李云祥，李進銘，柳良仁，魏　強，牛　超，王安果

(1.南充市中心醫(yī)院暨川北醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院泌尿外科,四川南充　637000；2.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院泌尿外科,四川南充　637000；3.四川大學(xué)華西醫(yī)院泌尿外科, 四川成都　610041)

?

ROR-γt、Foxp3在前列腺增生組織中的表達及意義

李云祥1,3，李進銘2，柳良仁3，魏強3，牛超1，王安果1

(1.南充市中心醫(yī)院暨川北醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院泌尿外科,四川南充637000；2.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院泌尿外科,四川南充637000；3.四川大學(xué)華西醫(yī)院泌尿外科, 四川成都610041)

目的探討維甲酸相關(guān)孤兒受體(ROR-γt)、叉狀/翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子(Foxp3)在前列腺增生(BPH)組織中的表達及臨床意義。方法選取2013年5～12月在本院行經(jīng)尿道前列腺電切術(shù)(TURP)的BPH患者80例作為實驗組(根據(jù)合并有和無組織學(xué)炎癥分為實驗組1和實驗組2)，另取健康男性18～27歲因外傷意外死亡法醫(yī)及時尸體解剖并倫理委員會同意的5例前列腺組織作為對照組，迅速取出相應(yīng)前列腺組織保存于液氮中,運用實時熒光定量PCR(QRT-PCR)檢測ROR-γt 、Foxp3 mRNA的相對表達量，對兩組研究對象的ROR-γt與Foxp3 關(guān)系進行分析。結(jié)果實驗組1的ROR-γt mRNA含量明顯高于對照組和實驗組2(P<0.05)；實驗組1的Foxp3mRNA含量明顯低于對照組和實驗組2(P<0.05)；ROR-γt、Foxp3 mRNA在伴有組織炎癥的前列腺增生組織與無組織學(xué)炎癥的BPH組織中表達均有相關(guān)(r=0.623，P=0.002；r=-0.588，P=0.006)。結(jié)論組織學(xué)炎癥在BPH生組織中發(fā)揮重要作用，ROR-γt介導(dǎo)炎癥反應(yīng)、Foxp3抑制組織學(xué)炎癥，其共同作用使組織局部微環(huán)境中Th17/Treg比例失衡，從而可能導(dǎo)致BPH的發(fā)生。

前列腺增生；ROR-γt；Foxp3；Th17/Treg；QRT-PCR

良性前列腺增生(benign prostatic hyperplasia, BPH)是一種以前列腺上皮細胞和間質(zhì)增生為其特征，多發(fā)生于老年男性的常見病，是老年男性下尿路癥狀(lower urinary tract symptom，LUTS)的常見原因，對患者生活質(zhì)量造成嚴(yán)重影響[1]。隨著我國社會的老齡化不斷加重，BPH的發(fā)病率呈現(xiàn)上升趨勢，但是當(dāng)前沒有一個準(zhǔn)確的說法對良性前列腺增生的發(fā)生做出明確結(jié)果。近年來研究發(fā)現(xiàn)組織學(xué)前列腺炎是影響良性前列腺增生發(fā)生的一個重要危險因素[2]。研究發(fā)現(xiàn)對手術(shù)獲得的BPH 標(biāo)本的檢驗中廣泛存在組織學(xué)炎癥的浸潤，而且這種炎癥主要為淋巴細胞浸潤，而且患病率高達40%以上，這種免疫性炎癥與BPH 的發(fā)生和發(fā)展有著密切關(guān)系[3]。維甲酸相關(guān)孤兒受體(retinoid acid related orphan receptor gammat，ROR-γt)是輔助性T細胞17( T helper cell 9，Th17)的轉(zhuǎn)錄因子，叉狀/翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子(forkhead or winged helix transcription，F(xiàn)oxp3)是調(diào)節(jié)性T細胞( regulatory T cells，Treg)的轉(zhuǎn)錄因子，對Th17細胞負向調(diào)節(jié)。Th17細胞對于對其與合并前列腺炎的前列腺增生病的發(fā)病目前國內(nèi)外研究較少。本研究對Th17/Treg關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子ROR-γt/Foxp3 mRNA表達水平進行研究，為探索BPH的防治及炎癥的發(fā)生提供依據(jù)。

1　資料與方法

1.1基本資料前列腺增生組織中合并組織學(xué)炎癥的判斷根據(jù) 2001 年北美慢性前列腺炎協(xié)作研究網(wǎng)(chronic prostatitis collaborative research network，CPCRN)和國際前列腺炎協(xié)作網(wǎng)(international prostatitis collaboration network，PICN)制定的慢性前列腺炎組織學(xué)分類系統(tǒng)腺體周圍炎性細胞浸潤標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)將80例病理標(biāo)本分為合并組織學(xué)炎癥(histological prostatitis，HP)的BPH組即實驗組1(60例)以及單純BPH組即實驗組2(20例)。納入標(biāo)準(zhǔn)[4]：①患者的年齡為50～80歲；②患者的臨床表現(xiàn)為典型的下尿路梗阻癥狀及刺激癥狀，且國際前列腺癥狀評分(International Prostate Symptom Score， IPSS)為18以上；③經(jīng)直腸超聲檢查確診為 BPH。本課題已經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，所有納入對象均知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)[4]：①合并尿路、尿道狹窄或全身感染者；②術(shù)前行前列腺穿刺活檢者；③既往有前列腺手術(shù)史者；④術(shù)后病理提示前列腺腫瘤或癌前病變者；⑤合并尿道狹窄及膀胱結(jié)石者。其中實驗組患者80例，年齡51～79歲，平均年齡為(63.9±10.9)歲。另取健康男性18～27歲因外傷意外死亡法醫(yī)及時尸體解剖并倫理委員會同意的5例前列腺組織作為對照組。實驗組1和實驗組2基本資料沒有明顯差異(P>0.05)，具有可比性。

1.2方法

1.2.1前列腺組織細胞總RNA的提取將臨床上提取的前列腺組織盡可能的剪碎后，用1 mL的Trizol試劑反復(fù)吹打，直至Trizol試劑恢復(fù)清亮，無絮狀沉淀為止[5]。在Trizol溶液中按照1 mL加入400 μL氯仿的比例加入氯仿，然后劇烈震蕩混合液，直至混合液變?yōu)榉奂t色，并呈現(xiàn)出乳白色的不透明狀。然后在室溫下靜置10 min待溶液分層。將分層的樣品于4 ℃ 15 000 r/min轉(zhuǎn)速離心15 min，吸取上層無色透明的水相至一新EP管中。向水相中加入等體積的異丙醇，然后劇烈震蕩混勻后，-20 ℃放置30 min，沉淀RNA。15 000 r/min轉(zhuǎn)速離心15 min后，棄去上清，觀察EP管的管底膠裝的RNA沉淀。使用75%的乙醇沖洗沉淀，15 000 r/min離心5 min，棄去乙醇，盡可能的用槍頭吸出殘留的乙醇，然后室溫放置干燥RNA后用60 μL DEPC處理水溶解。

1.2.2DNase I去除基因組DNA污染在DEPC處理水溶解后的RNA按照體積比例加入10×rDNaseI buffer，然后加入100 U RNase Free rDNaseI降解消化RNA中來源于基因組的DNA污染，37 ℃水浴鍋處理30 min，然后75 ℃15 min滅活DNaseI后待用。

1.2.3反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈互補cDNA按照AMV Reverse Transcriptase的實際說明書混合如下反應(yīng)體系：AMV 5X buffer，4 μL；10 μmol/L Oligo dT，0.5 μL；10 μm Random Hexamer，0.5 μL；RNAsin RNase Inhibitor，0.5 μL；2.5 μmol/L dNTP，1 μL；dddH2O，8.5 μL；RNA，4 μL；AMV RT，1 μL；Total,20 μL。然后放置于PCR儀上按照20 ℃ 10 min，42 ℃ 1 h，75 ℃ 10 min的程序合成cDNA第一鏈。

1.2.4熒光定量PCR分析目的基因表達[6]將合成后的cDNA稀釋10倍后，與熒光定量PCR的引物混合為20 μL反應(yīng)體系如下：SYBR Green Master Mixes，10 μL；2.5μmol/L Forward Primer，1 μL；2.5 umol/L Reverse Primer，1 μL；dddH2O，3 μL；10倍稀釋cDNA，5 μL；Total，20 μL。按照下列定量PCR循環(huán)體系：95 ℃ 10 min，95 ℃ 30 s；62 ℃ 1 min(熒光讀取)；回到程序2重復(fù)39個循環(huán)， 熔合曲線分析(55 ℃至95 ℃)。

1.2.5QRT-PLR方法檢測ROR-γt、Foxp3 mRNA的相對表達量qPCR相對基因表達分析，在所有qPCR所檢測的的基因中，以RPL32(human 60S ribosomal protein L32)為內(nèi)參基因，按照2-ΔΔCT 方法[7]，以正常人群來源的組織RNA為對照，來計算相對基因表達。引物序列: ROR-γt的上游為5′-TUAAUUUAUCCAA-3′，下游為5′-LLALAUATTTTUCAAUUUATCA-3′，擴增范圍84 bp；β-actin的上游為5′-TTCCAUCCTTCCTTCCTUUG-3′，下游為5′-TTUCUCTCAUUAUUAGCAAT-3′，擴增范圍223 bp；Foxp3的上游為5′-UAAACAUCACATTGCCAUAUTTG3′，下游為5′-ATUUCCCAUCGUATUAG3′，擴增范圍99 bp。Homo ROR-γt經(jīng)RT-PCR鑒定擴增基因片段為75 bp，符合目的基因大小，見圖1A；Homo FOXP3經(jīng)RT-PCR鑒定擴增基因片段為77 bp，符合目的基因大小，見圖1B。

圖1Homo ROR-γt和Homo Foxp3經(jīng)RT-PCR鑒定擴增基因片段圖

A:Homo ROR-γt;B:Homo Foxp3。

2　結(jié)　果

2.1qRT-PCR檢測結(jié)果可見在qRT-PCR中兩組基因均有不同程度的擴增。由表1可知可以發(fā)現(xiàn)實驗組1的ROR-γt mRNA含量明顯高于對照組和實驗組2(P<0.05);實驗組1的Foxp3 mRNA含量明顯低于對照組和實驗組2(P<0.05)。

表12組研究對象的ROR-γt、Foxp3 mRNA水平比較

組別例數(shù)ROR?γt相對表達量Foxp3相對表達量實驗組160102．3±10．30．6±0．6實驗組22023．3±5．33．2±0．3對照組510．2±2．32．9±0．1F值2．6982．264P值0．0150．021

2.22組研究對象中ROR-γt、Foxp3 mRNA表達的相關(guān)性ROR-γt相對表達量與 BPH組織中的炎癥表達正相關(guān)(r=0.623，P=0.002)，而Foxp3 mRNA則與其負相關(guān)(r=-0.588，P=0.006)。

3　討　論

當(dāng)然， BPH產(chǎn)生的尿路梗阻及本研究對象中存在的急性、慢性尿潴留患者，是否可引起炎癥因子的變化及其細胞因子導(dǎo)致前列腺組織學(xué)炎癥和尿路梗阻等 BPH癥狀等情況，仍需進一步研究。對ROR-γt和Foxp3在其他疾病的研究比較多[11]，研究顯示ROR-γt和Foxp3與發(fā)炎組織的表達與正常組織中存在明顯差異，而且ROR-γt和Foxp3之間的關(guān)系也表示Th17/Treg的比例關(guān)系。臨床研究顯示，在手術(shù)獲得的 BPH切片標(biāo)本中, 廣泛存在以淋巴細胞浸潤為主的組織學(xué)炎癥，其組織學(xué)炎癥的患病率高達43%到98%，組織學(xué)前列腺炎的存在被認為是影響良性 BPH臨床進展的一項重要危險因素，且免疫性炎癥與 BPH的進展密切相關(guān)[12]。而相關(guān) BPH組織中的ROR-γt和Foxp3表達的研究很少，因此進行本次研究可以為進一步深入研究 BPH發(fā)病機制提供可靠依據(jù)。ROR-γt是Th17細胞的轉(zhuǎn)錄因子，可以提高在炎癥組織的表達，因此在炎癥的 BPH組織中與無炎癥 BPH組織中呈正相關(guān)。而Foxp3作為Th17細胞的反向轉(zhuǎn)錄因子，其表達在炎癥的 BPH組織中與無炎癥 BPH組織中呈負相關(guān)。因此本研究的結(jié)果也證明了ROR-γt和Foxp3在合并組織學(xué)炎癥的 BPH組織中與無組織學(xué)炎癥的 BPH組織中表達差異，而ROR-γt和Foxp3分別是Th17細胞、Treg細胞各自的特異性轉(zhuǎn)錄因子，本實驗表明該兩種轉(zhuǎn)錄因子在 BPH組織中密切負相關(guān)，這也間接說明了Th17/Treg的比例失衡，可能參與 BPH的發(fā)生。

綜上所述，組織學(xué)炎癥在 BPH組織中發(fā)揮重要作用， ROR-γt、Foxp3的存在使組織局部微環(huán)境中Th17/Treg比例失衡，從而可能導(dǎo)致 BPH的發(fā)生，為研究 BPH的發(fā)病機制提供一種依據(jù)。

[1] MANSOOREH ESLAMI, TAHERE KHAMECHIAN, TAHERE MAZOOCHI, et al. Evaluation of survivin expression in prostate specimens of patients with prostate adenocarcinoma and benign prostate hyperplasia underwent transurethral resection of the prostate or prostatectomy[J]. Springer Plus, 2016, 5 (1):1-6.

[2] BREYER BN, HUANG WY, RABKIN CS, et al. Sexually transmitted infections, benign prostatic hyperplasia and lower urinary tract symptom-related outcomes: Results from the Prostate, Lung, Colorectal and Ovarian Cancer Screening Trial [J]. BJU Int, 2016,117(1):274-277.

[3] DE NUNZIO C，KRAMMER G，MARBERGER M, et al. The controversial relationship between benign prostatic hyperplasia and prostate cancer: the role of inflammation [J]. Eur Urol，2011，60(1)：106-117.

[4] WANG MQ, GUO LP,DUAN F, et al. Prostatic arterial embolization for the treatment of lower urinary tract symptoms caused by benign prostatic hyperplasia: a comparative study of medium-and large-volume prostates[J]. BJU Int, 2016,117 (1):402-407.

[5] GIANCARLO MARRA, PAUL STURCH, MARCO ODERDA, et al. Systematic review of lower urinary tract symptoms/benign prostatic hyperplasia surgical treatments on men’s ejaculatory function: Time for a bespoke approach? [J]. Int J Urol, 2016, 23 (1):389-396.

[6] KOSMACZEWSKA A, SWIERKOT J, CISZAK L，et al. The role of Th1, Th17, and Treg cells in the pathogenesis of rheumatoid arthritis including anti-inflammatory action of Th1 cytokines [J]. Postepy Hig Med Dosw, 2011, 65:397-403.

[7] KWON JK, HAN JH, CHOI HC, et al. Clinical significance of peripheral zone thickness in men with lower urinary tract symptoms/benign prostatic hyperplasia[J]. BJU Int, 2016, 117 (2):316-322.

[8] RICK FG, SCHALLY AV, BLOCK NL,et al.LHRH antagonist Cetrorelix reduces prostate size and gene expression of proinflammatory cytokines and growth factors in a rat model of benign prostatic hyperplasia[J].Prostate, 2011,71(7):736-747.

[9] HIDEKI TAKESHITA, SHINGO MORIYAMA, YOSHIAKI ARAI，et al. Randomized crossover comparison of the short-term efficacy and safety of single half-dose silodosin and tamsulosin hydrochoride in men with lower urinary tract symptoms secondary to benign prostatic hyperplasia[J]. Lower Urinary Tract Symptoms, 2016, 8 (1):170-184.

[10] BALLERINI C, ALDINUCCI A, LUCCARINI I, et al.Antagonism of histamine H4 receptors exacerbates clinical and pathological signs of experimental autoimmune encephalomyelitis [J]. Br J Pharmacol,2013, 170(1):67-77.

[11] SHARMA S, WATANABE S, SIVAM A,et al. Peripheral blood and tissue T regulatory cells in chronic rhinosinusitis[J]. Am J Rhinol Allergy, 2012, 26(5):371-379.

[12] CHOI BR, SONI KK, ZHANG LT, et al. Effect of 4-chloro-7-trifluoromethyl-10 H-benzo[4,5]furo[3,2-b]indole-1-carboxylic acid on the intraurethral pressure in a rat model of benign prostatic hyperplasia[J]. Int J Urol, 2016, 23 (3):1236-1242.

(編輯何宏靈)

Expressions and significances of ROR-γt and Foxp3 in benign prostatic hyperplasia

LI Yun-xiang1,3, LI Jin-ming2, LIU Liang-ren3, WEI Qiang3, NIU Chao1, WANG An-guo1

(1.Department of Urology, Nanchong Central Hospital / Second Clinical Medical School Affiliated to North Sichuan Medical College, Nanchong 637000;2.Department of Urology, Clinical Medical School Affiliated to North Sichuan Medical College, Nanchong 637000; 3.Department of Urology, West China Hospital, Sichuan University, Chengdu 610041, China)

ObjectiveTo study the expressions and clinical significances of ROR-γt and Foxp3 in benign prostatic hyperplasia. Methods A total of 80 benign prostatic hyperplasia (BPH) cases treated with transurethral resection of the prostate (TURP) during May and Dec. 2013 were selected as the experimental group, which were subdivided into test group 1 (with inflammation) and test group 2 (without inflammation), and 5 cases of healthy male aged 18-27 years who died of trauma were involved as the control group. ROR-γt and Foxp3 mRNA relative expressions were detected with QRT-PCR, and their relationship was analyzed. Results ROR-γt mRNA content was significantly higher in test group 1 than in the control group and test group 2 (P<0.05). Foxp 3 mRNA content was significantly lower in test group 1 than in the control group and experimental group 2 (P<0.05). ROR-γt and Foxp 3 mRNA were associated with BPH with inflammation and BPH without inflammation (R=0.623,P=0.002;R=-0.588,P=0.006). ConclusionInflammation plays an important role in BPH. ROR-γt mediates inflammation while Foxp3 inhibits inflammation, causing the imbalance of Th17/Treg ratio in the local microenvironment, which leads to the occurrence of prostate hyperplasia.

benign prostatic hyperplasia; ROR-γt; Foxp3; Th17/Treg; QRT-PCR

2016-06-16

2016-08-01

四川省科技廳支撐計劃(No.2014SZ0218)；四川省教育廳(No.14ZB0192)；南充市科技局(No.13A0049)

魏強，博士生導(dǎo)師.E-mail: weiqiang765@ 126.com

李云祥(1975-)，男(漢族)，醫(yī)學(xué)博士.研究方向：前列腺疾病基礎(chǔ)與臨床. E-main:liyunxiangwj@sina.com

R69

ADOI：10.3969/j.issn.1009-8291.2016.10.005