王滿生曾新安 熊夏宇 戴求仲

(1. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所，湖南 長沙 410205；2. 華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510640；3. 湖南省畜牧獸醫(yī)研究所動(dòng)物營養(yǎng)與飼養(yǎng)技術(shù)研究室，湖南 長沙 410131)

?

油菜蜂花粉中粗黃酮提取物成分分析

王滿生1, 2曾新安2熊夏宇2戴求仲1, 3

(1. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所，湖南 長沙 410205；2. 華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510640；3. 湖南省畜牧獸醫(yī)研究所動(dòng)物營養(yǎng)與飼養(yǎng)技術(shù)研究室，湖南 長沙 410131)

為了明晰油菜蜂花粉中黃酮類物質(zhì)的組成及脈沖電場輔助提取效果，試驗(yàn)采用TLC—DPPH和HPLC等方法對油菜蜂花粉的乙醇提取物及其酸解產(chǎn)物進(jìn)行了詳細(xì)的組分分析。結(jié)果表明，油菜蜂花粉的乙醇提取物中槲皮素和山奈酚因含量過低而未能檢出，但該提取物經(jīng)酸水解后，則會形成大量槲皮素和山奈酚，故可初步推斷油菜蜂花粉中的黃酮類化合物主要以黃酮苷的形式存在。未經(jīng)脈沖電場破壁處理的蜂花粉乙醇提取物的酸解物中，槲皮素含量為764.39 μg/g，山奈酚含量為1 647.97 μg/g，而經(jīng)破壁處理后，槲皮素含量達(dá)867.93 μg/g，對比提高了13.55%，山奈酚含量達(dá)1 924.03 μg/g，對比提高了16.75%。該結(jié)果充分證明了脈沖電場預(yù)處理對油菜蜂花粉細(xì)胞具有良好的破壁效果。

油菜蜂花粉；黃酮類化合物；脈沖電場；薄層色譜；破壁

蜂花粉中黃酮類化合物種類繁多，含量豐富。目前在蜂花粉中發(fā)現(xiàn)的黃酮類化合物有：柚皮素、異鼠李素、山奈酚、槲皮素、原花青素等[1]。近年油菜蜂花粉中黃酮類物質(zhì)成分研究得到了廣泛關(guān)注。楊潔等[2]利用HPLC—DAD和HPLC—MS技術(shù)對從油菜蜂花粉得到的提取物進(jìn)行了定性分析，證實(shí)油菜蜂花粉中黃酮類物質(zhì)主要以山奈酚和槲皮素的形式存在，其余黃酮類物質(zhì)含量很少[3-4]。另外，楊必成等[5]采用HPLC—UV法測定了油菜蜂花粉中各黃酮類物質(zhì)含量，發(fā)現(xiàn)槲皮素和山奈酚含量占總黃酮含量的97.6%。

薄層色譜法[6-7](Thin layer chromatography, TLC)屬于吸附薄層色譜分離法，混合物中各成分對固定相的吸附能力不同，當(dāng)流動(dòng)相流過固定相時(shí)，混合物中各成分在流動(dòng)相和固定相中不斷循環(huán)重復(fù)吸附、解吸附過程，從而實(shí)現(xiàn)快速分離混合物中各成分的目的。TLC—DPPH將薄層色譜法和抗氧化活性測定合二為一，是一種快速篩選生物活性物質(zhì)的方法[8]。它利用薄層色譜法將混合物各成分分離，再噴灑DPPH溶液顯色，薄層板上呈黃色的區(qū)域?yàn)榫哂星宄杂苫钚缘牟课?，而呈紫色的區(qū)域?yàn)榉腔钚圆糠?。TLC—DPPH法具有快捷、直觀、操作方便、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于篩選天然提取物中具有清除自由基或抗氧化活性的化合物[9]。郭金鳳等[10]采用TLC—DPPH法篩選榆葉合葉子中的抗氧化活性成分，活性部位斑點(diǎn)呈黃色，并通過展開斑點(diǎn)大小比較了各成分的抗氧化活性。Chaaib F等[11]利用TLC—DPPH法確定了美國崖椒根皮的二氯甲烷提取物中的抗氧化活性成分。

目前，油菜蜂花粉中黃酮類物質(zhì)均采用傳統(tǒng)的方法進(jìn)行輔助提取，例如超聲波輔助提取[12]、生物酶法發(fā)酵輔助提取[13]、溫差破壁輔助提取[14]等。而采用脈沖電場這一新興技術(shù)輔助提取油菜蜂花粉中黃酮類物質(zhì)還未見諸報(bào)道，其提取物中黃酮類物質(zhì)成分的研究亦鮮有報(bào)道。本試驗(yàn)擬采用脈沖電場輔助提取黃酮類物質(zhì)，通過TLC—DPPH篩選提取物中具有抗氧化活性的主要成分，并利用HPLC法定量分析油菜蜂花粉中兩種主要黃酮類物質(zhì)——槲皮素和山奈酚的含量，以期為油菜蜂花粉及其相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

油菜蜂花粉：江西省新建縣汪氏蜂蜜園；

甲醇：色譜純，RCI Labscan Co., Ltd；

無水槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品：BR級，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

山奈酚標(biāo)準(zhǔn)品：BR級，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

1,1-二苯基-2-苦肼自由基(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH)：美國Sigma-Aldrich公司；

無水乙醇、苯、甲酸、乙酸乙酯：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

硅膠板：100 mm×100 mm，青島譜科分離材料有限公司；

聚偏氟乙烯微孔濾膜：0.45 μm，上海興化凈化材料廠。

1.2 主要儀器設(shè)備

高效液相色譜儀，主要包括二元液相泵(型號1525，新加坡Waters公司)、自動(dòng)進(jìn)樣器(型號2707，新加坡Waters公司)、光電二極管陣列檢測器(型號2998，新加坡Waters公司)和電腦控制系統(tǒng)；

循環(huán)式水式真空泵：SHZ-D(Ⅲ)型，鞏義予華儀器有限責(zé)任公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：RE-2000B型，上海亞榮生化儀器廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品制備

(1) 油菜蜂花粉粗黃酮提取物的制備：準(zhǔn)確稱取均勻研細(xì)的油菜蜂花粉1.00 g，加入100 mL 80%乙醇溶液，經(jīng)磁力攪拌器充分?jǐn)嚢璧玫椒稚⒕鶆虻挠筒朔浠ǚ蹜覞嵋?。在前期試?yàn)的最優(yōu)工藝條件下，即電場強(qiáng)度28 kV/cm，脈沖數(shù)508，恒溫水浴回流溫度82 ℃，提取油菜蜂花粉中的總黃酮類物質(zhì)[15]。所得的油菜蜂花粉液經(jīng)4 500 r/min離心10 min，棄沉淀，取50 mL上清液于40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，減壓回收乙醇，直至大部分乙醇揮發(fā)，再經(jīng)真空冷凍干燥后，得到油菜蜂花粉乙醇提取物，將其命名為S2。取1.00 g未經(jīng)脈沖電場破壁處理的油菜花粉，在相同提取條件下提取油菜蜂花粉總黃酮類物質(zhì)，離心干燥后得到乙醇提取物，將其命名為S1。

(2) 乙醇提取物樣品溶液的制備：用甲醇將1.3.1(1)得到的乙醇提取物S1、S2溶解，分別轉(zhuǎn)移至50 mL棕色容量瓶中，加入甲醇定容后搖勻，經(jīng)孔徑為0.22 μm有機(jī)系針頭濾器過濾后，得到乙醇提取物樣品溶液，依次命名為E1和E2，溶液置于4 ℃冰箱備用。

(3) 酸水解樣品溶液的制備：將1.3.1(1)得到的乙醇提取物S1、S2分別置于100 mL圓底燒瓶中，加入5 mL體積分?jǐn)?shù)為25%的鹽酸溶液、30 mL甲醇，在80 ℃恒溫水浴鍋中水浴酸解1 h，迅速冷卻至室溫后將酸解液移至50 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容后搖勻，經(jīng)孔徑為0.22 μm有機(jī)系針頭濾器過濾后，得到酸水解樣品溶液，依次命名為A1和A2，溶液置于4 ℃冰箱備用。

1.3.2 TLC—DPPH法

(1) 點(diǎn)樣：在硅膠板(100 mm×100 mm)一端距離板邊1 cm處用鉛筆畫一條點(diǎn)樣線，取山奈酚和槲皮素混合標(biāo)準(zhǔn)液，乙醇提取物樣品溶液和酸水解樣品溶液各30 μL，分多次點(diǎn)在硅膠板上，點(diǎn)樣直徑不超過4 mm。點(diǎn)樣后，用吹風(fēng)機(jī)將硅膠板上樣品中的溶劑吹干。

(2) 展開：以體積比為5∶4∶1的苯—乙酸乙酯—甲酸混合液為展開劑，將硅膠板放入盛有展開劑的展開缸中展開。待展開至距離硅膠板頂端5 mm時(shí)，取出硅膠板，放入通風(fēng)櫥中晾干。

(3) 顯色：以0.2 mg/mL的DPPH甲醇溶液為顯色劑，將顯色劑均勻地噴灑到硅膠板上，然后把將硅膠板置于通風(fēng)櫥中晾干，觀察。測量各顯色點(diǎn)的遷移距離，計(jì)算各顯色點(diǎn)的相對遷移率Rf值。

1.3.3 HPLC法測定乙醇提取物中兩種黃酮類物質(zhì)含量

(1) 色譜條件：參照文獻(xiàn)[16]。色譜柱為SunFireTMC18柱(5 μm，4.6 mm×20 mm)，流動(dòng)相A為0.4%冰醋酸，流動(dòng)相B為甲醇，按表1進(jìn)行梯度洗脫，檢測波長λ為368 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量20 μL，流速為1.00 mL/min。

(2) 混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備：準(zhǔn)確稱取0.006 g山奈酚標(biāo)準(zhǔn)品和0.004 g槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解后，轉(zhuǎn)移至25 mL棕色容量瓶中，加甲醇定容后得濃度分別為240，160 μg/mL的山奈酚和槲皮素混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫條件

(3) 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：分別準(zhǔn)確移取混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液1，2，4，6，8 mL加入5個(gè)25 mL棕色容量瓶中，向每個(gè)棕色容量瓶加入甲醇定容，搖勻，經(jīng)孔徑為0.22 μm有機(jī)系針頭濾器過濾后得到一定梯度濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)品溶液按1.3.3(1)所述色譜條件，依次注入高效液相色譜儀中，測定山奈酚和槲皮素的峰面積，每個(gè)樣品平行測定3次，以標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

(4) 樣品中兩種黃酮類化合物含量測定：將1.3.1(2)得到的乙醇提取物樣品溶液和1.3.1(2)得到的酸水解樣品溶液按1.3.3(1)所述色譜條件進(jìn)行HPLC分析，測定山奈酚和槲皮素峰面積，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出相應(yīng)黃酮類物質(zhì)的含量。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理與分析 利用Origin 8.0 和Excel 2007對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析。

2 結(jié)果分析與討論

2.1 TLC—DPPH結(jié)果分析

由圖1可知，展開劑遷移距離為8.50 cm，樣品M只出現(xiàn)兩個(gè)黃色斑點(diǎn)：一個(gè)斑點(diǎn)面積大且顏色深，遷移距離為6.0 cm，Rf值為0.71；另一個(gè)斑點(diǎn)面積小且顏色淺，遷移距離為5.2 cm，Rf值為0.61。通常，自由基清除劑或抗氧化劑濃度越高，DPPH清除效果越好，斑點(diǎn)面積越大，黃色越深[17]。由于混合標(biāo)準(zhǔn)品中山奈酚濃度明顯高于槲皮素濃度，因此可斷定出Rf值為0.71處斑點(diǎn)為山奈酚，而Rf值為0.61的則是槲皮素。樣品E1和E2在Rf值為0.61和0.71處均呈紫色，沒有出現(xiàn)黃色斑點(diǎn)，說明未經(jīng)酸水解乙醇提取物中槲皮素和山奈酚含量很低；然而，E1和E2在Rf值為0.00～0.25處均出現(xiàn)淡黃色條帶，且E2淡黃色條帶面積大于E1淡黃色條帶面積，說明油菜蜂花粉乙醇提取物中含有清除DPPH自由基活性的成分，且采用脈沖電場技術(shù)輔助提取可提高油菜蜂花粉乙醇提取物中該活性成分的含量。樣品A1和A2為酸解物，與E1和E2相比，Rf值為0.00～0.25處出現(xiàn)淡黃色條帶面積減少，且在Rf值為0.61和Rf值為0.71處均出現(xiàn)黃色斑點(diǎn)，Rf值為0.71處黃色斑點(diǎn)面積更大，顏色更深，說明油菜蜂花粉中黃酮類物質(zhì)主要以糖苷形式存在，也說明乙醇提取物經(jīng)酸水解后生成了游離的槲皮素和山奈酚，且生成的山奈酚含量要高于槲皮素的含量；樣品A2在Rf值為0.61和Rf值為0.71處的黃色斑點(diǎn)比A1的更加明亮清晰，表明脈沖電場技術(shù)輔助提取可顯著提高酸解物中槲皮素和山奈酚含量。

2.2 兩類黃酮類化合物含量分析

2.2.1 系統(tǒng)適應(yīng)性分析 由圖2可知，槲皮素的保留時(shí)間約為36.62 min，山奈酚的保留時(shí)間約為38.20 min，混合標(biāo)準(zhǔn)品中的槲皮素和山奈酚完全分離，這說明采用該色譜條件能有效分離樣品中的槲皮素和山奈酚。

M. 混合標(biāo)準(zhǔn)品 A1. 未經(jīng)脈沖電場處理得到酸解物 A2. 脈沖電場處理得到酸解物 E1. 未經(jīng)脈沖電場處理的乙醇提取物 E2. 經(jīng)脈沖電場處理的乙醇提取物

圖1 各樣品的TLC—DPPH圖

Figure 1 The TLC—DPPH chromatograms of extract from rape pollen

Q. 槲皮素 K. 山奈酚

由圖3可知，E1和E2在36.62 min和38.20 min處未出現(xiàn)明顯的色譜峰，說明HPLC法未檢測出油菜蜂花粉乙醇提取物中的槲皮素和山奈酚，意味著乙醇提取物中槲皮素和山奈酚含量非常低；但E1和E2在31.12 min和32.86 min均出現(xiàn)色譜峰，有待于檢測定性。然而乙醇提取物經(jīng)酸水解后得到的A1和A2，如圖4所示，在36.62 min和38.20 min處都有尖銳的色譜峰，說明酸水解后A1和A2中槲皮素和山奈酚含量出現(xiàn)大幅提高；而A1和A2在31.12 min和32.86 min出現(xiàn)的色譜峰面積明顯小于E1和E2在此處色譜峰面積。由此可推斷出，油菜蜂花粉中的黃酮類化合物大部分以黃酮苷的形式存在，而黃酮苷類物質(zhì)又以槲皮素和山奈酚為苷元，經(jīng)酸水解后生成槲皮素和山奈酚。

對比圖3中色譜峰，可以發(fā)現(xiàn)E2在31.12 min和32.86 min處色譜峰的面積大于E1色譜峰的面積，表明經(jīng)脈沖電場處理后，乙醇提取物中黃酮苷類物質(zhì)含量提高，這意味著脈沖電場可有效促進(jìn)油菜蜂花粉中黃酮苷類物質(zhì)的溶出。由于E2中黃酮苷類物質(zhì)含量高于E1，經(jīng)酸水解后，A2中槲皮素和山奈酚含量明顯高于A1，所以在色譜圖4中A2在36.62 min和38.20 min處色譜峰的面積大于A1。

2.2.2 槲皮素和山奈酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線 對色譜峰面積與進(jìn)樣量進(jìn)行線性回歸，得到槲皮素標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y=3 839.3x-212 027，R2=0.999 7，表明進(jìn)樣量在121.6～972.8 ng時(shí)，槲皮素的含量與色譜峰面積具有良好的線性關(guān)系(見圖5)。山奈酚標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y=4 400.2x-347 846，R2=0.999 4，表明進(jìn)樣量在208～1 664 μg時(shí)，山奈酚的含量與色譜峰面積具有良好的線性關(guān)系(見圖6)。

圖3 油菜蜂花粉乙醇提取物未經(jīng)酸水解樣品溶液的HPLC色譜圖

圖4 油菜蜂花粉乙醇提取物酸水解樣品的HPLC色譜圖

圖5 槲皮素的標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖6 山奈酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2.3 樣品中槲皮素和山奈酚含量分析 油菜蜂花粉乙醇提取物中槲皮素和山奈酚含量很低，未能通過HPLC法檢出，采用脈沖電場輔助提取得到乙醇提取物，亦未能檢測出槲皮素和山奈酚。由表2可知，油菜蜂花粉乙醇提取物經(jīng)酸水解后，測得槲皮素含量為764.39 μg/g，山奈酚含量為1 647.97 μg/g。采用脈沖電場輔助提取得到乙醇提取物，經(jīng)酸水解后，測得槲皮素含量為867.93 μg/g，對比提高13.55%，山奈酚含量為1 924.03 μg/g，對比提高16.75%。

表2 樣品中槲皮素和山奈酚含量測定結(jié)果?

? A1為未經(jīng)脈沖電場處理得到酸解物，A2為脈沖電場處理得到酸解物，E1為未經(jīng)脈沖電場處理得到的乙醇提取物，E2為脈沖電場處理得到的乙醇提取物。

3 結(jié)論

本研究采用TLC—DPPH和HPLC等方法對油菜蜂花粉的乙醇提取物及其酸解物進(jìn)行了黃酮類成分分析。研究發(fā)現(xiàn)，蜂花粉的乙醇提取物經(jīng)過酸水解后，形成了大量以黃酮苷形式存在的槲皮素和山奈酚等黃酮類物質(zhì)。另外，通過脈沖電場技術(shù)的輔助提取，可將蜂花粉乙醇提取物的酸解物中槲皮素和山奈酚的含量分別提高了13.55%和16.75%。這充分證明了脈沖電場作用對油菜蜂花粉細(xì)胞具有顯著破壁效應(yīng)，是一種有著廣闊前景的破壁手段。接下來將深入開展脈沖電場輔助提取對花粉中黃酮類化合物生物活性的影響。

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The study of rough flavones components extracted from the rape bee pollen

WANG Man-sheng1,2ZENGXin-an2XIONGXia-yu2DAIQiu-zhong1,3

(1.InstituteofBastFiberCrops,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Changsha,Hunan410205,China;2.SchoolofFoodScienceandEngineering,SouthChinaUniversityofTechnology,Guangzhou,Guangdong510640,China;3.DepartmentofAnimalNutritionandFeedingTechnology,HunanInstituteofAnimalScienceandVeterinaryMedicine,Changsha,Hunan410131,China)

In order to clarify the flavonoids compositions of rape bee pollen and evaluate the assisted extraction effect for pulsed electric field (PEF), the ethanol extract of rape bee pollen and its acidolysis component were analyzed in detail by the method of TLC—DPPH and HPLC in this paper. The results showed that the quercetin and kaempferol in the ethanol extract of rape bee pollen could not be detected for their low contents. However, a large number of quercetin and kaempferol were generated after the acidolysis of ethanol extract, and this implied that the flavonoids compositions of rape bee pollen mainly existed in the form of flavonoid glycoside. In addition, the content of quercetin and kaempferol in the acidolysis of ethanol extract were 764.39 μg/g and 1 647.97 μg/g respectively when the acidolysis materials were not treated by PEF. Nevertheless, when the acidolysis of ethanol extract was pretreated by the PEF afterwards, the content of quercetin and kaempferol reached 867.93 μg/g and 1 924.03 μg/g, increasing by 13.55% and 16.75% respectively. These results fully proved that the PEF technology pretreatment was an effective assisted extraction method and could be conducive to break the walls for the rape bee pollen cells.

Rape bee pollen; flavonoids compounds; pulsed electric field; thin-layer chromatography; wall-breaking

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號：21376094，21576099)；廣東省科技攻關(guān)項(xiàng)目(編號：2015A030312001，2013B020203001，2013B091100004)

王滿生，男，博士。

曾新安(1972—)，男，華南理工大學(xué)教授，博士。

E-mail: xazeng@ scut.edu.cn

2016—05—18