韓　晶，王　健，于曉華，吳富東

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，濟(jì)南250014；2.單秋華全國(guó)名老中醫(yī)藥專家傳承工作室，濟(jì)南250011；3.山東中醫(yī)藥大學(xué)，濟(jì)南250355）

·動(dòng)物實(shí)驗(yàn)·

電針對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠下丘腦和脊髓腺苷A1受體表達(dá)的影響

韓晶1，2，王健2，3，于曉華2，3，吳富東3

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，濟(jì)南250014；2.單秋華全國(guó)名老中醫(yī)藥專家傳承工作室，濟(jì)南250011；3.山東中醫(yī)藥大學(xué)，濟(jì)南250355）

目的觀察腺苷A1受體對(duì)疼痛及電針鎮(zhèn)痛的影響，探討電針鎮(zhèn)痛的作用機(jī)制。方法以佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠為研究對(duì)象，將24只大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組和電針組，每組8只。應(yīng)用輻射熱行為測(cè)痛法觀察佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠的痛閾變化，采用免疫組化法、實(shí)時(shí)熒光定量PCR法觀察腺苷A1受體在下丘腦和脊髓的表達(dá)及電針的影響。結(jié)果造模后1 d，模型組和電針組右后足痛閾與同組造模前比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。模型組和電針組造模后1 d右后足痛閾與正常組比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。造模后7 d，模型組大鼠右后足痛閾仍明顯低于同組造模前（P＜0.01），與正常組和電針組比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。電針組大鼠造模后7 d痛閾提高，與同組造模后1 d比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。模型組陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)降低，與正常組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。電針組較模型組ADORA1表達(dá)增強(qiáng)，兩組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。模型組下丘腦和脊髓的ADORA1mRNA表達(dá)下調(diào)，與正常組比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。電針組下丘腦和脊髓組織的ADORA1mRNA表達(dá)上調(diào)，與模型組比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)論電針能夠上調(diào)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠下丘腦和脊髓腺苷A1受體的表達(dá)。

電針；腺苷A1受體；關(guān)節(jié)炎，佐劑性；針刺鎮(zhèn)痛；大鼠

腺苷受體（adenosine receptor，AR）是一類G蛋白偶聯(lián)的受體家族，其中A1受體與腺苷的親和力最高，二者結(jié)合后在痛覺信息的傳遞和調(diào)控過(guò)程及炎癥反應(yīng)中具有非常重要的作用。Goldman N等［1］研究發(fā)現(xiàn)，針刺可能通過(guò)機(jī)體局部釋放腺苷并作用于腺苷A1受體而發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。因此，探討腺苷A1受體參與炎癥痛及電針鎮(zhèn)痛，是研究電針治療炎癥痛作用機(jī)制的重要出發(fā)點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)以腺苷A1受體為切入點(diǎn)，建立佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠模型，應(yīng)用輻射熱行為測(cè)痛法、免疫組化法及實(shí)時(shí)熒光定量PCR法，探討腺苷A1受體參與佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠疼痛及電針鎮(zhèn)痛的作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)告如下。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雄性Wistar大鼠24只，清潔級(jí)，體重為（200±20）g，2～3月齡，購(gòu)自山東魯抗動(dòng)物試驗(yàn)中心（許可證號(hào)SCXK魯20080002）。所有大鼠飼以全價(jià)顆粒鼠飼料，室溫約為23℃，濕度約為60%，隨意進(jìn)食和飲水，24 h晝夜節(jié)律下飼養(yǎng)。動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)開始前適應(yīng)性馴養(yǎng)3 d，然后進(jìn)行基礎(chǔ)痛閾的篩選，選取痛閾穩(wěn)定、雙側(cè)腳掌縮足反射潛伏期無(wú)明顯差別，并且縮足反射潛伏期時(shí)間（痛閾值）在8～16 s者用于實(shí)驗(yàn)，凡縮足反射潛伏期時(shí)間低于8 s或高于16 s者，表示動(dòng)物反應(yīng)過(guò)敏或遲鈍，均不納入實(shí)驗(yàn)。

1.2主要試劑與儀器

1.2.1試劑

弗氏完全佐劑（CFA，質(zhì)量濃度10 g/L，美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品）；多聚甲醛（Paragormal-dehyde）；氯化鈉（Nacl）；二甲苯；無(wú)水乙醇；石蠟；0.1 M PBS；0.01 M枸櫞酸鹽緩沖液；多聚賴氨酸；一抗:兔抗ADORA1多克隆抗體（濃度1:1000，abcam公司）；免疫組化染色試劑盒、DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋生物公司提供）；異丙醇；氯仿；RNA提取試劑盒Trizol Reagant、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒［TAKARA，寶生物工程（大連）有限公司］。

1.2.2儀器

針灸針（0.30 mm×15 mm，蘇州醫(yī)療用品廠有限公司）；HANS-100A型韓氏疼痛治療儀（南京聯(lián)創(chuàng)濟(jì)生醫(yī)療科技有限公司）；BWE-410A型熱痛刺激儀（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所）；JY1002型電子分析天平（上海金鵬分析儀器有限公司）；微量進(jìn)樣器（上海光正醫(yī)療儀器有限公司）；腦立體定位儀（JWI-C型，上海川沙花農(nóng)機(jī)廠）；Acuu-Cut SRM石蠟切片機(jī)（日本SAKURA公司）；濕盒（上海鼎杰生物科技有限公司）；電熱恒溫培養(yǎng)箱（山東濰坊醫(yī)療器械廠）；-80℃超低溫冰箱（日本Scotsman AF100）；-20℃低溫冰箱（中國(guó)海爾電器集團(tuán)）；直立顯微照相系統(tǒng)（日本Olympus公司）；Nikon YS2（三目）顯微鏡（日本Nikon Optical Co. Ltd）；ABI9500型熒光定量PCR儀（美國(guó)ABI）；微量移液器（德國(guó)EPPendorf公司）。

1.3AA大鼠模型的建立

參照文獻(xiàn)［2］，在無(wú)菌條件下，用1 mL注射器在大鼠右后足跖皮下注射CFA 0.1 mL，用指腹輕按注射點(diǎn)片刻，然后松開，4 h后右后踝及足趾部開始出現(xiàn)紅腫，1 d左右達(dá)到高峰，損害關(guān)節(jié)明顯紅腫疼痛，跛行或不敢著地，形成佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠模型。

1.4動(dòng)物分組及處理

按隨機(jī)數(shù)字表分為正常組、模型組和電針組，每組8只。

正常組不造模，不電針，實(shí)驗(yàn)第2天開始對(duì)大鼠進(jìn)行束縛固定，將大鼠束縛在特制的鼠架上，頭尾可以動(dòng)，軀干不能轉(zhuǎn)動(dòng)。每日30 min，連續(xù)7 d。

模型組實(shí)驗(yàn)第1天建立AA大鼠模型，不電針，第2天開始用與正常組同樣的方法且同一時(shí)間束縛固定。每日30 min，連續(xù)7 d。

電針組實(shí)驗(yàn)第1天造模，方法同模型組，第2天開始用與正常組同樣的方法且同一時(shí)間束縛固定，然后在其清醒狀態(tài)下進(jìn)行電針。取大鼠右側(cè)L3、L5夾脊穴（第3、5腰椎棘突下旁開約3 mm，參考華興邦的大鼠針灸穴位圖譜），采用0.30 mm×15 mm不銹鋼毫針直刺，刺透大鼠皮膚，進(jìn)針約6～8 mm，然后接韓式疼痛治療儀，強(qiáng)度以引起大鼠右后肢肌肉輕微抖動(dòng)且不引起嘶叫（1 mA）為宜，波形選用疏密波（2/100 Hz），持續(xù)30 min。每日1次，連續(xù)7 d。

1.5痛閾測(cè)定

采用大鼠對(duì)熱刺激所引起的縮足反應(yīng)潛伏期（PWL）時(shí)間作為痛閾指標(biāo)。測(cè)定方法根據(jù)文獻(xiàn)［3］，將大鼠放入BWE-410A型輻射熱測(cè)痛儀的透明有機(jī)玻璃罩（20 cm×15 cm×20 cm）中，罩底部為距實(shí)驗(yàn)臺(tái)30 cm的2 mm厚的玻璃板，打開光源為12 V/35 W鹵素?zé)?，刺激溫度?5℃～60℃，調(diào)節(jié)燈源和玻璃板之間的距離，保持熱源強(qiáng)度恒定不變。將大鼠放在罩內(nèi)穩(wěn)定，約15～20 min后即處于安靜狀態(tài)，用強(qiáng)光照射大鼠的右后足墊部，記錄從開始照射到出現(xiàn)縮足逃避反應(yīng)所用的時(shí)間（s），即縮足反應(yīng)潛伏期（PWL），作為痛閾值。分別測(cè)定造模前、造模后1 d、造模后7 d的右后足痛閾。每次測(cè)量均重復(fù)3次，測(cè)量間隔時(shí)間5 min，取3次的平均值作為測(cè)定的結(jié)果。設(shè)定PWL的上限值（即電源切斷時(shí)間）為30 s。痛閾測(cè)定均在上午8～12點(diǎn)由固定人員進(jìn)行操作和記錄，保證實(shí)驗(yàn)室安靜及室溫、濕度相對(duì)穩(wěn)定。

1.6取材

取材時(shí)，每只大鼠各取下丘腦和脊髓標(biāo)本的一半置于4%多聚甲醛4℃保存，用于免疫組化；另一半標(biāo)本置于-80℃冰箱凍存，用于熒光定量PCR檢測(cè)。

1.7免疫組化

1.7.1標(biāo)本處理

取4%多聚甲醛4℃保存的大鼠下丘腦和脊髓組織，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片。將切片脫蠟至水化，微波修復(fù)抗原。3%雙氧水消除內(nèi)源性過(guò)氧化酶活性，滴加5%正常山羊血清，室溫孵育后滴加一抗（濃度1:1000），4℃冰箱過(guò)夜，加入生物素化山羊抗兔IgG，室溫孵育后加入辣根酶標(biāo)記的二抗，孵育，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。陰性對(duì)照為PBS代替一抗。鏡下觀察細(xì)胞膜及細(xì)胞漿呈現(xiàn)棕黃色為陽(yáng)性細(xì)胞并拍照記錄。圖片用Image-Pro Plus5.1軟件處理，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞的平均光密度值。

1.7.2觀測(cè)指標(biāo)

用光學(xué)顯微鏡觀察大鼠下丘腦和脊髓ADORA1的神經(jīng)細(xì)胞，以細(xì)胞膜及細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)的棕黃色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞。每張切片在高倍鏡下選取5個(gè)不同的視野，用顯微圖像分析系統(tǒng)（Image Pro Plus 5.1）檢測(cè)，分析各部位每張切片的平均光密度值。

1.8熒光定量PCR

1.8.1引物序列（見表1）

表1　熒光定量PCR引物序列

1.8.2標(biāo)本的采集與處理

取出大鼠下丘腦和脊髓后，-80℃冰箱保存待測(cè)。按照Trizol說(shuō)明書提取總RNA，在紫外分光光度儀上測(cè)定A260/A280比值，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書要求，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增。每個(gè)樣本的檢測(cè)均重復(fù)3次，以β-actin為內(nèi)對(duì)照。觀察擴(kuò)增曲線和熔解曲線，采用相對(duì)定量法2-△△Ct公式比較各組的基因表達(dá)情況［4］，2-△△Ct＞1，目的基因表達(dá)上調(diào)，反之下調(diào)。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS16.0進(jìn)行處理。重復(fù)測(cè)量資料采用重復(fù)測(cè)量資料的方差分析、多元方差分析，組間比較采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)多個(gè)樣本均數(shù)比較的單因素方差分析（one-way analysis of variance，ANOVA）。用Microsoft Excel XP繪制統(tǒng)計(jì)圖。

2　結(jié)果與分析

2.1大鼠一般情況

正常組大鼠皮毛光亮，精神狀態(tài)佳，飲食正常。模型組與電針組大鼠注射CFA后，約4 h后右后踝及足趾部開始出現(xiàn)紅腫，1 d左右達(dá)到高峰，呈現(xiàn)典型的佐劑性關(guān)節(jié)炎原發(fā)性損害表現(xiàn)，即右后足及踝關(guān)節(jié)明顯紅腫，關(guān)節(jié)體積增大，活動(dòng)明顯減少，跛行或右后足不敢著地，并表現(xiàn)出煩躁、多動(dòng)不安、易激惹等癥狀，提示造模成功。

2.2電針腰夾脊穴對(duì)AA大鼠痛閾的影響

以熱痛刺激儀測(cè)定的大鼠右后足對(duì)熱刺激所引起的縮足反應(yīng)潛伏期（PWL）時(shí)間作為痛閾，觀察3組大鼠造模前、造模后1 d、造模后7 d的痛閾變化。

由表2、圖1可見，3組造模前右后足痛閾比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。造模后1 d，模型組和電針組右后足痛閾與同組造模前比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。模型組和電針組造模后1 d右后足痛閾與正常組比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。造模后7 d，模型組大鼠右后足痛閾仍明顯低于同組造模前（P＜0.01），與正常組和電針組比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。電針組大鼠造模后7 d痛閾提高，與同組造模后1 d比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），提示在大鼠右后足注射弗氏完全佐劑后形成炎癥痛模型后，痛閾明顯降低，電針腰夾脊穴可明顯提高大鼠的痛閾。

表2　3組大鼠右后足痛閾比較（x±s，s）

圖13　組大鼠右后足痛閾變化趨勢(shì)

2.3ADORA1在AA大鼠下丘腦和脊髓的免疫組化表達(dá)

本實(shí)驗(yàn)采用光學(xué)顯微鏡觀察大鼠下丘腦和脊髓的ADORA1神經(jīng)細(xì)胞，以細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)的棕黃色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞。ADORA1陽(yáng)性細(xì)胞在下丘腦分布比較廣泛，在脊髓主要分布在脊髓背角，大多呈橢圓型或梭性，有的可觀察到明顯的胞體和樹突。每張切片在高倍鏡下（40×10）選取5個(gè)不同的視野，用顯微圖像分析系統(tǒng)（Image Pro Plus 5.1）檢測(cè)，分析每張切片陽(yáng)性細(xì)胞的平均光密度值。

由圖2可見，正常組大鼠下丘腦和脊髓ADORA1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目較多，分布集中；模型組僅見少量陽(yáng)性細(xì)胞，呈散在分布，顏色較淺，表達(dá)減弱；電針組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量增多，顏色加深，表達(dá)增強(qiáng)。

圖2　各組大鼠下丘腦和脊髓ADORA1免疫組化照片（×400）

由表3可見，模型組陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)降低，與正常組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），說(shuō)明造模后ADORA1在下丘腦和脊髓表達(dá)下調(diào)。電針組較模型組ADORA1表達(dá)增強(qiáng)，兩組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），說(shuō)明電針可刺激中樞激活A(yù)DORA1，提示在炎癥痛的信息傳遞過(guò)程中，有ADORA1的參與，電針的鎮(zhèn)痛抗炎作用機(jī)理與激活中樞的ADORA1有關(guān)。

表33　組ADORA1在下丘腦和脊髓的平均光密度值比較（x±s）

2.4電針對(duì)AA大鼠下丘腦和脊髓ADORA1mRNA表達(dá)的影響

表43　組大鼠ADORA1mRNA表達(dá)比較（2-△△Ct）

以正常組ADORA1mRNA的表達(dá)量作為標(biāo)準(zhǔn)，在此基礎(chǔ)上比較模型組和電針組的相對(duì)表達(dá)量。由表4可見，模型組下丘腦和脊髓的ADORA1mRNA表達(dá)下調(diào)，與正常組比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），說(shuō)明造模后下肢的炎癥刺激可抑制中樞ADORA1的激活。與模型組相比，電針組下丘腦和脊髓組織的ADORA1mRNA表達(dá)上調(diào)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），說(shuō)明電針可激活該受體，提示在炎癥痛過(guò)程中，有ADORA1的參與，該受體可調(diào)節(jié)機(jī)體的疼痛信息傳導(dǎo)及抗炎反應(yīng)，電針鎮(zhèn)痛抗炎的作用機(jī)制與激活中樞的ADORA1有關(guān)。

3　討論

1929年，Drury AN等［5］發(fā)現(xiàn)腺苷是一種很強(qiáng)的血管活性物質(zhì)，具有舒張血管、降壓、減慢心率等作用，從而引起人們的重視。腺苷作為一種神經(jīng)遞質(zhì)，分布于全身各個(gè)部位，其中在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的分布尤為廣泛。它通過(guò)與不同受體的結(jié)合，從而發(fā)揮神經(jīng)調(diào)節(jié)和穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)的雙重作用。正常情況下，腺苷參與多種生理功能的調(diào)節(jié)，如睡眠和覺醒、焦慮、認(rèn)知和記憶等。在一定的病理?xiàng)l件下，如炎癥反應(yīng)中，腺苷能緩解疼痛，抑制炎癥細(xì)胞的激活，從而發(fā)揮重要的鎮(zhèn)痛和抗炎作用。腺苷受體是一類G蛋白偶聯(lián)的受體家族，主要包括A1、A2a、A2b、A3四種亞型［6］，其中A1受體與腺苷的親和力最高，二者結(jié)合后在痛覺信息的傳遞和調(diào)控過(guò)程及炎癥反應(yīng)中具有非常重要的作用。腺苷A1受體在各個(gè)系統(tǒng)都存在，但在神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)水平最高。在大腦皮層、海馬、小腦、丘腦、腦干及脊髓中都有較高密度的分布［7］。Burnstock G等［8］提出嘌呤類物質(zhì)及其受體參與電針鎮(zhèn)痛的假說(shuō)。

Maione S等［9］通過(guò)在大鼠足底注射福爾馬林復(fù)制炎癥痛模型，然后在中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)微量注射腺苷A1受體特異性激動(dòng)劑CCPA，能明顯減輕疼痛性傷害，說(shuō)明腺苷通過(guò)與A1受體的結(jié)合，抑制疼痛反應(yīng)。Doak GJ等［10］將福爾馬林和腺苷Al受體選擇性激動(dòng)劑CHA的混合物注入大鼠后爪，發(fā)現(xiàn)大鼠的縮足次數(shù)與對(duì)照組無(wú)顯著差異，而將福爾馬林和腺苷A1受體選擇性拮抗劑CPT的混合物注入大鼠后爪后，其縮足次數(shù)明顯多于對(duì)照組，其結(jié)果說(shuō)明內(nèi)源性腺苷主要是通過(guò)激活A(yù)1受體而抑制病理性疼痛。而對(duì)于腺苷Al受體缺失的小鼠則會(huì)出現(xiàn)痛覺過(guò)敏的癥狀［11］。此后，Poon A等［12］應(yīng)用角叉菜膠引起的炎癥痛模型，驗(yàn)證了腺苷A1受體在脊髓水平的鎮(zhèn)痛效應(yīng)。以上研究表明，腺苷或者腺苷類似物可通過(guò)激活A(yù)1受體，產(chǎn)生一定的鎮(zhèn)痛作用。對(duì)于腺苷和腺苷A1受體參與鎮(zhèn)痛的作用機(jī)制，也有很多學(xué)者對(duì)其進(jìn)行了研究。Lao LJ等［13］在脊髓切片上觀察到腺苷通過(guò)激活中樞突上的A1受體，抑制Ca2+內(nèi)流，從而抑制SP及谷氨酸的釋放，抑制痛反應(yīng)。Taiwo YO等［14］的研究發(fā)現(xiàn)外周感覺末梢上的A1受體被激活后，可抑制腺苷酸環(huán)化酶，使胞內(nèi)第二信使環(huán)磷酸腺苷（cAMP）濃度下降，進(jìn)而產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用。Goldman N等［1］在給予炎癥痛小鼠和神經(jīng)痛小鼠的足三里穴局部應(yīng)用腺苷Al受體激動(dòng)劑CCPA或者給予針刺，結(jié)果發(fā)現(xiàn)小鼠的足三里穴位局部的腺苷含量明顯增高，痛閾顯著升高，且均能降低小鼠前扣帶回的興奮性突觸后電位，而上述處理對(duì)于腺苷A1受體基因敲除的小鼠沒有任何作用，說(shuō)明針刺可能通過(guò)機(jī)體局部釋放腺苷并作用于腺苷A1受體而發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)免疫組化法檢測(cè)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠下丘腦和脊髓ADORA1蛋白表達(dá)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)ADORA1mRNA的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在炎癥痛模型中，ADORA1表達(dá)下調(diào)，而電針可促進(jìn)該受體的上調(diào)，說(shuō)明炎癥痛時(shí)，各種炎癥刺激抑制了中樞該受體活性，電針可激活該受體，促進(jìn)內(nèi)源性腺苷或腺苷A1受體激動(dòng)劑與之結(jié)合介導(dǎo)炎癥痛的信息傳遞，產(chǎn)生一系列反應(yīng)，從而起到一定的鎮(zhèn)痛抗炎作用。因此，我們推斷，腺苷或腺苷A1受體在炎性疼痛的病理過(guò)程中起到重要作用，而電針的鎮(zhèn)痛抗炎作用可能與該受體的參與密切相關(guān)。研究其參與疼痛信息傳遞的過(guò)程可作為探討針刺作用機(jī)制的重要靶點(diǎn)。當(dāng)然，腺苷及其受體參與鎮(zhèn)痛及免疫調(diào)節(jié)的過(guò)程非常復(fù)雜，還涉及很多傳導(dǎo)通路。Chandrasekera PC［15］等發(fā)現(xiàn)，腺苷與4種受體結(jié)合后可與MAPK信號(hào)通路耦聯(lián)，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化、成熟與存活。另外，腺苷也可通過(guò)參與NF-κB信號(hào)通路，從而抑制CD4+T細(xì)胞炎性細(xì)胞因子的釋放，發(fā)揮抗炎作用［16］。因此，課題組也在G蛋白通路、MAPK通路做了進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究，從而深入研究腺苷及其受體參與電針鎮(zhèn)痛抗炎的作用機(jī)制。

［1］Goldman N，Chen M，F(xiàn)ujita T，et al.Adenosine A1 receptors mediate localanti-nociceptiveeffectsofacupuncture［J］.NatNeurosci，2010，13（7）:883-888.

［2］陳柏松，徐玉東，鐘淑琦，等.大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎模型的建立與評(píng)價(jià)［J］.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，39（6）:489-491.

［3］徐叔云，卞如濂，陳修.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，1991:714-719.

［4］Livak KJ，Schmittgen TD.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2（-Delta Delta C（T））Method［J］.Methods，2001，25（4）:402-408.

［5］Drury AN，Szent-Gy?rgyi A.The physiological activity of adenine compounds with especial reference to their action upon the mammalian heart［J］.J Physiol，1929，68（3）:213-237.

［6］Fredholm BB，IJzerman AP，Jacobson KA，et al.International Union of Pharmacology.XXV.Nomenclature and classification of adenosine receptors［J］.Pharmacol Rev，2001，53（4）:527-552.

［7］Dixon AK，Gubitz AK，Sirinathsinghji DJ，et al.Tissue distribution of adenosinereceptormRNAsintherat［J］.BrJPharmacology，1996，118（6）:1461-1468.

［8］Burnstock G.Acupuncture:a novel hypothesis for the involvement of purinergic signalling［J］.Med Hypotheses，2009，73（4）:470-472.

［9］Maione S，de Novellis V，Cappellacci L，et al.The antinociceptive effectof2-chloro-2’-C-methyl-N6-cyclopentyladenosine（2’-Me-CCPA），a highly selective adenosine A1 receptor agonist，in the rat［J］. Pain，2007，131（3）:281-292.

［10］Doak GJ，Sawynok J.Complex role of peripheral adenosine in the genesis of the response to subcutaneous formalin in the rat［J］.Eur J Pharmacol，1995，281（3）:311-318.

［11］Wu WP，Hao JX，Halldner L，et al.Increased nociceptive response in mice lacking the adenosine A1 receptor［J］.Pain，2005，113（3）:395-404.

［12］Poon A，Sawynok J.Antinociception by adenosine analogs and inhibitorsofadenosinemetabolisminaninflammatorythermal hyperalgesia model in the rat［J］.Pain，1998，74（2-3）:235-245.

［13］Lao LJ，Kumamoto E，Luo C，et al.Adenosine inhibits excitatory transmission to substantia gelatinosa neurons of the adult rat spinal cord through the activation of presynaptic A（1）adenosine receptor［J］.Pain，2001，94（3）:315-324.

［14］Taiwo YO，Levine JD.Further confirmation of the role of adenyl cyclase and of cAMP-dependent protein kinase in primary afferent hyperalgesia［J］.Neuroscience，1991，44（1）:131-135.

［15］Chandrasekera PC，Wan TC，Gizewski ET，et al.Adenosine A1 receptors heterodimerize with β1-and β2-adrenergic receptors creating novel receptor complexes with altered G protein coupling and signaling［J］.Cell Signal，2013，25（4）:736-742.

［16］Romio M，Reinbeck B，Bongardt S，et al.Extracellular purine metabolism and signaling of CD73-derived adenosine in murine Treg and Teff cells［J］.Am J Physiol Cell Physiol，2011，301（2）:C530-C539.

Effect of Electroacupuncture on the Expression of Adenosine A1Receptor in Hypothalamus and Spinal Cord of Adjuvant Arthritis Rats

HAN Jing1，2，WANG Jian2，3，YU Xiao-hua2，3，WU Fu-dong3.1.The Affiliated Hospital of Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Jinan 250014，China；2.Famous Traditional Chinese Medicine Doctor SHAN Qiu-hua’s Inheritance Studio，Jinan 250011，China；3.Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Jinan 250355，China

ObjectiveTo observe the effect of adenosine A1receptor on pain and electroacupuncture analgesia，and to explore the action mechanism of electroacupuncture in analgesia.MethodAdjuvant arthritis rats were taken as the study subjects.24 rats were randomized into a normal group，a model group and an electroacupuncture（EA）group，8 rats in each group.The pain threshold was evaluated by using thermal radiation method，immunohistochemical method and real-time fluorescence quantitative PCR were adopted to observe the expression of adenosine A1receptor in hypothalamus and spinal cord.ResultOne day after modeling，the pain thresholds of right hind paw in the model group and EA group were significantly changed compared to that before modeling in the same group（P＜0.01）.The pain thresholds of right hind paw in the model group and EA group were significantly different from that in the normal group one day after modeling（P＜0.01）.7 d after modeling，the pain threshold of right hind paw in the model group was still significantly lower than that before modeling in the same group（P＜0.01），and it was significantly different from that in the normal group and EA group（P＜0.01）.The pain threshold was significantly enhanced in the EA group 7 d after modeling，and was significantly different from that of 1 d after modeling in the same group（P＜0.01）.The positive cell expression was lower in the model group and was significantly different from that in the normal group（P＜0.01）.The expression of adenosine A1receptor in the EA group was markedly higher than that in the model group（P＜0.01）.The expression of adenosine A1receptor in hypothalamus and spinal cord of the model group was significantly lower than that of the normal group（P＜0.01）.The expression of adenosine A1receptor in hypothalamus and spinal cord of EA group was markedly higher than that of the model group（P＜0.01）.Conclusion EAcan up-regulate the expression of adenosineA1receptor in hypothalamus and spinal cord of adjuvant arthritis rats.

Electroacupuncture；AdenosineA1receptor；AdjuvantArthritis；Acupuncture analgesia；Rats

加

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2016.01.0071

1005-0957（2016）01-0071-05

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81173351）

韓晶（1981-），女，主治醫(yī)師，博士生

吳富東（1952-），男，教授

2015-08-14