過圖2、3可以直觀詳細(xì)地看出影響各個樣品差距的微生物類群及類群的影響力。這進(jìn)一步說明了MT01大曲在經(jīng)過長時間的生產(chǎn)過程中，微生物充分馴化，成為最適應(yīng)醬香型白酒釀造的微生物生態(tài)系統(tǒng)，各類群達(dá)到一定的平衡，其種群、組成結(jié)構(gòu)決定了最終醬香型白酒形成的風(fēng)格。

ZX01的產(chǎn)地與生產(chǎn)工藝與MT01相同，同屬于茅臺鎮(zhèn)赤水河谷，ZX01的大曲生產(chǎn)是采用醬香型高溫大曲制作工藝，由于地理位置與MT01生產(chǎn)車間的位置相差不多，其在生產(chǎn)環(huán)境、氣候、用水與MT01高溫大曲生產(chǎn)非常相似，但是大曲樣品中的微生物多樣性仍存在較大差異。

ZJ01的生產(chǎn)是沿襲了正宗的MT01工藝，酒廠前身是始建于1975年的“貴州茅臺酒易地試驗廠”，建廠初期使用了MT01大曲曲房的建筑材料、生產(chǎn)原、輔料，母曲，生產(chǎn)工具等。雖然ZJ01的生產(chǎn)地理位置不在赤水河附近，也有不同的氣候條件，但亦可生產(chǎn)與MT01微生物多樣性相近的大曲。

綜上所述，在不同地理位置、不同氣候條件時，可以采用人工馴化生產(chǎn)環(huán)境，強化培養(yǎng)，選擇生產(chǎn)原、輔料等辦法，使用MT01大曲作為母曲，增加優(yōu)勢菌數(shù)量，可以使一般醬香型大曲微生物種群類別及數(shù)量上盡量接近MT01大曲的微生物豐富度和均勻度。

3 結(jié) 論

采用454 FLX+平臺進(jìn)行測序，樣品中所測微生物為細(xì)菌，測序片段為16S V3～V5區(qū)，檢測3 個大曲中的細(xì)菌類群組成，共檢測出細(xì)菌屬49 種，包含厚壁菌門、放線菌門、變形菌門、擬桿菌門、藍(lán)藻門、梭桿菌門。同時所有樣品的優(yōu)質(zhì)序列按97%的相似度進(jìn)行聚類，計算這些細(xì)菌類群的相對含量，利用OTU分析，發(fā)現(xiàn)厚壁菌門含量比較高，高溫放線菌屬（Thermoactinomyces）、芽孢桿菌屬（Bacillus）占總含量的60%以上。

對檢測出的49 種細(xì)菌屬進(jìn)行主成分分析，發(fā)現(xiàn)葡萄球菌屬（Staphylococcus）、Thermoactinomycetaceae_G、棒狀桿菌屬（Corynebacterium）、魏斯氏菌屬（Weissella）、Leuconostocaceae_G、乳球菌屬（Lactococcus）、不動桿菌屬（Acinetobacter）、Caulobacteraceae_G，為影響醬香大曲的主要細(xì)菌種群。

對3 個大曲樣本進(jìn)行主成分分析，MT01以高溫放線菌屬（Thermoactinomyces）34.40%、芽孢桿菌屬（Bacillus）31.40%、Scopulibacillus 13.60%為主，占總含量的79.40%，ZJ01以高溫放線菌屬（Thermoactinomyces）34.80%、芽孢桿菌屬Bacillus 49.00%為主，占總含量的84.80%，ZX01以高溫放線菌屬（Thermoactinomyces）66.10%為主；主成分分析發(fā)現(xiàn)棒狀桿菌屬（Corynebacterium）、魏斯氏菌屬（Weissella）是影響3 個樣品的細(xì)菌類群。

本研究對3 個大曲樣本的細(xì)菌類群結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定分析，對大曲中的細(xì)菌類群有一定的認(rèn)識，同時利用主成分分析法對大曲細(xì)菌類群對大曲微生物多樣性的影響進(jìn)行了分析，為今后利用大曲微生物區(qū)系評價大曲質(zhì)量也提供了一種新的方法。但對于大曲中微生物數(shù)據(jù)庫的完善還需進(jìn)一步摸索研究。

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Comparative Analysis of Bacterial Populations of Three Maotai-Flavored Daqus in Zunyi, Guizhou

WANG Xiaodan1,2,3, BAN Shidong1,2, ZHOU Hongxiang1,3, HU Baodong1,3, QIU Shuyi1,3,*
(1. Guizhou Provincial Key Laboratory of Fermentation Engineering and Biological Pharmacy, Guizhou University, Guiyang 550025, China; 2. College of Life Sciences, Guizhou University, Guiyang 550025, China; 3. School of Liquor-Making and Food Engineering, Guizhou University, Guiyang 550025, China)

Bacterial populations of three samples of Maotai-flavored Daqu in Zunyi， Guizhou province were studied. Principal component analysis was used to evaluate the relationship between bacterial population and Daqu. The 454 FLX+ platform was used to sequence the 16S rDNA gene V3-V5 region of the bacteria. The high quality sequences were clustered by similarity （0.97）， and used to calculate the relative content of bacteria. Through principal component analysis， we analyzed the bacterial population of Daqu. Results showed that 6 phyla and 49 genera were detected from three samples，and the Firmicutes were the most dominant phylum. Thermoactinomyce (34.40%), Bacillus (31.40%） and Scopulibacillus (13.60%） were dominant in Daqu MT01， accounting for 79.40% of the total bacterial population. Thermoactinomyce (34.80%) and Bacillus (49.00%） were dominant in Daqu ZJ01， accounting for 84.80%. Only Thermoactinomyce (66.10%） was dominant in Daqu ZX01. Principal component analysis （PCA） suggested that MT01 and ZJ01 were the nearest in distance，and ZX01 was a little far. This study can provide a theoretical basis for the judgment of Daqu quality.

Maotai-flavored Daqu； bacteria； high-throughput sequence； population； principal component analysis

10.7506/spkx1002-6630-201607021

Q938.15

A

1002-6630（2016）07-0110-07

王曉丹, 班世棟, 周鴻翔, 等. 貴州省遵義地區(qū)3 個醬香型大曲細(xì)菌群落的比較分析[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(7): 110-116. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201607021. http://www.spkx.net.cn

WANG Xiaodan, BAN Shidong, ZHOU Hongxiang, et al. Comparative analysis of bacterial populations of three Maotaiflavored Daqus in Zunyi， Guizhou［J］. Food Science， 2016， 37（7）： 110-116. （in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/ spkx1002-6630-201607021. http://www.spkx.net.cn

2015-11-05

科技部科技支撐計劃項目（2011BAC06B12）；貴州省科技廳工業(yè)攻關(guān)項目（黔科合GZ字[2014]3012）；貴州省科技廳重大專項計劃項目（黔科合重大專項字[2013]6009號）；貴州省省校合作計劃項目（黔科合LH字[ 2014]7672）

王曉丹（1980—），女，實驗師，博士研究生，研究方向為應(yīng)用生物技術(shù)。E-mail：wangxiaodan0516@126.com

*通信作者：邱樹毅（1963—），男，教授，博士，研究方向為發(fā)酵工程。E-mail：syqiu@gzu.edu.cn