徐義剛 邱索平 王 昱 高會(huì)江 高慎陽(yáng)

(1.海南出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，海南 ?？?570311；2. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150001；3. 從化出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣東 從化 510900；4. 重慶出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，重慶 404100；5. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所牛遺傳育種研究室，北京 100193；6. 遼寧醫(yī)學(xué)院畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧 錦州 121001)

?

基于vvhA基因檢測(cè)創(chuàng)傷弧菌實(shí)時(shí)熒光PCR方法的建立

徐義剛2邱索平3王 昱4高會(huì)江5高慎陽(yáng)6

(1.海南出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，海南 ?？?570311；2. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150001；3. 從化出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣東 從化 510900；4. 重慶出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，重慶 404100；5. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所牛遺傳育種研究室，北京 100193；6. 遼寧醫(yī)學(xué)院畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧 錦州 121001)

為建立創(chuàng)傷弧菌(VV)的快速檢測(cè)方法，根據(jù)vvhA基因序列設(shè)計(jì)合成引物和探針，建立實(shí)時(shí)熒光PCR方法。結(jié)果顯示：所建立的方法能特異擴(kuò)增出VV標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性菌株，而對(duì)其它14種菌株沒(méi)有擴(kuò)增；該方法的靈敏度為15 CFU/mL；穩(wěn)定性和重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果表明，同一樣品重復(fù)檢測(cè)4次Ct 值(循環(huán)閾值)的變異系數(shù)均小于2%；利用該檢測(cè)方法對(duì)采集的156份樣品進(jìn)行檢測(cè)，共計(jì)檢出2份VV陽(yáng)性樣品，與行標(biāo)法(SN/T 1870—2007)檢測(cè)結(jié)果一致。該檢測(cè)方法靈敏度高、特異性強(qiáng)，具有良好的實(shí)用性。

創(chuàng)傷弧菌；vvhA基因；實(shí)時(shí)熒光定量PCR

創(chuàng)傷弧菌(vibrio vulnificus，VV)是一種有莢膜的革蘭氏陰性菌，廣泛分布于蟹、蝦、牡蠣等水生動(dòng)物中，如果人類食用VV污染的食品會(huì)引發(fā)胃腸炎，嚴(yán)重時(shí)還會(huì)引發(fā)敗血癥[1-2]，病死率高達(dá)到50% 以上[3-4]，是對(duì)人類身體健康危害很?chē)?yán)重的一種食源性致病菌。近幾年來(lái)，中國(guó)沿海地區(qū)由VV感染引起的人類食物中毒事件頻繁發(fā)生[5-7]。所以，建立一種能夠快速、準(zhǔn)確檢測(cè)VV的方法刻不容緩。

實(shí)時(shí)熒光PCR方法由于靈敏度、特異性和精準(zhǔn)度都比較高，現(xiàn)今已成為病原體檢測(cè)的重要方法，并且發(fā)展迅速，在生命科學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域都得到了廣泛應(yīng)用[8]9-11。針對(duì)檢測(cè)靶基因的選擇，溶細(xì)胞素被認(rèn)為是VV感染的主要致病因子之一[9]，是由結(jié)構(gòu)基因vvhA編碼的一種細(xì)胞外蛋白質(zhì)，vvhA基因具有良好的種特異性和保守性[10-11]，因此本研究選擇vvhA基因作為檢測(cè)的靶基因，建立檢測(cè)VV的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，并確定反應(yīng)的最佳條件。為了提高VV的檢測(cè)效率和檢測(cè)的準(zhǔn)確度，本研究根據(jù)VV 的vvhA基因設(shè)計(jì)合成探針和引物，建立了檢測(cè)VV的實(shí)時(shí)熒光PCR方法，并對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，對(duì)方法的特異性、敏感性、穩(wěn)定性以及重復(fù)性進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，最終建立一種行之有效的檢測(cè)方法，旨在為快速準(zhǔn)確檢測(cè)VV提供有力的技術(shù)支持。與已有的相關(guān)報(bào)道對(duì)比，本研究有針對(duì)性的注重了引物和探針的設(shè)計(jì)，使檢測(cè)方法的特異性在整體上有所提高。

1 材料與方法

1.1 菌種及臨床樣品

創(chuàng)傷弧菌、霍亂弧菌、溶藻弧菌、空腸彎曲菌、志賀氏菌和金黃色葡萄球菌等14種常見(jiàn)的致病菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株：美國(guó)典型菌種保藏中心(ATCC)；

沙門(mén)氏菌：中國(guó)醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心(CMCC)；

156份水產(chǎn)品(包括海魚(yú)、鮑魚(yú)、泥螺、蝦、蟹、海水、蟶子、蛤蜊等)：來(lái)自于水產(chǎn)品養(yǎng)殖場(chǎng)和水產(chǎn)品流通市場(chǎng)。

1.2 試劑和儀器

增菌培養(yǎng)基BPW和細(xì)菌培養(yǎng)基：北京中科質(zhì)檢生物技術(shù)有限公司；

核酸提取試劑盒：北京天根生化科技有限公司；

Taq酶、MgCl2和dNTP：北京合生基因科技有限公司；

實(shí)時(shí)熒光PCR儀：7500型，美國(guó)ABI公司。

1.3 方法

1.3.1 引物和探針設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank中已經(jīng)發(fā)表的VVvvhA基因序列(KC821520.1) 進(jìn)行引物和探針的設(shè)計(jì)并且參考吳增輝[8]11-15的研究進(jìn)行設(shè)計(jì)。

引物： F: TGTTTATGGTGAGAACGGTGACA

R: TTCTTTATCTAGGCCCCAAACTTG

探針：Fam- CCGTTAACCGAACCACCCGCAA -TAMRA1.3.2 實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)模板的制備 將15種標(biāo)準(zhǔn)菌株分別接種到5 mL的增菌培養(yǎng)基中進(jìn)行增菌，在37 ℃下培養(yǎng)12 h，各取1 mL菌液提取細(xì)菌基因組DNA，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)的步驟進(jìn)行，核酸提取后放入-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩ＥR床樣品的細(xì)菌核酸的提取采用煮沸法進(jìn)行。

1.3.3 反應(yīng)體系中基本參數(shù)的優(yōu)化 對(duì)rTaq酶、Mg2+、dNTPs、引物、探針濃度進(jìn)行優(yōu)化。在Mg2+(25 mmol/μL) 用量范圍2～5 μL，以每0.5 μL遞增；在rTaq酶(5 U/μL) 用量范圍0.25～1.00 μL，以每0.25 μL遞增；在dNTP (2.5 mmol /μL )用量范圍1.0～3.0 μL，以每0.50 μL遞增；探針(20 μmol/μL)用量范圍0.1～0.5 μL，以每0.1 μL遞增；引物(10 pmol/μL)用量范圍0.5～1.0 μL，以每0.1 μL遞增；每個(gè)參數(shù)的用量重復(fù)3次，最后計(jì)算出Ct平均值，確定這5個(gè)反應(yīng)參數(shù)的最佳用量。

1.3.4 特異性檢測(cè)試驗(yàn) 采用試劑盒法提取1.1.1節(jié)中菌株的核酸作為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR 擴(kuò)增，評(píng)價(jià)試驗(yàn)檢測(cè)的特異性。

1.3.5 敏感性檢測(cè)試驗(yàn) 10倍梯度稀釋菌液并且按核酸提取試劑盒要求分別提取每級(jí)稀釋度細(xì)菌DNA，各取2.00 μL作為模板按優(yōu)化好的體系條件進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)。

1.3.6 穩(wěn)定性和重復(fù)性試驗(yàn) 取3個(gè)不同濃度的樣品作為模板進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)，每個(gè)濃度做3個(gè)平行，重復(fù)4次。收集數(shù)據(jù)，計(jì)算組內(nèi)、組間變異系數(shù)，評(píng)價(jià)試驗(yàn)的穩(wěn)定性和重復(fù)性。1.3.7 樣品檢測(cè) 將采集來(lái)的水海產(chǎn)品156份，經(jīng)過(guò)勻漿機(jī)研磨處理后，用營(yíng)養(yǎng)肉湯在37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)6 h，利用煮沸法提取核酸，然后利用實(shí)時(shí)熒光PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果用行標(biāo)法(SN/T 1870—2007)進(jìn)行再一次的檢驗(yàn)，驗(yàn)證所建立的實(shí)時(shí)熒光PCR方法檢測(cè)的實(shí)用性和準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果與分析

2.1 VV實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法的建立

rTaq酶、Mg2+、dNTPs、引物、探針濃度直接影響實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)的擴(kuò)增效果，尤其是Mg2+的濃度是影響Taq酶活性發(fā)揮的主要因素，濃度過(guò)高會(huì)增加實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)的非特異性擴(kuò)增，濃度過(guò)低會(huì)影響Taq酶活性發(fā)揮。所以，PCR反應(yīng)體系中每種物質(zhì)濃度的選擇都是非常重要的。經(jīng)過(guò)反應(yīng)體系的優(yōu)化建立如下反應(yīng)體系：rTaq酶(5 U/μL)0.50 μL，Mg2+(25 mmol)2.50 μL，dNTP(2.5 mmol)2.00 μL，探針(20 μmol/μL)0.30 μL，VVF/VVR(10 pmol/μL)1.00 μL，DNA 模板2.00 μL，DEPC水補(bǔ)充至25 μL。具體的反應(yīng)過(guò)程：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性3 s，60 ℃退火40 s(此步驟收集熒光信號(hào))，72 ℃延伸30 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。

1. VV 2. 陰性對(duì)照

Figure 1 Determine the reaction system and the reaction conditions of a dual real-time PCR

2.2 特異性檢測(cè)試驗(yàn)

應(yīng)用建立的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法對(duì)15株標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行擴(kuò)增試驗(yàn)顯示，只有VV出現(xiàn)了特異性的擴(kuò)增曲線，其他菌株和空白對(duì)照都沒(méi)有出現(xiàn)特異性熒光信號(hào)。說(shuō)明本研究所建立的檢測(cè)方法具有很好的特異性(見(jiàn)圖2)。

2.3 敏感性檢測(cè)試驗(yàn)

10倍梯度稀釋菌液并且按核酸提取試劑盒要求分別提取每級(jí)稀釋度細(xì)菌DNA，各取2.00 μL 作為模板按優(yōu)化好的體系條件進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果顯示，菌體濃度在1.50×101CFU/mL時(shí)依然可以出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，在其濃度以下都沒(méi)有出現(xiàn)特異性熒光信號(hào)(圖3)，因此，本研究所建立的檢測(cè)方法的靈敏度為15 CFU/mL，表明該方法具有很高的靈敏度；本研究VV檢測(cè)的靈敏度與金玉娟等[12]和張晶等[13]建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)的靈敏度進(jìn)行比較，這3種實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法的靈敏度相當(dāng)，都具有較高的靈敏度。

圖2 VV實(shí)時(shí)熒光PCR特異性試驗(yàn)擴(kuò)增曲線

Figure 2 Specificity test curve of a dual real-time PCR

1. VV 2～15. 腸侵襲性大腸桿菌、霍亂弧菌、空腸彎曲菌、金黃色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌、變形桿菌、阪崎腸桿菌、單增李斯特氏菌、志賀菌、副溶血弧菌、產(chǎn)腸毒素大腸桿菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、腸出血性大腸埃希菌O157:H7、粘質(zhì)沙雷菌1～7. 菌體濃度分別為1.5×106，1.5×105，1.5×104，1.5×103，1.5×102，1.5×101，1.5×100CFU/mL

圖3 VV菌液稀釋法實(shí)時(shí)熒光PCR靈敏度試驗(yàn)擴(kuò)增曲線

Figure 3 Sensitivity test curve of a dual real-time PCR

2.4 穩(wěn)定性和重復(fù)性試驗(yàn)

選取1.50×107，1.50×105，1.50×103CFU/mL 3個(gè)濃度的陽(yáng)性模板進(jìn)行組內(nèi)和組間重復(fù)性試驗(yàn)，計(jì)算出組內(nèi)和組間CT 值的變異系數(shù)分別為0.34%～1.05%，0.38%～0.76% (表1)，均小于2%，表明所建立的方法具有比較好的穩(wěn)定性和重復(fù)性。

表1 穩(wěn)定性和重復(fù)性試驗(yàn)

2.5 臨床樣品的檢測(cè)試驗(yàn)

分別對(duì)156份采集來(lái)的樣本用本研究建立的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法和行標(biāo)法(SN/T 1870—2007)進(jìn)行檢測(cè)，檢出2份陽(yáng)性樣本，兩種方法所得的檢測(cè)結(jié)果的一致(圖4、5)，表明該方法具有很強(qiáng)的應(yīng)用性。

3 結(jié)論

本研究所建立的基于vvhA基因特異性檢測(cè)VV實(shí)時(shí)熒光PCR方法，靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好，具有良好的實(shí)用性，適合在食品微生物檢測(cè)部門(mén)推廣應(yīng)用。該方法與普通PCR方法相比，提高了檢測(cè)的靈敏度和特異性，并且不需要對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行后處理，有效地解決了PCR產(chǎn)物易污染造成的假陽(yáng)性和不能準(zhǔn)確定量的問(wèn)題。該方法的建立為VV的快速檢測(cè)提供了新的技術(shù)手段。

圖4 VV實(shí)時(shí)熒光PCR對(duì)樣品檢測(cè)試驗(yàn)擴(kuò)增曲線

圖5 VV行標(biāo)法對(duì)樣品檢測(cè)試驗(yàn)擴(kuò)增曲線

[1] 毛晶晶, 佘銳萍, 曹杰, 等. 某規(guī)模化奶牛場(chǎng)STEC和創(chuàng)傷弧菌流行情況調(diào)查[J]. 中國(guó)奶牛, 2013, 3(1): 1-3.

[2] BISHARAT N, COHEN D I, HARDING R M, et al. HybridVibriovulnificus[J]. Emerging Infectious Diseases, 2005, 11(1): 30-35.

[3] 潘軍航, 梅玲玲, 朱敏, 等. 舟山市售牡蠣中創(chuàng)傷弧菌污染的定量分析[J]. 中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志, 2009, 19(12): 2 760-2 761.

[4] 李萌立, 李忠海, 李節(jié), 等. 量子點(diǎn)熒光探針技術(shù)在食源性致病菌檢測(cè)中的應(yīng)用[J]. 食品與機(jī)械, 2013, 29(5): 241-244.

[5] 姜英輝, 房保海, 雷質(zhì)文, 等. 細(xì)菌活的非可培養(yǎng)狀態(tài)的分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 食品科學(xué), 2011, 32(15): 308-311.

[6] 楊文鴿, 孫翠玲, 潘云娣, 等. 水產(chǎn)品中致病微生物的快速檢測(cè)方法[J]. 中國(guó)食品學(xué)報(bào), 2006, 6(1): 402-406.

[7] 徐義剛, 李蘇龍, 楊君宏, 等. 水產(chǎn)品中創(chuàng)傷弧菌DNA環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)方法的建立及初步應(yīng)用[J]. 中國(guó)生物工程雜志, 2010, 30(6): 96-102.

[8] 吳增輝. 基于vvhA基因TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR快速檢測(cè)創(chuàng)傷弧菌的研究[D]. 杭州: 浙江大學(xué), 2007.

[9] 張慧, 鄭曉東, 蔣侃, 等. 實(shí)時(shí)熒光PCR法快速檢測(cè)耐熱霉菌費(fèi)氏新薩托菌[J]. 食品與機(jī)械, 2013, 29(3): 79-82.

[10] CHUNG P H, CHUSNG S K, TSANG T, et al. Cutaneous injury andVibriovulnificusinfection [J]. Emerg Infect Dis, 2006, 12(8): 1 302-1 303.

[11] PANICKER G, BEJ A K. Real-time PCR detection ofVibriovulnificusin oysters:comparison of oligonucleotide primers and probes targetingvvhA[J]. Appl Environ Microbiol, 2005, 71(10): 5 702-5 709.

[12] 金玉娟, 甘莉萍, 楊慧, 等. 雙重實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測(cè)副溶血性弧菌和創(chuàng)傷弧菌方法的建立[J]. 熱帶醫(yī)學(xué)雜志, 2014, 14(10): 1 296-1 302.

[13] 張晶, 周勇, 陶霞, 等. 創(chuàng)傷弧菌PMA RTi-PCR檢測(cè)技術(shù)的建立[J]. 中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào), 2013, 29(1): 54-58.

Establishment of a quantitative real-time PCR for detecting vvhA gene in Vibrio vulnificus

XUYi-gang2QIUSuo-ping3WANGYu4GAOHui-jiang5GAOShen-yang6

(1.AnimalQuarantineLab,Inspection&QuarantineTechnologyCenterofHainanEntry-ExitInspection&QuarantineBureau,Haikou,Hainan570311,China; 2.CollegeofVeterinaryMedicine,NortheastAgriculturalUniversity,Harbin,Heilongjinag150001,China; 3.ConghuaEntry-ExitInspection&QuarantineBureau,Conghua,Guangdong510900,China; 4.AnimalQuarantineLab,Inspection&QuarantineTechnologyCenterofChongqingEntry-ExitInspection&QuarantineBureau,Chongqing404100,China; 5.LaboratoryofBovineGeneticsandBreeding,InstituteofAnimalScience,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100193,China; 6.DepartmentofAnimalHusbandry&VeterinaryMedicine,LiaoningMedicalUniversity,Jinzhou,Liaoning121001,China)

To establish a rapid assay forVibriovulnificus(V.vulnificus) detection, a quantitative real-time PCR (qRT-PCR) method was developed targetingvvhAgene ofV.vulnificus. The results showed that the tests for 15 strains of different bacteria by using this method, only the ones ofV.vulnificuswere positive, indicating high specificity of qRT-PCR. Moreover, the sensitivity of this specific method was 15 CFU/mL. Further stability and reproducibility test results showed that the coefficient of variation of Ct values of four duplicates were less than 2%. In addition, a total 2 positive samples forV.vulnificuswere detected from 156 clinical samples by this method, and the results were in accordance with those by SN/T 1870-2007 standard detections. Therefore, the qRT-PCR method provides a novel rapid and sensitive detection method forV.vulnificusinfection.

vvhAgene; quantitative real-time PCR

海南省社會(huì)發(fā)展科技專項(xiàng)(編號(hào)：2015SF29)；國(guó)家質(zhì)檢總局科技項(xiàng)目(編號(hào)：2013IK031，2013IK051，2015IK089)；重慶市科技計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)：cstc2014yykfA80017)；海南省應(yīng)用技術(shù)研究與開(kāi)發(fā)專項(xiàng)項(xiàng)目(編號(hào)：ZDXM20130025)；廣東檢驗(yàn)檢疫局科技計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)：2013GDK04，2015GDK53)

李丹丹，女，海南出入境檢驗(yàn)檢疫局高級(jí)獸醫(yī)師，博士。

徐義剛(1978-)，男，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)教授，博士。

E-mail: 108074182@qq.com

2016-01-06