高慶強(qiáng)，陳　赟，陳　海，徐志鵬，朱磊磊，余　文，韓友峰，戴玉田

(南京鼓樓醫(yī)院泌尿男科，江蘇南京　210008)

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重組人程序化細(xì)胞死亡5蛋白聯(lián)合順鉑對(duì)前列腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)作用的研究

高慶強(qiáng)，陳赟，陳海，徐志鵬，朱磊磊，余文，韓友峰，戴玉田

(南京鼓樓醫(yī)院泌尿男科，江蘇南京210008)

目的探討重組人程序化細(xì)胞死亡5(rhPDCD5)聯(lián)合順鉑(DDP)對(duì)人前列腺癌PC3細(xì)胞增殖和凋亡的影響及可能的機(jī)制。方法不同濃度rhPDCD5蛋白、DDP及兩者聯(lián)合干預(yù)PC3細(xì)胞，MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，Western blot法檢測(cè)Cleaved-capase3、Bcl-xl蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果與對(duì)照組相比，rhPDCD5、順鉑單獨(dú)或聯(lián)合作用PC3細(xì)胞均可抑制細(xì)胞增殖，聯(lián)合用藥抑制效果更顯著(P<0.05)；rhPDCD5組、DDP組、聯(lián)合用藥組PC3細(xì)胞的凋亡率分別為(19.62±2.32)%、(22.45±1.57)%、(59.78±3.31)%。rhPDCD5、順鉑聯(lián)合應(yīng)用較單獨(dú)用藥可顯著增強(qiáng)PC3細(xì)胞凋亡(P<0.05)；蛋白印跡法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)rhPDCD5組、DDP組、聯(lián)合用藥組中Cleaved-capase3表達(dá)明顯上調(diào)，Bcl-xl表達(dá)顯著下調(diào)，聯(lián)合用藥組效果更顯著(P<0.05)。結(jié)論rhPDCD5可促進(jìn)PC3細(xì)胞的凋亡，且顯著增強(qiáng)順鉑對(duì)人前列腺癌PC3的抗癌敏感性。

前列腺癌；Cleaved-capase3；Bcl-xl；程序化細(xì)胞死亡5；順鉑

前列腺癌(prostate carcinoma,PCa)是老年男性常見的惡性腫瘤。在西方國(guó)家的男性腫瘤死亡因素中居第2位[1]。近年來(lái)，我國(guó)PCa的發(fā)病率有明顯上升趨勢(shì)，已躍居男性泌尿生殖系統(tǒng)第三大惡性腫瘤。順鉑是一種治療PCa等癌癥的常規(guī)化療藥物，作為非周期依賴性腫瘤細(xì)胞抑制藥物，常被作為PCa化療的重要組成部分[2]。但近年來(lái)報(bào)道順鉑化療敏感性有所下降，限制了其在臨床的應(yīng)用[3-5]。文獻(xiàn)報(bào)道，化療藥物的敏感性受到調(diào)控細(xì)胞凋亡信號(hào)通路的相關(guān)蛋白影響[6-7]。人程序化細(xì)胞死亡5(programmed cell death 5，rhPDCD5)作為一種人類細(xì)胞凋亡相關(guān)基因，可以增強(qiáng)多種化療藥物對(duì)多種腫瘤細(xì)胞的凋亡作用。本研究在PC3細(xì)胞模型中，觀察了rhPDCD5聯(lián)合DDP對(duì)PC3細(xì)胞的抗腫瘤作用，并探討其可能的作用機(jī)制。

1　材料與方法

1.1藥品與試劑人前列腺癌 PC3細(xì)胞株購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司。rhPDCD5蛋白由北京寶塞生物技術(shù)有限公司提供；DDP由上海同田生物技術(shù)股份有限公司提供。小牛血清由杭州四季青生物公司提供； 噻唑藍(lán)(MTT)試劑盒購(gòu)自Chemicon 公司； Annexin V-FITC 購(gòu)自 Becton Dickinson公司；caspase-3、Bcl-xl等一抗及相應(yīng)的二抗均購(gòu)于cell Signaling technology 公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)分組PC3細(xì)胞株常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的Ham’s-F12培養(yǎng)基中，在37 ℃、5% CO2、飽和濕度的條件下培養(yǎng)。待細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底85%～90%，棄去已用培養(yǎng)基，以0.25%胰蛋白酶消化，每隔2～3 d分瓶傳代、培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分4組：空白對(duì)照組(不加藥物)、rhPDCD5組、DDP組、聯(lián)合用藥組(rhPDCD5+DDP)。

1.3MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/mL時(shí)，接種于96孔板，培養(yǎng)24 h后，更換含有不同濃度藥物的培養(yǎng)液 100 μL。分別加入5、10、 15、 20、 25、 30 mg/L的rhPDCD5蛋白和1、2、4、8、16、32 mg/L的DDP。繼續(xù)在適宜條件下孵箱培養(yǎng)24 h。用MTT方法(方法參照試劑盒說(shuō)明書)測(cè)得相應(yīng)570 nm處吸光度(A)值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取其平均值。

生長(zhǎng)抑制率(%)=(A對(duì)照組-A 實(shí)驗(yàn)組)/(A 對(duì)照組-A空白組)×100%。

1.4Annexin-V流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況分別按以上實(shí)驗(yàn)分組處理PC3細(xì)胞，作用24 h后收集細(xì)胞，用磷酸鹽緩沖液(Phosphate-buffered saline,PBS)洗滌 3 次，加500 μL懸浮細(xì)胞液，加5 μL Annexin V液和5 μL PI液混勻混勻，室溫避光孵育15 min，進(jìn)行流式細(xì)胞儀觀察和檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取其平均值。

1.5Western blot法檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)情況分別按以上實(shí)驗(yàn)分組處理PC3細(xì)胞，提取總蛋白。蛋白裂解后離心收集上清，測(cè)上清蛋白濃度。將蛋白于12%聚丙烯酰胺-SDS凝膠電泳分離，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉。分別加入相關(guān)蛋白的一抗，室溫卵育過(guò)夜，加入二抗卵育。加入化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取其平均值。

2　結(jié)　果

2.1MTT法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制和最適藥物濃度MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示，rhPDCD5和DDP均可抑制PC3細(xì)胞的生長(zhǎng)，并呈現(xiàn)一定的劑量、時(shí)間依賴效應(yīng)。rhPDCD5和DDP作用24 h后，半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為(24.27±2.13)mg/L、(21.78±1.15)μmol/L。為進(jìn)一步探討最適濃度，取半數(shù)抑制濃度的1/4作為給藥劑量(圖1)。

圖1　不同濃度的rhPDCD5蛋白、DDP作用24 h后PC3細(xì)胞的抑制率

2.2rhPDCD5蛋白增強(qiáng)順鉑對(duì)PC3細(xì)胞凋亡作用流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示rhPDCD5組、DDP組、陰性對(duì)照組PC3細(xì)胞的凋亡率分別為(19.62±2.32)%、(22.45±1.57)%、(3.02±0.63)%；聯(lián)合用藥組凋亡率為(59.78±3.31)%，單獨(dú)用藥組與陰性對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；聯(lián)合用藥組與陰性對(duì)照組和單獨(dú)用藥組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。表明rhPDCD5蛋白能夠顯著增強(qiáng)DDP對(duì)PC3細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用。見圖2。

圖2　不同藥物組作用于PC3細(xì)胞24 h后的凋亡情況

*與陰性對(duì)照組相對(duì)比，P<0.05；#與rhPDCD5組及DDP組相比，P<0.05

2.3rhPDCD5蛋白和/或DDP對(duì)PC3細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)的影響PC3細(xì)胞經(jīng)單藥組及聯(lián)用組作用24 h后，可引起Cleaved-capase3的表達(dá)上調(diào)，Bcl-xl表達(dá)下調(diào)，單獨(dú)用藥組蛋白電泳灰度值與陰性對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；聯(lián)合用藥組蛋白電泳灰度值與陰性對(duì)照組和單獨(dú)用藥組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖3、表2)。

圖3Western blot法檢測(cè)各組Bcl-xl、Cleaved-capase3蛋白的表達(dá)情況

A：空白對(duì)照組；B： rhPDCD5組；C： DDP組；D：聯(lián)合用藥組。

相關(guān)蛋白對(duì)照組rhPDCD5組DDP組聯(lián)合用藥組F值P值Cleaved?capase30．23±0．060．45±0．11?0．58±0．05?0．71±0．14?#17．375<0．05Bcl?xl0．69±0．130．48±0．08?0．41±0．12?0．19±0．09?#24．286<0．05

與陰性對(duì)照組相比，*P<0.05；與rhPDCD5組、DDP組相比，#P<0.05。

3　討　論

PCa已成為西方發(fā)達(dá)國(guó)家的公共衛(wèi)生問題，常消耗大量的醫(yī)療資源[8]，近20年來(lái)我國(guó)發(fā)病率出現(xiàn)迅速增長(zhǎng)趨勢(shì)[9-10]。放化療扔是臨床控制激素非依賴性PCa病情的主要手段。而細(xì)胞毒化療藥物對(duì)PCa的毒副作用和耐藥性的發(fā)生嚴(yán)重的限制了其在臨床的應(yīng)用，如何提高順鉑的敏感性，提高其治療的有效性日益突出。文獻(xiàn)表明，腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐性性的原因之一即為凋亡調(diào)節(jié)的失調(diào)[11]。rhPDCD5作為一種凋亡調(diào)控正基因，首先在人白血病細(xì)胞TF-1中發(fā)現(xiàn)[12]。其在人多種惡性腫瘤中低表達(dá)[13-14]。對(duì)rhPDCD5研究發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)把rhPDCD5導(dǎo)入多種細(xì)胞后，并不能對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生明顯的影響，但是如果加入誘導(dǎo)凋亡的因素，如加入化療藥物后則可以明顯促進(jìn)細(xì)胞凋亡。YIN等[15]發(fā)現(xiàn)，PDCD5可明顯增強(qiáng)順鉑對(duì)大腸癌細(xì)胞凋亡的敏感性。這些結(jié)果均表明，PDCD5可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而不能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。但PDCD5提高順鉑敏感性的具體機(jī)制尚未完全闡明。有研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用順鉑等抗腫瘤藥物進(jìn)行化療時(shí)，能引起腫瘤細(xì)胞的線粒體釋放細(xì)胞色素c，激活半胱天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。caspase-3為凋亡下游促進(jìn)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵蛋白酶是凋亡過(guò)程的重要執(zhí)行者[16]。凋亡調(diào)節(jié)基因調(diào)節(jié)異常則會(huì)導(dǎo)致caspase-3介導(dǎo)的凋亡傳導(dǎo)的異常，并改變化療藥物敏感性[17]。Cleaved-capase3 為活化的caspase-3，是caspase 家族級(jí)聯(lián)激活后的共同通路和誘導(dǎo)凋亡的關(guān)鍵因子，因此，Cleaved-capase3是反映細(xì)胞凋亡可靠而敏感的指標(biāo)[18]。Bcl-xl是Bcl-2家族中重要的抗凋亡基因，文獻(xiàn)報(bào)道，多種耐藥性表型同Bcl-xl的過(guò)表達(dá)有關(guān)[19]。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，Bcl-xl蛋白表達(dá)陽(yáng)性的人前列腺癌標(biāo)本數(shù)明顯高于Bcl-2蛋白表達(dá)陽(yáng)性者，提示Bcl-xl在PCa中在所起的作用可能高于Bcl-2。其阻止細(xì)胞凋亡的作用可能是通過(guò)阻止細(xì)胞色素c在細(xì)胞質(zhì)中的積聚而實(shí)現(xiàn)的[13]。文獻(xiàn)表明，Bcl-xl作為上游凋亡相關(guān)因子通過(guò)抑制線粒體釋放細(xì)胞色素c來(lái)抑制caspase-3的激活[20]，當(dāng)化療藥物等凋亡因素刺激細(xì)胞時(shí)，Bcl-xl抑制細(xì)胞色素c的釋放，抑制凋亡。本實(shí)驗(yàn)中顯示，單藥組及聯(lián)用組均可引起Cleaved-capase3的表達(dá)上調(diào)，Bcl-xl表達(dá)下調(diào)，且聯(lián)合用藥組效果更明顯(P<0.05)。

本實(shí)驗(yàn)采用rhPDCD5蛋白和DDP聯(lián)合作用于人前列腺癌PC3細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)，rhPDCD5蛋白和DDP均能抑制PC3細(xì)胞的增殖，增加細(xì)胞的凋亡，兩藥聯(lián)合應(yīng)用效果更顯著。由此推測(cè)，rhPDCD5能明顯提高DDP對(duì)PC3細(xì)胞的殺傷作用，提高PC3細(xì)胞對(duì)DDP化療的敏感性。Western blot結(jié)果表明，單藥組及聯(lián)用組作用均可引起Cleaved-capase3的表達(dá)上調(diào)，Bcl-xl表達(dá)下調(diào)，且聯(lián)合用藥組效果更明顯(P<0.05)。由此可知，rhPDCD5蛋白可以提高DDP對(duì)腫瘤細(xì)胞的凋亡作用。筆者分析，其可能機(jī)制可能是rhPDCD5蛋白抑制抗凋亡基因Bcl-xl的過(guò)表達(dá)，促使細(xì)胞色素c釋放至胞質(zhì)含量增加，進(jìn)而增強(qiáng)caspase-3介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過(guò)程。

通過(guò)本實(shí)驗(yàn)表明rhPDCD5和DDP均具有明顯的抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì) 胞凋亡作用，且兩藥聯(lián)用的抗前列腺癌作用比單用更強(qiáng)，具有一定的協(xié)同性。

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(編輯何宏靈)

Effects of recombinant human programmed cell death 5 protein on cell growth of human prostate cancer cell line PC3 induced by cisplatin and its mechanism

GAO Qing-qiang, CHEN Yun, CHEN Hai, XU Zhi-peng, ZHU Lei-lei, YU Wen, HAN You-feng, DAI Yu-tian

(Department of Andrology, Drum Tower Hospital Affliated to Medical College of Nanjing University, Nanjjing 210008, China)

ObjectiveTo explore the effects of reconstruction human programmed cell death 5 (rhPDCD5) combined with cisplatin (DDP) on PC3 cell proliferation and apoptosis of human prostate cancer as well as the possible mechanism. MethodsPC3 cells were intervened with different concentrations of rhPDCD5 protein, DDP, as well as rhPDCD5 protein and DDP. The cell proliferation was detected with MTT, the apoptosis was examined with flow cytometry, and the expressions of Cleaved-capase3 and Bcl-xl proteins were detected with Western blot. ResultsCompared with the control group, rhPDCD5 and DDP alone or their combination inhibited cell proliferation of PC3, with more significant inhibition effects in the combined group (P<0.05). The combination of rhPDCD5 and DDP significantly increased PC3 apoptosis (59.78±3.31)% when compared with rhPDCD5 and DDP alone (19.62±2.32)% and (22.45±1.57)%,P<0.05. The results of Western blot revealed remarkable up-regulation of Cleaved-capase3 expression and notable down-regulation of Bcl-xl expression in rhPDCD5 group, DDP group and the combined group, with more obvious effects in the combined group (P<0.05). ConclusionrhPDCD5 promoted the apoptosis of PC3 cells, and significantly enhanced the anti-tumor sensitivity of DDP towards human prostate cancer PC3.

prostatic carcinoma; Cleaved-capase3; Bcl-xl; recombinant human programmed cell death 5 ( rhPDCD5); cisplatin (DDP)

2015-12-30

2016-07-18

戴玉田，博士生導(dǎo)師，主任醫(yī)師，教授.

E-mail：13913957628@163.com

高慶強(qiáng)(1984-)，男(漢族)，醫(yī)學(xué)碩士，住院醫(yī)師.研究方向：泌尿外科和男科學(xué)疾病研究.E-mail：gqq198412@163.com

R737.25

ADOI：10.3969/j.issn.1009-8291.2016.10.017