楊毅 張潔 王智勇 張飛 牛瑞芳

·基礎研究·

SHP2介導IL-6促進乳腺癌細胞侵襲作用機制的研究*

楊毅 張潔 王智勇 張飛 牛瑞芳

目的：探討非受體型酪氨酸磷酸酶SHP2介導白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）促進人乳腺癌細胞侵襲的作用，以及相應的分子機制。方法：利用外源性重組IL-6處理人乳腺癌細胞T47D，采用表達IL-6的慢病毒感染T47D細胞使其內(nèi)源性表達IL-6，觀察細胞的形態(tài)學改變情況，分析細胞遷移和侵襲能力的變化。采用小RNA干擾的方法下調(diào)IL-6信號通路中關鍵分子SHP2的表達，觀察其表達下降對IL-6促進乳腺癌細胞侵襲能力的影響，同時采用Western blot方法檢測Erk1/2磷酸化變化。結果：上調(diào)IL-6在乳腺癌細胞中的表達顯著促進乳腺癌細胞的遷移和侵襲能力，且細胞發(fā)生由上皮形態(tài)向類成纖維細胞形態(tài)的變化，同時伴隨著上皮標志性蛋白E-cadherin表達下調(diào)和間質標志Vimentin表達上調(diào)。下調(diào)SHP2的表達明顯抑制IL-6誘導乳腺癌細胞的上皮間質轉化（epithelial mesenchymal transition，EMT）和侵襲能力，同時伴隨著細胞內(nèi)Erk1/2磷酸化水平的下降。結論：SHP2通過介導IL-6誘導的EMT促進乳腺癌細胞的遷移和侵襲能力。

SHP2 乳腺癌 侵襲 IL-6 上皮間質轉化

乳腺癌發(fā)病率居女性惡性腫瘤的首位，雖早期患者的10年生存率超過90%，但晚期乳腺癌患者的預后仍然較差［1］。轉移是導致患者治療失敗和死亡的最主要原因。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）信號通路的激活與腫瘤進展的關系非常密切，如患者的腫瘤微環(huán)境中較高的IL-6水平與淋巴結和遠處轉移密切相關［2］，乳腺癌細胞中IL-6信號的激活能夠促進細胞對赫賽汀發(fā)生耐藥，而阻斷該信號則可明顯抑制腫瘤的生長和轉移［3］。然而IL-6信號通路促進乳腺癌進展的詳細機制目前尚不清楚，有必要進行深入研究。

具有SH2結構域的蛋白質酪氨酸磷酸酶2（Src homology 2 domain-containing protein tyrosine phosphatase2，SHP2）是第一個確定的具有酪氨酸磷酸酶活性的原癌基因［4］。有研究顯示SHP2在多種腫瘤組織中高表達，抑制SHP2可以誘導乳腺癌細胞向正常乳腺上皮細胞形態(tài)轉變［5］，下調(diào)SHP2的表達能夠有效抑制腫瘤在小鼠體內(nèi)的生長和轉移［6］。這些結果表明SHP2在乳腺癌進展中起非常關鍵的作用，但相應分子機制的研究鮮見報道。本研究分析IL-6對乳腺癌細胞侵襲遷移的影響，同時采用分子和細胞生物學研究方法探討SHP2在介導IL-6促進乳腺癌細胞發(fā)生上皮間質轉化（epithelial mesenchymal transition，EMT）的作用機制，為進一步明確SHP2促進乳腺癌細胞侵襲轉移的分子機制提供思路。

1 材料與方法

1.1材料

人胚腎上皮細胞株HEK-293T和人乳腺癌細胞系T47D、MDA-MB-231細胞購自美國ATCC細胞庫，由本課題組保存。RPMI 1640細胞培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；胎牛血清購自美國Gibco公司；Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司；Transwell小室購自美國Millipore公司；限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和EcoRⅠ購自美國NEB公司；IL-6 ELISA試劑盒購自深圳達科為公司；Matrigel基質膠和小鼠抗人E-cadherin單克隆抗體購自美國BD公司；兔抗人Erk1/2、p-Erk1/2、p-SHP2、Vimentin和Slug單克隆抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；小鼠抗人SHP2、β-actin單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司。

1.2方法

1.2.1IL-6慢病毒表達載體的構建從IL-6陽性表達的MDA-MB-231細胞中提取總RNA，逆轉錄為cDNA后，以此為模板，采用PCR的方法擴增IL-6的編碼區(qū)，上下游引物分別包含BamHⅠ和EcoRⅠ的酶切位點。將純化后的PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶酶切后，將其與采用同樣雙酶切后的慢病毒表達載體pCDH進行連接，連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌DH5α，挑取陽性菌落擴增搖菌，提取質粒，進行雙酶切和測序驗證。

1.2.2慢病毒包裝和感染將pCDH-IL-6載體與兩個輔助包裝質粒按照適當比例混合，采用基于Lipfectamine 2000的方法將其轉染至HEK-293T細胞中，轉染48和72 h后，收取培養(yǎng)液上清，離心去除細胞碎片，采用超濾離心的方法濃縮病毒。將慢病毒感染T47D細胞，感染48 h后，加入4 μg/mL的嘌呤霉素進行篩選，獲得穩(wěn)定表達IL-6的T47D細胞。

1.2.3siRNA轉染實驗轉染前一天將T47D細胞接種至6孔板中，使細胞匯合度達到30%左右。第二天將10 μL對照siRNA和SHP2特異siRNA以及5 μL的轉染試劑Lipfectamine 2000分別加入250 μL不含血清的培養(yǎng)液稀釋，室溫放置5 min后，將siRNA和轉染試劑混合，放置20 min后將上述混合物加入至細胞中，6 h后更換為新鮮的細胞培養(yǎng)液。轉染48 h后收取細胞驗證轉染效率。

1.2.4傷口愈合實驗將細胞種植在6孔板中，待細胞達到100%匯合，采用10 μL移液器吸頭在培養(yǎng)板底部劃一條均勻的劃痕，使用PBS洗去懸浮的細胞，然后更換為含有0.5%血清的培養(yǎng)基，在37℃孵箱中培養(yǎng)，分別在0、6、12、18和24 h觀察記錄細胞遷移的距離，并進行統(tǒng)計學分析。

1.2.5Transwell侵襲實驗將20 μL Matrigel（按照1:4稀釋）加入至Transwell小室的底部，將小室置于37℃孵箱中1 h使基質膠凝固。消化并收取細胞，使用無血清培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細胞密度至1×105/mL，在小室上部加入200 μL細胞懸液，小室下槽加入600 μL含10%血清的培養(yǎng)基，將細胞置于37℃孵箱中培養(yǎng)，24 h后棄去上室中未穿過膜的細胞，將細胞固定、染色，顯微鏡下計數(shù)穿過膜的細胞數(shù)目，進行統(tǒng)計學分析。

1.2.6Western blot檢測采用1×SDS細胞裂解液提取細胞總蛋白，進行蛋白定量后，按照40 μg/孔的上樣量進行SDS-PAGE電泳分離，轉印至PVDF膜上，采用5%脫脂奶粉在室溫封閉1 h，加入相應的一抗，在4℃搖床中孵育過夜，使用TBST清洗3次后，加入HRP標記的二抗繼續(xù)室溫孵育1 h，使用TBST清洗3次后，加入ECL化學發(fā)光底物在暗室曝光顯影。

1.3統(tǒng)計學分析

采用Graphpad Prism 6.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。組間差異分析采用t檢驗或者方差分析。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1外源性IL-6處理對乳腺癌細胞遷移能力的影響

Western blot結果顯示，與未采用IL-6刺激的細胞對照組比較，外源性IL-6刺激組細胞中SHP2和Erk1/2的磷酸化水平顯著升高（圖1A）。傷口愈合實驗的結果顯示，在IL-6刺激后細胞的遷移能力明顯升高（圖1B），差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01，圖1C）。2.2穩(wěn)定高表達IL-6的乳腺癌細胞系T47D-IL-6的構建

通過慢病毒感染和嘌呤霉素篩選，成功構建多株穩(wěn)定表達IL-6的T47D細胞，命名為T47D-IL-6。PCR檢測結果顯示，T47D-IL-6細胞中IL-6的mRNA表達水平比僅表達空載體的對照組細胞增高了約100倍（圖2A）。同時ELISA的結果顯示，6孔板內(nèi)培養(yǎng)上清中每孔細胞在12 h內(nèi)檢測分泌出約1 500 pg的IL-6蛋白（圖2B）。

2.3上調(diào)IL-6的表達對乳腺癌細胞侵襲能力的影響

Western blot檢測的結果顯示，穩(wěn)定表達IL-6后T47D細胞中Erk1/2和SHP2的磷酸化水平顯著高于僅表達空載體的對照組細胞（圖3A），這與外源性IL-6的作用結果相一致。同時上調(diào)IL-6的表達顯著增強了乳腺癌細胞T47D的侵襲能力（圖3B）。

2.4IL-6表達升高對乳腺癌細胞EMT發(fā)生的影響

與僅表達空載體的對照組細胞相比，高表達IL-6后細胞由上皮形態(tài)向類成纖維細胞形態(tài)轉變（圖4A），而且上皮標志性蛋白E-cadherin的表達水平顯著降低，間質標志性蛋白Vimentin的表達輕微升高，EMT相關轉錄因子Slug的表達水平也明顯增高（圖4B）。這些結果表明IL-6增強乳腺癌細胞的侵襲能力與其促進細胞發(fā)生EMT有關。

2.5下調(diào)SHP2的表達對乳腺癌細胞遷移和侵襲能力的影響

與轉染對照siRNA的細胞相比，轉染SHP2特異siRNA明顯抑制了T47D細胞中SHP2的表達（圖5A），同時傷口愈合實驗和Transwell實驗的結果也進一步證實下調(diào)SHP2的表達顯著抑制了細胞的遷移和侵襲能力，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.000 1，圖5B、C）。

2.6下調(diào)SHP2的表達對IL-6誘導EMT和Erk1/2磷酸化的影響

下調(diào)SHP2的表達T47D細胞中Erk1/2的表達無明顯變化，但Erk1/2磷酸化的表達水平顯著下降（圖6A）。同時發(fā)現(xiàn)IL-6作用72 h后，SHP2表達下調(diào)明顯減弱細胞中E-cadherin的表達下降，提示SHP2在IL-6誘導乳腺癌細胞EMT過程中發(fā)揮關鍵作用（圖6B）。

圖1　IL-6對乳腺癌細胞遷移能力的影響Figure 1Effect of IL-6 on migration ability of breast cancer cells

圖2　穩(wěn)定高表達IL-6的乳腺癌細胞系建立Figure 2Establishment of IL-6 overexpressing stable T47D cells

圖3　上調(diào)IL-6的表達對T47D細胞侵襲能力的影響Figure 3Effect of IL-6 upregulation on invasion ability of T47D cells

圖4　IL-6表達增高對乳腺癌細胞EMT發(fā)生的影響Figure 4Effect of IL-6 overexpression on EMT of breast cancer cells

圖5　下調(diào)SHP2的表達對乳腺癌細胞侵襲和遷移能力的影響Figure 5Effect of SHP2 knockdown on migration and invasion ability of breast cancer cells

圖6　下調(diào)SHP2對IL-6誘導乳腺癌細胞中Erk1/2磷酸化和E-cadherin表達的Western blot分析Figure 6Western blot analysis of IL-6-induced Erk1/2 phosphorylation and E-cadherin expression in SHP2 knockdown breast cancer cells

3 討論

轉移是導致癌癥患者治療失敗和死亡的主要原因［7］，腫瘤轉移是一個復雜的多步驟的過程。目前的研究表明，腫瘤微環(huán)境對腫瘤轉移起著重要的促進作用，腫瘤微環(huán)境是由癌細胞、基質細胞以及這些細胞分泌的細胞因子、趨化因子等組成［8-9］。這些細胞因子和趨化因子可通過多種路徑調(diào)節(jié)腫瘤的進展，如腫瘤微環(huán)境中的VEGF可促進腫瘤的血管形成，EGF、CXCL12可促進腫瘤的遠處轉移等。研究表明腫瘤微環(huán)境中IL-6的水平升高對乳腺癌的進展起非常關鍵的作用，如IL-6水平升高與患者的淋巴結和遠處轉移密切相關［2］、HER-2陽性的乳腺癌細胞可通過上調(diào)IL-6的水平并形成一個自分泌環(huán)從而促進腫瘤的進展［10］、激活的IL-6信號能夠通過上調(diào)腫瘤干細胞的數(shù)量從而促進HER-2陽性細胞對赫賽汀發(fā)生耐藥，阻斷該信號則可明顯抑制腫瘤的進展［3］。本研究發(fā)現(xiàn)，無論是外源性IL-6或是腫瘤細胞內(nèi)源性表達的IL-6均能夠明顯促進乳腺癌細胞的遷移和侵襲能力，并證實了IL-6在促進乳腺癌進展方面發(fā)揮的重要作用，為深入研究IL-6促進腫瘤細胞侵襲轉移的分子機制，建立了IL-6穩(wěn)定過表達乳腺癌細胞系的理想研究模型。

EMT在腫瘤侵襲轉移過程中發(fā)揮重要作用［11］。當細胞發(fā)生EMT后，由于維持上皮表型的關鍵分子E-cadherin的功能丟失，使得細胞與細胞之間黏附能力降低，上皮表型喪失，隨之獲得間質細胞特性，遷移能力增強。癌細胞發(fā)生EMT后可促進細胞外基質的降解，促進腫瘤細胞向周圍組織浸潤，以及侵入血管發(fā)生遠處轉移等。本研究發(fā)現(xiàn)IL-6表達上調(diào)以后，乳腺癌細胞形態(tài)上發(fā)生類成纖維細胞樣改變，E-cadherin丟失，而且伴隨著侵襲能力的顯著增強，表明IL-6促進乳腺癌細胞的侵襲遷移是通過誘導細胞發(fā)生EMT而實現(xiàn)，與IL-6和癌蛋白YB-1能夠相互作用促進乳腺癌轉移的研究結論相一致［12］。因此，明確IL-6信號通路促進乳腺癌轉移的詳細機制，發(fā)現(xiàn)介導乳腺癌轉移的關鍵分子將有助于篩選新的用于乳腺癌治療的分子靶點［2］。

酪氨酸磷酸酶SHP2在多種腫瘤組織中高表達，與大多數(shù)磷酸酶抑癌作用所不同的是SHP2為一種促進腫瘤發(fā)生和進展的癌基因［13-14］。SHP2的這種作用與其能夠介導MAPK信號通路的激活密切相關［13］。本研究發(fā)現(xiàn)，IL-6促進腫瘤細胞侵襲能力增強的同時伴隨著SHP2和Erk1/2磷酸化水平的增高，提示SHP2可能與IL-6促進乳腺癌細胞侵襲能力增強有關。下調(diào)SHP2的表達顯著抑制了乳腺癌細胞的侵襲能力，同時導致細胞中Erk1/2的磷酸化水平也顯著下降。進一步的研究證實SHP2表達下調(diào)亦抑制了細胞中E-cadherin的表達降下，提示細胞的EMT過程受到抑制，與最近在前列腺癌中的SHP2能夠通過增強EMT促進前列腺癌轉移的研究相一致［15］。以上結果表明SHP2是介導腫瘤細胞發(fā)生EMT的關鍵分子。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)IL-6信號通路的激活能夠促進乳腺癌細胞的侵襲能力，這個過程是通過誘導細胞的EMT而實現(xiàn)。此外，還證實酪氨酸磷酸酶SHP2位于IL-6的下游介導了這個過程。

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（2016-06-24收稿）

（2016-08-31修回）

楊毅專業(yè)方向為惡性腫瘤侵襲轉移的分子機制等研究。

E-mail：yiyang@tmu.edu.cn

SHP2 mediates IL-6-induced enhancement of breast cancer cell invasiveness

Yi YANG，Jie ZHANG，Zhiyong WANG，F(xiàn)ei ZHANG，Ruifang NIU
Correspondence to:Ruifang NIU；E-mail:niuruifang@tjmuch.com

Public Laboratory，Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital，National Clinical Research Center for Cancer，Tianjin Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy，Key Laboratory of Breast Cancer Prevention and Therapy of the Ministry of Education，Tianjin 300060，China

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China（No.81372844）

Objective:To investigate the effect of non-receptor protein tyrosine phosphatase，SHP2，on the regulation of IL-6-induced invasiveness of breast cancer cells as well as its molecular mechanism.Methods:Human breast cancer cells，T47D，were treated with exogenous IL-6 or infected with IL-6-expressing lentivirus.Changes in cell morphology were observed，and cell migration and invasion ability were analyzed.Small interference RNA method was used to downregulate the expression of SHP2，a key molecule in IL-6 pathway.Wound healing and Transwell methods were used to investigate the effect of SHP2 knockdown on cell migration and invasion，and Western blot method was used to examine the changes of Erk1/2 phosphorylation.Results:Upregulation of IL-6 significantly enhances migration and invasion of breast cancer cells.IL-6 induced a significant morphological switch from the epithelial phenotype to the mesenchymal fibroblast phenotype，downregulation of the epithelial marker E-cadherin，and upregulation of mesenchymal marker vimentin.Knockdown of SHP2 inhibited IL-6-induced epithelial mesenchymal transition and invasiveness.Phosphorylation of Erk1/2 also decreased in SHP2-silencing cells.Conclusion:SHP2 mediates IL-6-induced epithelial to mesenchymal transition and promotes invasiveness of breast cancer cells.

SHP2，breast cancer，invasion，IL-6，epithelialmesenchymal transition

10.3969/j.issn.1000-8179.2016.18.744

天津醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所公共實驗室，國家腫瘤臨床醫(yī)學研究中心，天津市惡性腫瘤臨床醫(yī)學研究中心，天津市腫瘤防治重點實驗室，教育部乳腺癌防治重點實驗室（天津市300060）

*本文課題受國家自然科學基金面上項目（編號：81372844）資助

牛瑞芳niuruifang@tjmuch.com