翟佳麗，陳　松，田家星，張旭東，劉　歡，劉川東，趙光濤

（濱州醫(yī)學院，煙臺 264003）

針刺對睡眠剝奪大鼠學習記憶功能及前額葉皮質(zhì)BDNF表達的影響

翟佳麗，陳松，田家星，張旭東，劉歡，劉川東，趙光濤

（濱州醫(yī)學院，煙臺 264003）

目的觀察針刺對睡眠剝奪（SD）大鼠學習記憶功能及前額葉皮質(zhì)BDNF表達的影響，為針刺療法用于臨床治療SD提供理論依據(jù)。方法將60只大鼠隨機分為對照組、模型組和針刺組，每組20只。模型組大鼠通過水上站立法建立SD大鼠模型，針刺組通過針刺神門穴進行干預治療，對照組大鼠不做任何處理。分別于SD24 h、72 h后利用Morris水迷宮方法檢測各組大鼠學習記憶功能，然后處死取腦，通過免疫組化方法檢測大鼠前額葉皮質(zhì)BDNF表達量的變化。結(jié)果針刺組和模型組SD24 h、72 h后體重、定位航行時間、空間搜索實驗結(jié)果及前額葉皮質(zhì)內(nèi)BDNF表達量與對照組比較，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。針刺組SD24 h、72 h后定位航行時間和空間搜索實驗結(jié)果與模型組比較，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。針刺組SD72 h后體重及前額葉皮質(zhì)內(nèi)BDNF表達量與模型組比較，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結(jié)論針刺可明顯改善SD導致大鼠學習記憶功能下降，并可改善大鼠前額葉皮質(zhì)因SD導致的BDNF表達下降。

針刺；睡眠剝奪；穴，神門；學習記憶功能；BDNF；大鼠

睡眠與人類每一項生理活動息息相關，其生理重要性與呼吸及心跳相等。睡眠能促進個體的生長發(fā)育，并具有易化學習、形成和維持記憶的功能。近年來，越來越多的動物和臨床實驗［1-3］表明，睡眠在學習、記憶進程中發(fā)揮了重要作用。睡眠剝奪（sleep deprivation， SD）指由于各種原因引起的睡眠丟失狀態(tài)，可引起情緒、學習記憶、免疫功能等一系列改變［4］。有研究［5］顯示，SD超過20 h即可導致機體認知及學習記憶功能下降。若長期處于SD狀態(tài)，則會引起機體生理及心理狀態(tài)的改變。因此針對SD進行有效治療方法的開發(fā)是目前臨床研究的重點。

針刺是目前對各種病癥非常有效的治療方法之一，因其無副反應、見效快而被廣泛應用。本研究擬通過水上平臺法建立SD大鼠模型，然后選取神門穴進行針刺治療，通過Morris水迷宮檢測針刺對SD大鼠學習記憶功能的改善，以期研究開發(fā)針對SD的安全有效的臨床治療方法，并通過免疫組化方法檢測大鼠前額葉皮質(zhì)BDNF表達變化，為SD發(fā)生機制及針刺治療機制的闡述提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1實驗動物

成年雌性Wistar大鼠60只，體重為180～220 g，購自山東大學實驗動物中心［實驗動物生產(chǎn)合格證號SCXK（魯）20080002］。

1.2實驗儀器與試劑

兔抗大鼠BDNF單克隆抗體（北京博奧森公司）；睡眠剝奪箱（自制）；一次性針刺針（蘇州醫(yī)療用品廠有限公司）；Morris水迷宮實驗系統(tǒng)（北京智多寶生物技術有限公司）；石蠟切片機（德國萊卡）；顯微鏡（德國萊卡）。

1.3動物分組及處理

將60只大鼠隨機分為正常組、模型組和針刺組，每組20只。模型組根據(jù)文獻采用改良多平臺睡眠剝奪法（MMPM）建立睡眠剝奪模型。自制睡眠剝奪鼠箱（110 cm×60 cm×40 cm），10個直徑6.5 cm、高8.0 cm的平臺，平臺間隔15 cm，在平臺周邊注滿水，水溫保持在22℃，水面距平臺面約1.0 cm，鼠在平臺上可自行攝食飲水，并在平臺上活動。當大鼠進入REM睡眠時，由于全身肌肉張力降低，導致軀體失衡而觸水驚醒，確保大鼠不能進入REM睡眠期。針刺組大鼠于實驗前1星期開始針刺。取神門穴，穴位位于大鼠前肢內(nèi)側(cè)腕部橫紋尺骨邊緣。直刺1 mm，行平補平瀉，留針40 min，針刺時間為每日申時（下午15:00—17:00），直至實驗結(jié)束。對照組不作任何處理。

1.4Morris水迷宮訓練

采用Morris水迷宮檢測大鼠學習記憶功能。各組大鼠于實驗前4 d開始水迷宮訓練。每日4次，時間為上午9:00—10:00，下午15:00—16:00。每個時間段訓練2次，每只大鼠訓練間隔為30 s，并對其逃避潛伏期（從入水至找到安全平臺的時間）進行記錄，測試時限定為60 s。水池上空架設1臺攝像機，通過與監(jiān)視器和計算機相連，水迷宮檢測軟件系統(tǒng)即會對大鼠進入水池內(nèi)的運動軌跡和運動時間進行自動跟蹤及記錄。實驗訓練結(jié)束后即開始對模型組及針刺組大鼠進行SD，分別SD24 h、72 h后對各組大鼠進行學習行為學測試。實驗檢測項目為定位航行實驗和空間搜索實驗。檢測時分別將大鼠面向池壁從4個入水點放入水池，并將大鼠從入水到至找到水下隱蔽平臺并站立于其上所用時間進行記錄，作為潛伏期，用s表示，大鼠找到平臺后，讓其在平臺上站立10 s，同時將大鼠運動軌跡進行記錄，觀察各組大鼠找尋平臺運動軌跡規(guī)律。

1.5免疫組化

采用免疫組化方法檢測大鼠前額葉皮質(zhì)BDNF表達變化。水迷宮檢測結(jié)束后各組隨機取10只大鼠，全身灌注，取腦，固定于4%多聚甲醛，然后石蠟包埋，制作石蠟切片，切片厚度為5 μm。將石蠟切片常規(guī)脫水至蒸餾水，微波法抗原修復（修復條件為微波火力中檔，10 min，抗原修復液為EDTA），PBS洗3次，每次3 min；滴加3%雙氧水-甲醇液，完全覆蓋組織，濕盒內(nèi)室溫孵育10 min，PBS漂洗3次，每次3 min；滴加非免疫動物血清，完全覆蓋組織，濕盒內(nèi)室溫孵育20 min，甩去非免疫動物血清，不洗，滴加一抗（PBS稀釋，l:100），需完全覆蓋待檢組織，濕盒內(nèi)4℃孵育過夜；PBS洗3次，每次3 min；滴二抗工作液，完全覆蓋組織，濕盒內(nèi)室溫孵育20 min；PBS洗3次，每次3 min；滴辣根酶標記鏈霉素卵白素工作液完全覆蓋組織，濕盒內(nèi)室溫孵育10 min；PBS洗3次，每次3 min；顯色劑顯色:每張切片滴加新鮮配制的DAB工作液完全覆蓋組織，顯微鏡下掌握顯色程度，自來水充分沖洗，清除殘余顯色劑，蘇木素復染5 min，自來水沖洗5 min，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，染色時設陰性對照，一抗用PBS代替，其它步驟相同。對免疫組織化學染色結(jié)果進行圖像分析，每組動物選取3張切片，每張切片選取的位置盡量一致，同一部位選取3個視野，通過Imagep-Pro Plus6.0對圖像進行累積吸光度值分析。

1.6統(tǒng)計學方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標準差表示，治療前后采用配對t檢驗，組間比較采用方差分析；計數(shù)資料采用卡方檢驗。

2　實驗結(jié)果

2.13組大鼠外觀狀態(tài)比較

3組大鼠在SD前皮毛順滑，有光澤，動作靈敏，精神正常，無倦怠表現(xiàn)，進食飲水正常；模型組大鼠SD24 h后皮毛開始出現(xiàn)倒豎，光澤降低，出現(xiàn)倦怠表現(xiàn)，進食飲水減少；SD72 h后皮毛無光澤，且倒豎現(xiàn)象嚴重，在平臺上站立不穩(wěn)，進食飲水明顯減少，動作遲緩，倦怠異常。針刺組大鼠皮毛光澤下降，出現(xiàn)倒豎現(xiàn)象，外觀與模型組差別不明顯。對照組大鼠在24 h和72 h時外觀并無較大變化。

表1　3組大鼠SD前后體重比較　（x±s，g）

由表1可見，3組大鼠SD前體重比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。針刺組和模型組SD24 h、72 h后體重與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。針刺組SD72 h后體重與模型組比較，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.005）。

2.23組大鼠SD前后定位航行時間比較

定位航行實驗用于測量大鼠對水迷宮學習和記憶的獲取能力。實驗觀察和記錄大鼠尋找并爬上平臺的路線圖及所需時間，即記錄其潛伏期。

由表2、圖1可見，3組大鼠SD前定位航行時間比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。針刺組和模型組SD24 h、72h后定位航行時間與對照組比較，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。針刺組SD244 h、72 h后定位航行時間與模型組比較，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表22　3組大鼠SD 前后定位航行時間比較（x±s，s）

圖1　3組大鼠定位航行結(jié)果示意圖

2.33組SDD前后空間搜索實驗結(jié)果比較

空間搜索實驗用于測量大鼠學會尋找平臺后，對平臺空間位置記憶的保持能力。定位航行實驗結(jié)束后，撤去平臺，記錄大鼠120s內(nèi)穿過原平臺位置的次數(shù)和在原平臺象限探索時間占總時間的百分比。

由表3可見，3組大鼠SD前空間搜索實驗結(jié)果比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。針刺組和模型組SD24 h、72h后空間搜索實驗結(jié)果與對照組比較，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。針刺組SD24 h、72 h后空間搜索實驗結(jié)果與模型組比較，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜00.05）。

表3　3組SD 前后空間搜索實驗結(jié)果比較?。▁±s，%）

2.4免疫組化檢測3組大鼠前額葉皮質(zhì)BDNF表達結(jié)果

由表4、圖2可見，針刺組和模型組SD24 h、72 h后前額葉皮質(zhì)內(nèi)BDNF表達量與對照組比較，差異均具有統(tǒng)計學意義（PP＜0.05）。針刺組SD72 hh后前額葉皮質(zhì)內(nèi)BDNF表達量與模型組比較，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表44　3組大鼠前額葉皮質(zhì)BDNFF 相對表達量比較（x±s，IOD）

4　討論

目前SD最好的治療方法為令其睡眠。藥物治療選擇的藥物主要為中樞興奮藥，這類藥物多為精神藥物，依賴性、耐受性等副反應較大［6］。因此探索一種安全有效、無副反應、不易復發(fā)的治療方法成為目前國內(nèi)外研究的熱點。

神門穴為手少陰心經(jīng)原穴，具有寧心安神的功能，臨床常用于治療失眠、健忘等癥狀。有研究［7］報道，通過針刺神門等穴，配合心理療法治療飛行員睡眠障礙67例，結(jié)果治愈52例，治愈率為77.6%。

圖2　各組大鼠前額葉皮質(zhì)BDNF免疫組化染色（×400）結(jié)果

Morris水迷宮是在1986年由Moorris等設計，用于測試大鼠的空間學習能力，現(xiàn)被廣泛使用［8］。SD可導致機體接受和語言表達、記憶以及復雜的口頭算數(shù)等能力下降［9］。葉晨靜等［10］研究發(fā)現(xiàn)SD可導致大鼠出現(xiàn)反應次數(shù)的錯誤逐漸增加，在恢復一定時間的睡眠后，錯誤反應出現(xiàn)的次數(shù)漸漸下降，可見SSD可以影響動物的學習記憶能力。劉國龍等［11］建立睡眠剝奪大鼠模型后，利用Morrris水迷宮實驗檢測大鼠空間學習記憶能力，發(fā)現(xiàn)睡眠剝奪組大鼠的逃避潛伏期延長，穿過原平臺位置次數(shù)和在原平臺象限探索時間百分率下降（P＜0.05）。本研究Morris水迷宮實驗中定位航行及空間搜索結(jié)果顯示睡眠剝奪可導致大鼠空間學習記憶功能下降，而針刺神門穴進行干預治療后可改善大鼠學習記憶功能。

學習記憶是腦的高級功能之一，涉及多個腦區(qū)，其中前額葉皮質(zhì)是參與了學習記憶功能的重要腦區(qū)［12］，同時眾多研究表明BDNF與大鼠的學習記憶能力有密切的關系［13］，BDNF可改善大鼠學習記憶能力作用主要通過增加海馬和大腦皮層NNMDAR受體亞單位NR1和NR22B的磷酸化水平，進而誘導LTTP形成和維持，并可增加神經(jīng)元數(shù)目或突觸數(shù)目，調(diào)節(jié)突觸可塑性，影響學習記憶功能。本研究發(fā)現(xiàn)模型組大鼠在SD24 hh后BDNF表達呈升高趨勢，而在SD72 h后則迅速下降，可見在SD24 h后機體可能通過增加BDNF的表達來做出相應的應激保護反應，在SD72h后表達迅速下降則表明長期睡眠剝奪有可能超出了機體自我調(diào)節(jié)范圍，結(jié)合Morris水迷宮結(jié)果可以看出大鼠學習記憶功能在睡眠剝奪后迅速下降；針刺組大鼠在進行干預治療后，其前額葉皮質(zhì) BDNNF表達明顯高于模型組，而在SD72 h后則呈現(xiàn)表達下降，但仍高于模型組，結(jié)合Morrris水迷宮結(jié)果可看出針刺可以改善大鼠學習記憶功能，而其作用可能是通過促進前額葉皮質(zhì)BDNFF表 達而改善突觸可塑性實現(xiàn)。

［1］Homung OP, RRegen F, Danker--HoPfe H, et al.The relationshipp between REM slleep and memoryconsolidation in oold age and effectss of cholinergic medication[J]. BiolPsyehiatry, 2007，61（6）:750-757.

［2］Ishikawa A, KKanayama Y, Mattsumura H, et all. Selective rapidd eye movementsleep deprivationimpairs the mainntenance of long--term potentiationn in the rat hippoccampus[J]. Eur J NNeurosci, 2006，244（1）:243-248.

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［4］Deaconson TF,O’Hair DP, Levyy MF, et al. Sleepp deprivation andd resident performmance[J]. JAMA, 19988，260（12）:17221-1727.

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［8］Morris RG, Andderson E, Lynch GGS, et al. Selectiive impairment off learning and bloockade of long-terrm potentiation byy an N-methyl-D--aspartate receptoor antagonist, AP55[J]. Nature, 1986，319（6056）:774--776.

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［11］劉國龍，趙明亮，萬子兵，等.睡眠剝奪對大鼠空間學習記憶的影響及其LTP機制的研究［J］.第三軍醫(yī)大學學報，22006，28（6）:569--572.

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Influence of Acupuncture on Learning and Memorial Function and the Expression of BDNF in Prefrontal Cortex of Rats with Sleep Deprivation

ZHAI Jia-li, CHEN Song, TIAN Jia-xing, ZHANG Xu-dong, LIU Huan, LIU Chuan-dong, ZHAO Guang-tao.Binzhou Medical College,Yantai 264003,China

ObjectiveTo investigate the influence of acupuncture on learning and memorial function and the expression of BDNF in prefrontal cortex of rats with sleep deprivation (SD), for providing theoretical evidence for treating sleep deprivation with acupuncture. MethodSixty Wistar rats were randomly divided into a control group, a model group, and an acupuncture group, 20 rats in each group. SD models were established by the modified multiple platform methods; the acupuncture group was intervened by acupuncture at Shenmen (HT 7); while the control group was left intact. Respectively after SD for 24 h and 72 h, the learning and memorial function was tested by using Morris water maze. Ten the rats were sacrificed to collect brain for detecting the expression of BDNF in prefrontal cortex via immunohistochemical method. ResultThe body weight, learning and memorial function, and the expression of BDNF in prefrontal cortex of the acupuncture group and model group were significantly different from those of the control group after SD for 24 h and 72 h (P＜0.05). The learning and memorial function of the acupuncture group was significantly different from that of the model group after SD for 24 h and 72 h (P＜0.05). The body weight and expression of BDNF in prefrontal cortex of the acupuncture group were significantly different from those of the model group after SD for 72 h (P＜0.05). ConclusionAcupuncture can obviously improve the decline of the function of learning and memory of the SD rats, and also up-regulate the declined expression of BDNF in prefrontal cortex caused by SD.

Acupuncture; Sleep deprivation; Point, Shenmen (HT 7); Learning and memorial function; BDNF; Rats

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2016.01.0094

1005-0957（2016）01-0094-04

濱州醫(yī)學院大學生科技創(chuàng)新活動基金（BY2013DKCX082）

翟佳麗（1984 - ），女，講師

趙光濤（1984 - ），男，實驗師，Email:zgt2727@sina.com

2015-09-28