李芳杰，楊華元，王觀濤

（上海中醫(yī)藥大學，上海201203）

激光穴位照射對力竭運動大鼠骨骼肌SOD與MDA含量的影響

李芳杰，楊華元，王觀濤

（上海中醫(yī)藥大學，上海201203）

目的觀察830 nm半導(dǎo)體激光穴位照射對力竭運動大鼠骨骼肌內(nèi)SOD與MDA含量的影響。方法采用大鼠跑臺下坡跑，進行力竭離心運動。將大鼠隨機分為空白組（A組）、模型組（B組）、運動前半導(dǎo)體激光預(yù)照射組（C組）、運動后激光照射治療組（D組）和運動前后激光照射聯(lián)合組（E組），除空白組外，其余各組再分為24 h和48 h亞組，分別為B1組、B2組、C1組、C2組、D1組、D2組、E1組和E2組，每組8只。B組大鼠進行跑臺一次性力竭運動；C組大鼠在力竭運動前激光預(yù)照射7 d，然后進行力竭運動；D組大鼠在運動后給予激光照射；E組大鼠在跑臺運動前給予激光預(yù)照射7 d，運動后再給予激光照射治療的聯(lián)合照射。B1組、C1組、D1組和E1組在運動后24 h取材，B2組、C2組、D2組和E2組在運動后48 h取材。激光采用830 nm半導(dǎo)體激光發(fā)射器，穴位選取大鼠承山穴。觀察各組治療前后骨骼肌丙二醛（MDA）及超氧化物歧化酶（SOD）的含量。結(jié)果B1組、D1組、B2組和C2組肌肉MDA含量與A組比較，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。D2和E2組肌肉MDA含量與B2組比較，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。B1組、C1組、D1組和B2組肌肉SOD含量與A組比較，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。C2組、D2組和E2組肌肉SOD含量與B2組比較，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結(jié)論830 nm激光穴位照射能夠恢復(fù)失衡的氧化還原反應(yīng)。

激光針灸；半導(dǎo)體激光；力竭運動；丙二醛；超氧化物歧化酶；大鼠

運動性肌肉損傷（exercise-induced muscle damage，EIMD）在運動與訓(xùn)練中沒有明顯的疼痛感，僅表現(xiàn)為肌肉酸脹和僵硬，但在運動過后會出現(xiàn)延遲性的肌肉酸痛（delayed onset muscle soreness，DOMS）。Hough T［1］認為，出現(xiàn)DOMS不能認為它只是單純的肌肉疲勞，而是伴有肌肉的損傷存在。他認為肌肉進行長時間、大運動量或不習慣的大量運動會導(dǎo)致疲勞伴隨損傷的發(fā)生，也就是現(xiàn)在很多科研工作者提出的肌肉微損傷。一般認為DOMS能夠自愈，但是這個過程持續(xù)時間較長，嚴重影響了常規(guī)的訓(xùn)練和比賽，還可能造成運動員其他方面的損傷，所以長期以來，DOMS一直是運動醫(yī)學領(lǐng)域的研究熱點。

低強度激光是指不會引起組織細胞的損傷，能對局部甚至全身起到刺激、調(diào)節(jié)和活化作用的小劑量激光［2］。其最大特點是直接照射生物組織時不會造成不可逆的損傷，反而能產(chǎn)生良性的生物刺激、應(yīng)答反應(yīng)以及光化學效應(yīng)，進而調(diào)節(jié)機體的多種生理功能，例如神經(jīng)沖動的傳導(dǎo)、血液的各項功能、各種酶的活性、免疫及代謝等，通過改善和平衡這些功能以協(xié)調(diào)機體的各個系統(tǒng)進而達到治療疾病的目的。

本研究是基于中醫(yī)學針灸專業(yè)學科的特色內(nèi)容結(jié)合運動醫(yī)學領(lǐng)域研究熱點及激光生物物理效應(yīng)進行設(shè)計的，采用830 nm半導(dǎo)體激光的3種不同干預(yù)方法，探討對肌肉組織中丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）含量的影響，現(xiàn)報告如下。

1　材料與方法

1.1實驗動物

健康SD大鼠72只，8周齡，雄性，體重為（200± 32）g，由上海中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供。飼養(yǎng)動物室溫溫度為（24±2）℃，濕度為（45±5）%，適應(yīng)性飼養(yǎng)1星期，按嚙齒類動物國家標準飼料喂養(yǎng)，自由飲水。

1.2主要試劑與儀器

1.2.1主要試劑

丙二醛（MDA）檢測試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）檢測試劑盒及蛋白質(zhì)試劑盒，均由基爾頓生物科技（上海）有限公司提供。

1.2.2主要實驗儀器及設(shè)備

五跑道動物跑臺（浙江杭州立泰科技有限公司）；830 nm半導(dǎo)體激光發(fā)光器（廣東中山市飛線光電有限公司）；YJ82/1型雙路直流穩(wěn)壓電源（上海滬光儀器廠）；高速離心機（德國Eppendorf公司產(chǎn)品）；移液器（吉爾森P型移液，Pipetman）；超低溫冰箱（日本三洋公司）。

1.3動物分組及處理

表1　各組大鼠分組及干預(yù)情況

SD大鼠常規(guī)馴養(yǎng)1星期后，采用隨機數(shù)字法分為空白組（A組）、模型組（B組）、運動前半導(dǎo)體激光預(yù)照射組（C組）、運動后激光照射治療組（D組）和運動前后激光照射聯(lián)合組（E組），除空白組外，其余各組再分為24 h和48 h亞組，分別為B1組、B2組、C1組、C2組、D1組、D2組、E1組和E2組，每組8只。大鼠分組及干預(yù)情況見表1。

1.4模型制備

參考Armstrong RB等［3］的運動模型，采用跑臺下坡跑，進行一次性大運動量力竭離心運動。跑臺速度每分鐘16 m，坡度-16度，一直運動至力竭，在大鼠跑臺運動整個過程中，用敲擊聲音和木筷刺激動物尾部，以使得大鼠能夠始終在跑道的前部，保證了大鼠的運動強度（見圖1）。當大鼠的速度不能與跑臺一致，坐到或趴到跑道上乘電梯樣動作3次，驅(qū)趕刺激無效，完全不再進行跑臺運動，此時視為力竭。大鼠運動至力竭的時間為（180±60）min?？瞻捉M在飼養(yǎng)籠中自由活動。

圖1　大鼠跑臺下坡跑運動示意圖

1.5選穴及激光照射方法

大鼠雙側(cè)承山穴。承山穴定位為大鼠后肢腘窩與跟骨連線的中點，約腓腸肌兩肌腹交界的下端，取穴方法參照林文注主編的《實驗針灸學》［4］及根據(jù)大鼠形態(tài)、生理特點及比較解剖學原理而定。將需要照射的大鼠在大鼠固定器內(nèi)固定，將大鼠雙側(cè)腓腸肌處鼠毛用專用剃毛刀剃除，肢體固定，穴位定位，同時在雙側(cè)承山穴采用830 nm半導(dǎo)體激光發(fā)光器進行激光照射。輸出波長為（830±5）nm，輸出功率＜30 mW，光斑形狀為圓形光班（直徑2～3 mm）。照射時間為10 min，激光光束與皮膚直接接觸。詳見圖2。

圖2　大鼠雙側(cè)腓腸肌接受半導(dǎo)體激光穴位照射示意圖

1.6動物取材和標本制備

力竭運動后24 h組大鼠在24 h節(jié)點取材，48 h組大鼠在48 h時間節(jié)點取材。迅速取右側(cè)腓腸肌，在生理鹽水中清洗，除去可見的結(jié)締組織，用濾紙吸干水分，放入凍存管中，各組材料取完后一起轉(zhuǎn)入-80℃超低溫冰箱保存至檢測。骨骼肌從-80℃冰箱取出解凍后，稱取肌肉組織，加入生理鹽水，按照W:v=1:9比值加入，在冰凍環(huán)境中將肌組織剪碎，再用研磨器將組織磨碎，用以制備成10%的勻漿，然后離心10 min，每分鐘3500轉(zhuǎn)，取出上清液，用來進行肌肉生化指標的檢測?？瞻捉M以相同的方式與運動組一起進行處死、取材全過程。

1.7觀察指標及檢測方法

1.7.1肌肉MDA含量測定

大鼠腓腸肌中MDA含量測定采用硫代巴比妥酸（TBA）法。TBA與DA縮合后能夠形成紅色產(chǎn)物，并且在532 nm處吸收峰最大，利用可見光分光光度計來對他的吸光度進行測定。肌肉MDA含量（nmol/mgprot）=（測定管吸光度值-測定空白管吸光度值）/（標準管吸光度值-標準空白管吸光度值）×標準品濃度/肌肉蛋白含量。

1.7.2肌肉SOD活性測定

大鼠腓腸肌中SOD含量測定采用黃嘌呤氧化酶法。本法是根據(jù)黃嘌呤與黃嘌呤氧化酶進行一系列反應(yīng)產(chǎn)生了超氧陰離子自由基，氧化羥胺成亞硝酸鹽，最后由于顯色劑而呈現(xiàn)出紫紅色，再利用可見光分光光度計來測定他的吸光度。在樣品中如果含有SOD，則可以抑制超氧陰離子自由基，從而達到亞硝酸鹽減少的作用。在比色的時候就會出現(xiàn)測定管的吸光度值會低于對照管的吸光度值，最后再通過公式計算來求出樣品中的SOD活性。肌肉SOD活性（U/mgprot）=（對照管吸光度-測定管吸光度）/對照管吸光度/50%×（反應(yīng)總體積/取樣量）/肌肉蛋白含量。其中SOD活性單位（U）是指每毫克組織蛋白在l mL的反應(yīng)液中的SOD抑制率達50%時所對應(yīng)的SOD量。

1.7.3肌肉蛋白含量測定

大鼠腓腸肌肌肉蛋白含量測定采用考馬斯亮藍法?？捡R斯亮藍顯色劑是呈棕紅色的，當把它加入到樣品中時，使得蛋白質(zhì)分子上的-NH3基團與考馬斯亮藍染料上的陰離子結(jié)合，這時溶液就變?yōu)樗{色，再利用測定吸光度來計算出蛋白含量。蛋白含量=（測定管吸光度-空白管吸光度）×標準管吸光度/（標準管吸光度值-空白管吸光度值）。

實驗中測得的肌肉SOD、MDAC數(shù)據(jù)均用肌肉蛋白含量進行修正。

1.8統(tǒng)計學方法

實驗所有數(shù)據(jù)均采用SPSS21.0統(tǒng)計軟件進行處理，使用數(shù)據(jù)探索SW算法進行正態(tài)分布檢驗，其中指標SOD數(shù)據(jù)滿足正態(tài)分布，各組組間采用單因素方差分析進行差異性顯著性檢驗，MDA指標數(shù)據(jù)不滿足正態(tài)分布，采用非參數(shù)秩和檢驗法進行各組間的差異顯著性檢驗，所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差表示。數(shù)據(jù)插圖采用Excel2003進行制作。以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

由表1可見，B1組、D1組、B2組和C2組肌肉MDA含量與A組比較，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。D2和E2組肌肉MDA含量與B2組比較，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。B1組、C1組、D1組和B2組肌肉SOD含量與A組比較，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。C2組、D2和E2組肌肉SOD含量與B2組比較，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表1　各組大鼠離心運動后肌肉MDA和SOD含量比較（x±s）

3　討論

大鼠在8周齡時，性發(fā)育已成熟，相當于人類的青壯年時期，運動能力屬于最強階段，所以，非常適合我們實驗運動強度的要求。大鼠腓腸肌為后肢的后群肌，屬于抗重力肌肉群，在進行跑臺下坡跑時，腓腸肌收縮是以離心收縮為主，且腓腸肌位置比較表淺，更易于接受低強度激光的照射，故本實驗選取腓腸肌進行研究。

大鼠下坡跑造成的離心收縮模型更接近于人體DOMS的真實情況，故本實驗選取該模型進行研究，在Amstrong的方案基礎(chǔ)上通過延長運動的時間，以求更好地能誘導(dǎo)出動物的EIMD。通過觀察肌組織HE染色結(jié)果、結(jié)蛋白陽性表達程度、檢測血清CK、CK-MM活性等方法判斷肌肉損傷的程度。在Amstrong模型中，大鼠運動的時間是90 min，但是動物在完成該負荷后，再給予額外的刺激時，動物還能繼續(xù)進行跑臺運動，說明疲勞的程度沒有達到要求，要創(chuàng)建力竭性的運動模式，就需要更長的運動時間，更大的運動強度，所以本實驗采取了坡度為-16度（為大鼠下坡跑不打滑的最大斜度），運動速度是16m/min，持續(xù)運動（180±60）min的改進方案，動物在運動后期表現(xiàn)出了非常明顯的疲勞狀態(tài)，從跑道中取出時已完全沒有逃避的能力，表明本研究中的運動模式是一次性的力竭運動，符合EIMD造模的要求。

承山穴［5］是臨床上常用穴位，屬于足太陽膀胱經(jīng)經(jīng)穴，別名魚腹、肉柱。人體上取穴在小腿后面正中，委中與昆侖之間，當足跟上提時，腓腸肌肌腹下出現(xiàn)三角形凹陷處。現(xiàn)代臨床研究［6］證實，承山穴主要治療小腿腓腸肌勞損及痙攣，配合其他穴位還可治療其他疾病，如痔疾、肩關(guān)節(jié)周圍炎等。穴位是人體臟腑經(jīng)絡(luò)之氣輸注并散發(fā)于體表的部位，是與臟腑經(jīng)絡(luò)之氣相通并隨之活動、變化的感受點和反應(yīng)點。《內(nèi)經(jīng)》稱穴位為“氣穴”，是“脈氣所發(fā)”和“神氣之所游行出入”的部位。根據(jù)穴位的基本含義，穴位的功能主要表現(xiàn)在兩個方面，即感受刺激和反映病證，基于以上認識本研究選取承山穴作為半導(dǎo)體激光照射刺激點。

自由基是指含有一個或多個未配對電子的分子、原子、或基團。對于自由基產(chǎn)生的機制，普遍認為，一是黃嘌呤氧化酶機制，即缺血缺氧時，ATP轉(zhuǎn)化為ADP、AMP可轉(zhuǎn)化成次黃嘌呤和黃嘌呤，在黃嘌呤氧化酶作用下，過氧化物陰離子自由基（O2-）被釋放。二是線粒體機制，即線粒體細胞色素氧化酶是機體中多數(shù)氧耗發(fā)生部位。O2被呼吸鏈傳遞的4個電子還原，再與4個H+作用生成2H2O。但在這個過程中，會出現(xiàn)線粒體電子漏現(xiàn)象，少量電子被電子傳遞鏈“漏出”后，與氧直接結(jié)合后形成過氧化物陰離子自由基（O2-），運動使機體代謝增強，耗氧量增加，引發(fā)內(nèi)源性自由基生成增加，自由基特別容易通過得失電子來進行各種各樣的氧化還原反應(yīng)過程，化學活性非?；顫?，各種生物大分子都可以和它接觸并發(fā)生一系列的反應(yīng)，使得生物大分子在結(jié)構(gòu)和功能等方面發(fā)生不同程度的變化［7］。在生理狀態(tài)下，機體也會產(chǎn)生自由基，如活性氧，但這些自由基會被體內(nèi)同時存在的清除系統(tǒng)及時清除，形成一個動態(tài)平衡來維持正常狀態(tài)。在某種原因的作用下，打破了這個已有的平衡，那么在組織中會產(chǎn)生過強的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，使得機體不在正常狀態(tài)。機體內(nèi)不飽和脂肪酸大量存在，當受到過氧化反應(yīng)時，會產(chǎn)生很多脂質(zhì)過氧化物，這些物質(zhì)有很大的細胞毒性。在機體內(nèi)有兩個脂質(zhì)過氧化防御系統(tǒng)，一是包括SOD、CAT、GSH-PX、GSH-R、POD等的酶防御系統(tǒng)；二是包括GSH、維生素E、維生素A、輔酶Q等的非酶防御系統(tǒng)。在這兩個防御系統(tǒng)的作用下，可以終止自由基的連鎖反應(yīng)。Davies KJ等［8］在1982年成功地找到了運動損傷可以使得機體自由基增多的直接證據(jù)，他借助當時新興的電子自旋共振技術(shù)，檢測到了電刺激后或是大強度跑后骨骼肌自由基的變化情況，之后的眾多研究都表明急性大強度運動進行時機體自身清除自由基的能力不能夠平衡在應(yīng)激狀況下產(chǎn)生的自由基，肌肉組織細胞內(nèi)處于一個氧化應(yīng)激的不平衡狀態(tài)，從而引起細胞的變化和損傷。由于運動可以引發(fā)內(nèi)源性自由基生成增加，所以我們認為自由基與運動性肌肉損傷有關(guān)。

MDA是不飽和脂肪酸與自由基發(fā)生反應(yīng)后的一系列代謝產(chǎn)物，它的檢測可以間接地反映體內(nèi)自由基水平。曹國華等［9］報道人體在急性有氧運動后血中MDA含量增加。Brady PS等［10］研究發(fā)現(xiàn)動物在急性大量運動后肌肉、血漿、肝臟的MDA含量增加，還有報道運動后MDA下降的情況出現(xiàn)，在倪耀華［11］的研究中，他讓8名男生在功率自行車上以30%VO2MAX強度一直運動到力竭，檢測血中MDA含量，發(fā)現(xiàn)與安靜時相比有顯著增多，以90%VO2MAX強度一直運動至力竭，通過檢測沒有發(fā)現(xiàn)MDA有顯著變化，運動強度和組織的特異性有可能會影響它的變化，那么從以往眾多研究結(jié)果來看，急性大強度的力竭性運動在一般情況下更容易引起MDA含量增加，運動后肌肉組織中的MDA變化敏感。本研究試驗結(jié)果表明，大鼠力竭運動后，模型組大鼠在24 h與48 h節(jié)點肌肉中MDA含量增高，其中48 h更顯著。3個激光干預(yù)組在24 h節(jié)點只有后照射組含量顯著升高，但在48 h節(jié)點時，后照射組與聯(lián)合照射組效果顯著，顯著低于模型組水平，而預(yù)照射組雖然含量也趨于下降水平，但與模型組沒有顯著性差異。所以我們認為聯(lián)合照射組與后照射組在抑制肌肉組織中MDA含量升高有顯著影響。

活性氧生成過程中，初始產(chǎn)物是超氧陰離子，SOD是活性氧防御的第一線，它含有Cu和Zn離子，能夠?qū)⒊蹶庪x子歧化為H2O2和H20，雖然H2O2仍是有害的活性氧，但是體內(nèi)的過氧化氫酶（CAT）和過氧化物酶（POD）可以把它分解為完全無害的水。研究［12-13］表明，SOD的活性受到細胞內(nèi)pH值和H2O2濃度的影響，過低的pH值或過高濃度的H2O2可以抑制SOD的活性。在本實驗中力竭運動不僅在細胞內(nèi)產(chǎn)生大量的酸性產(chǎn)物，pH值變低，使SOD分子中的組氨酸-61殘基發(fā)生質(zhì)子化，運動消耗了大量的還原型谷胱甘肽，不能及時清除H2O2，可使SOD分子中的CU2+還原CU+，SOD由此而失活導(dǎo)致SOD活性下降。

830 nm半導(dǎo)體激光可影響自由基的生成與清除，既能夠通過抗氧化酶活性的提高來加速自由基的清除，又能夠減少自由基的產(chǎn)生。線粒體內(nèi)的細胞色素c、b等光敏物質(zhì)吸收光束，加強了電子傳遞鏈的藕合作用，使得電子傳遞增強，線粒體功能得以改善，同時可以抑制炎性細胞的呼吸爆發(fā)，最終產(chǎn)生的活性氧自由基減少，同時激光使組氨酸殘基去質(zhì)子化，恢復(fù)SOD分子中Cu和Zn之間的咪唑橋連接，從而重新激活SOD。再者，激光還能提高CAT和POD的活性，加速對H2O2的清除，解除其對SOD活性的抑制，對于抑制SOD下降有顯著影響［12-13］。本研究結(jié)果顯示，運動后進行激光穴位照射，能夠更快地消除由于運動產(chǎn)生的大量自由基及其代謝產(chǎn)物，使得失衡的氧化與抗氧化系統(tǒng)更快地趨于平衡。

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Effect of Acupoint 830 nm Laser Irradiation on Skeletal Muscle SOD and MDA Contents in Exhaustive Exercise Rats

LI Fang-jie，YANG Hua-yuan，WANG Guan-tao.Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 201203，China

ObjectiveTo investigate the effect of acupoint 830 nm semiconductor laser irradiation on skeletal muscle SOD and MDA contents in exhaustive exercise rats.MethodsRats did exhaustive eccentric exercise by downhill treadmill running.Rats were randomized into a blank group（group A），a model group（group B），a pre-exercise semiconductor laser pre-irradiation group（group C），a post-exercise laser irradiation group（group D）and a pre-and post-exercise laser irradiation combination group（group E）.Except the blank group，each of the other groups was again divided into 24 h and 48 h subgroups，and there were groups B1，B2，C1，C2，D1，D2，E1 and E2，8 rats each.Group B rats did one exhaustive exercise by treadmill running.Group C rats

laser pre-irradiation for 7 days before they did exhaustive exercise.Group D rats

laser irradiation after the exercise.Group E rats

laser pre-irradiation for 7 days before treadmill running and combined laser irradiation after the exercise.Specimens were taken in groups B1，C1，D1 and E1 at 24 h after the exercise and in groups B2，C2，D2 and E2 at 48 h after the exercise.A 830 nm semiconductor laser transmitter was used for laser irradiation.Point Chengshan was selected in the rats.Skeletal muscle superoxide dismutase（SOD）and malondialdehyde（MDA）contents were measured in every group before and after treatment.ResultsThere was a statistically significant difference in muscular MDA content between group B1，D1，B2 or C2 and group A（P＜0.05）and between group D2 or E2 and group B2（P＜0.05）.There was a statistically significant difference in muscular SOD content between group B1，C1，D1 or B2 and group A（P＜0.05）and between group C2，D2 or E2 and group B2（P＜0.05）.ConclusionAcupoint 830 nm semiconductor laser irradiation can restore unbalanced oxidation-reduction reactions.

Laser acupuncture；Semiconductor laser；Exhaustive exercise；Malondialdehyde；Superoxide dismutase；Rats

加

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2016.01.0085

1005-0957（2016）01-0085-05

國家科技支撐計劃項目（2012BAI25B03）

李芳杰（1982-），女，博士

楊華元（1952-），男，教授，博士生導(dǎo)師

2015-08-12