雷　燕，肖　洋，張會(huì)軍，王　娟，張文文，盧　剛，王雪鵬

（（1.廣州利洋水產(chǎn)科技股份有限公司，廣東　廣州　510515；2.廣州金水動(dòng)物保健品有限公司，廣東　廣州　510515；3.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東 泰安 271018）

凡納濱對(duì)蝦腸道上皮細(xì)胞微胞子蟲(chóng)PCR檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用

雷燕1，2，肖洋1，2，張會(huì)軍1，2，王娟1，2，張文文1，2，盧剛1，2，王雪鵬3

（（1.廣州利洋水產(chǎn)科技股份有限公司，廣東廣州510515；2.廣州金水動(dòng)物保健品有限公司，廣東廣州510515；3.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東 泰安 271018）

根據(jù)GenBank中對(duì)蝦腸道上皮細(xì)胞微胞子蟲(chóng)（Enterocytozoon hepatopenaei，EHP）的基因保守序列，設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，通過(guò)優(yōu)化 PCR擴(kuò)增條件，建立快速檢測(cè)凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei）EHP的PCR方法。用該方法對(duì)EHP陽(yáng)性蝦進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)相符的330 bp特異性擴(kuò)增條帶，而對(duì)白斑綜合癥病毒（WSSV）、桃拉病毒（TSV）、傳染性皮下及造血器官壞死病毒（IHHNV）、對(duì)蝦桿狀病毒（BP）、“棉花蝦”微孢子蟲(chóng)、黏孢子蟲(chóng)的陽(yáng)性蝦，以及健康蝦的擴(kuò)增結(jié)果為陰性。測(cè)序比對(duì)發(fā)現(xiàn)，PCR產(chǎn)物序列與GenBank EHP基因序列的同源性為99.8%，表明該P(yáng)CR方法檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確。敏感性試驗(yàn)表明，該方法最低可檢測(cè)出約100 fg的EHP質(zhì)粒DNA。用該P(yáng)CR方法檢測(cè)廣東、廣西、江蘇、山東、海南等地的755份臨床樣品，共檢出陽(yáng)性樣品21份。該P(yáng)CR方法可用于凡納濱對(duì)蝦EHP的快速檢測(cè)。

凡納濱對(duì)蝦；腸道上皮細(xì)胞微胞子蟲(chóng)；PCR檢測(cè)；臨床應(yīng)用

凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei）是當(dāng)前世界上規(guī)模最大、產(chǎn)量最高的養(yǎng)殖對(duì)象。近年來(lái)，由于養(yǎng)殖環(huán)境惡化，其病害也越來(lái)越嚴(yán)重，目前，危害凡納濱對(duì)蝦的主要病原有白斑癥病毒（WSSV）、桃拉病毒（TSV）、傳染性皮下及造血器官壞死病毒（IHHNV）、黃頭病毒（YHV）、肝胰腺細(xì)小病毒（HPV）、對(duì)蝦桿狀病毒（BP）、肝胰腺壞死性細(xì)菌（AHPND）、類(lèi)立克次氏體等，為盡早發(fā)現(xiàn)和監(jiān)測(cè)這些病原，均已建立針對(duì)性的快速檢測(cè)技術(shù)［1-5］。

腸道上皮細(xì)胞微胞子蟲(chóng)（Enterocytozoon hepatopenaei，EHP）簡(jiǎn)稱(chēng)“蝦肝腸胞蟲(chóng)”，體長(zhǎng)不到1mm，為凡納濱對(duì)蝦的病原體之一［6］。EHP主要感染對(duì)蝦的腸道表皮及肝胰腺，寄生于肝胰腺小管上皮細(xì)胞，致使對(duì)蝦腸道吸收功能下降，甚至出現(xiàn)腸炎和肝胰腺萎縮現(xiàn)象［7］。EHP最早見(jiàn)于2009年泰國(guó)養(yǎng)殖的斑節(jié)對(duì)蝦（Penaeus monodon）［8］。2011年，在越南罹患白斑綜合癥的斑節(jié)對(duì)蝦中也發(fā)現(xiàn)了EHP［9］，但Amornrat T等［10］稱(chēng)，EHP不是凡納濱對(duì)蝦白斑綜合癥的誘因。2014年，泰國(guó)科學(xué)家研究發(fā)現(xiàn)，EHP是近年來(lái)引起凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)緩慢的主要原因之一［11］。2013年我國(guó)也發(fā)現(xiàn)了EHP，調(diào)查結(jié)果顯示，感染EHP的凡納濱對(duì)蝦不會(huì)大量死亡，但是腸道吸收功能下降，生長(zhǎng)緩慢，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。凡納濱對(duì)蝦感染EHP的最明顯特征是：生長(zhǎng)緩慢，個(gè)體差異大；食欲正常，腸、胃充滿著食物，肝胰腺略萎縮，發(fā)軟，但顏色較深。

EHP可經(jīng)口傳播，亦可垂直傳播［11］，目前尚無(wú)較好的治療方法。為及早發(fā)現(xiàn)EHP感染，及時(shí)處理，有必要建立一種快速、準(zhǔn)確、靈敏的檢測(cè)方法。本研究擬建立凡納濱對(duì)蝦EHP的PCR檢測(cè)方法，為其臨床快速準(zhǔn)確診斷檢測(cè)提供一種快速、敏感、準(zhǔn)確的技術(shù)手段，以盡早檢測(cè)腸道上皮細(xì)胞微胞子蟲(chóng)，減少損失。

1　材料與方法

1.1材料

EHP陽(yáng)性材料取自廣西北海某凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖場(chǎng)，由利洋公司水產(chǎn)動(dòng)物疾控分中心實(shí)驗(yàn)室（下稱(chēng)“本實(shí)驗(yàn)室”）收集、鑒定并保存；健康凡納濱對(duì)蝦采自廣東省江門(mén)市；對(duì)蝦白斑綜合癥病毒（WSSV）、傳染性皮下及造血器官壞死病毒（IHHNV）、桿狀病毒（BP）、桃拉病毒（TSV），“棉花蝦”微孢子蟲(chóng)、對(duì)蝦黏孢子蟲(chóng)陽(yáng)性材料由本實(shí)驗(yàn)室鑒定并保存。pMD19-Enterocytozoon質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存。臨床樣品分別采自廣東、廣西、福建、海南、浙江等地的凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖場(chǎng)。

大腸桿菌 DH5α購(gòu)自北京天根生化科技有限公司，由本實(shí)驗(yàn)室繁殖保存；pMD19-T載體、DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) DL2000購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；2×Taq PCR MasterMix、高純度質(zhì)粒小量抽提試盒、普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒等購(gòu)自北京天根生化科技有限公司。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank中發(fā)布的腸道上皮細(xì)胞微胞子蟲(chóng)核糖體小亞單位RNA基因（登錄號(hào)：KF135645）的保守序列，設(shè)計(jì)一對(duì)特異性的引物序列。上游引物：5′-TGTGGGAGAAATCTTAGTTTT-3′；下游引物：5′-ATTGCGCTTGCTGCCCAGGAT-3′，預(yù)擴(kuò)增片段長(zhǎng)330 bp，引物由華大基因有限公司合成。

1.4DNA的提取

取 EHP陽(yáng)性凡納濱對(duì)蝦的肝胰腺和腸道組織，加500μL TN緩沖液（20 mmol /L Tris /HCl，0.4 mol /L NaCl，pH 7.4），用玻璃勻漿器勻漿，于- 20℃條件下反復(fù)凍融 3次，低速離心，取上清液，采用酚-氯仿法提取DNA，保存于- 80℃，備用。待檢凡納濱對(duì)蝦也按照上述方法取樣處理并提取DNA。

1.5PCR檢測(cè)及其產(chǎn)物測(cè)序驗(yàn)證

在PCR反應(yīng)管中，加入2×Taq PCR MasterMix 10μL，滅菌雙蒸水6μL，1 ng/mL DNA模板3μL和上下游引物（濃度為10μmol/L）各0.5μL，共20μL，振蕩混勻后置于PCR儀上，按照下列擴(kuò)增條件進(jìn)行擴(kuò)增：95℃下預(yù)變性5min；95℃下循環(huán)變性30 s，55℃下退火復(fù)性35 s，72℃下延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)數(shù)；最后72℃下末延伸10min，4℃下保存，用瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。切取陽(yáng)性目的片段，用普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒純化回收，與pMD19-T載體于16℃條件下連接12～16h，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，在含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)板上，于37℃條件下培養(yǎng)12～ 14h后挑取單個(gè)菌落，用LB肉湯培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)后，用高純度質(zhì)粒小量抽提試盒提取質(zhì)粒并進(jìn)行PCR鑒定，篩選出含目的片段的陽(yáng)性重組質(zhì)粒，送華大基因公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果提交 NCBI 中的BLAST進(jìn)行比對(duì)，利用生物軟件分析序列。

1.6PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化

1.6.1對(duì)PCR反應(yīng)體系中各組分濃度的優(yōu)化

1.6.1.1引物濃度采用25μL的PCR反應(yīng)體系，取8個(gè)0.2 mL PCR反應(yīng)管，分別加入2×反應(yīng)混合緩沖液12.5μL，5 U/μL Taq DNA聚合酶0.5μL，DNA模板3.0μL，上游引物P1、下游引物P2（濃度為10μmol/L）各分別加0.25、0.50、0.75、1.00μL，每個(gè)濃度設(shè)一個(gè)平行對(duì)照，用滅菌超純水加至總體積，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.6.2.2Taq DNA聚合酶濃度采用 25μL的PCR反應(yīng)體系，取8個(gè)0.2 mL PCR反應(yīng)管，分別加入2×反應(yīng)混合緩沖液12.5μL，上游引物P1、下游引物P2各0.5μL，DNA模板3.0μL，5 U/μL Taq DNA聚合酶分別加0.25、0.50、0.75、1.00μL，每個(gè)濃度設(shè)一個(gè)平行對(duì)照，用滅菌超純水加至總體積，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.6.2.3DNA模板濃度采用25μL的PCR反應(yīng)體系，取8個(gè)0.2 mL PCR反應(yīng)管，分別加入2×反應(yīng)混合緩沖液12.5μL，上游引物P1、下游引物P2各0.5μL，5 U/μL Taq DNA聚合酶0.5μL，DNA模板（濃度為1 ng/mL）分別加1、2、3、4μL，每個(gè)濃度設(shè)一個(gè)平行對(duì)照，用滅菌超純水加至總體積，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.6.2對(duì)PCR反應(yīng)程序的優(yōu)化取20個(gè)0.2 mL PCR反應(yīng)管，按照1.6.1的最優(yōu)組分濃度加樣，分別按照如下程序擴(kuò)增：94℃下預(yù)變性5min；94℃下變性30 s，退火溫度分別為52.0、52.5、53.0、53.5、54.0、54.5、55.0、55.5、56.0、56.5℃，退火30 s，72℃下延伸30 s，共循環(huán)35次；72℃下延伸10min，最后4℃下保存。每個(gè)退火溫度下設(shè)一個(gè)平行對(duì)照。

反應(yīng)結(jié)束后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，比較電泳結(jié)果，以獲得最優(yōu)的PCR反應(yīng)條件和反應(yīng)程序。

1.7PCR特異性試驗(yàn)

分別提取健康蝦和EHP陽(yáng)性、WSSV陽(yáng)性、IHHNV陽(yáng)性、BP陽(yáng)性和TSV陽(yáng)性蝦，以及“棉花蝦”微孢子蟲(chóng)及黏孢子蟲(chóng)陽(yáng)性蝦的核酸，作為模板，按照1.6中優(yōu)化的操作步驟進(jìn)行PCR反應(yīng)，觀察反應(yīng)的特異性。

1.8PCR敏感性試驗(yàn)

測(cè)定pMD19-Enterocytozoon質(zhì)粒的含量，按10倍遞增稀釋成10 ng/mL、1 ng/mL、100 pg/mL、10 pg/mL、1 pg/mL、100 fg/mL、10 fg/mL、1 fg/mL，再以各濃度梯度的質(zhì)粒作為模板，根據(jù)1.6中已獲得的最佳反應(yīng)程序和體系進(jìn)行PCR，經(jīng)10g/L瓊脂糖凝膠電泳后觀察結(jié)果，檢測(cè)模板的最低檢測(cè)量。

1.9 臨床樣品檢測(cè)試驗(yàn)

應(yīng)用本研究建立的PCR檢測(cè)方法，對(duì)來(lái)自廣東、廣西、福建、海南等地的 755例臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，檢驗(yàn)其準(zhǔn)確性及臨床實(shí)用性。

2　結(jié) 果

2.1PCR檢測(cè)方法的建立

利用設(shè)計(jì)的特異性引物，對(duì)EHP陽(yáng)性凡納濱對(duì)蝦樣品進(jìn)行PCR檢測(cè)，得到與目的條帶大小相符的特異性片段（圖1）。將PCR陽(yáng)性產(chǎn)物分別回收、克隆、測(cè)序，得到一條長(zhǎng)330 bp的序列，與GenBank中發(fā)布的腸道上皮細(xì)胞微胞子蟲(chóng)基因序列的同源性為99.8%。

2.2PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化

不同反應(yīng)條件下下擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果比較，確定優(yōu)化的反應(yīng)體系為：2×Taq PCR MasterMix 10μL，滅菌雙蒸水7μL，DNA模板 2μL，上下游引物各0.5μL；反應(yīng)條件為：95℃下預(yù)變性5min，95℃下循環(huán)變性30 s，56℃下退火復(fù)性35 s，72℃下延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)，72℃下末延伸10min，4℃條件下保存。

圖1　EHP陽(yáng)性凡納濱對(duì)蝦樣品PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.1　Electrophoresis of PCR detection of microsporida Enterocytozoon hepatopenaei in positive Pacific white leg shrimp Litopenaeus vannamei

2.3PCR特異性擴(kuò)增結(jié)果

按1.7 進(jìn)行的PCR特異性試驗(yàn)表明，僅EHP陽(yáng)性蝦可擴(kuò)增出與預(yù)期大小相符的目的條帶，而健康蝦及其他對(duì)照組均未擴(kuò)增出任何條帶（圖2）。

圖2　特異性擴(kuò)增結(jié)果Fig.2　The result of specific amplification by this method

2.4PCR敏感性擴(kuò)增結(jié)果

敏感性測(cè)定表明，該P(yáng)CR檢測(cè)方法最低能檢出100 fg的pMD19- Enterocytozoon質(zhì)粒模板（圖3）。

圖3　敏感性試驗(yàn)結(jié)果Fig.3　Result of sensitivity detection by this method

2.5臨床檢測(cè)結(jié)果

用建立腸道上皮細(xì)胞微胞子蟲(chóng)的PCR檢測(cè)方法，對(duì)755份來(lái)自廣東、廣西、江蘇、山東、海南等地凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖場(chǎng)的臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，共檢出陽(yáng)性樣品21份，陽(yáng)性率2.78%（表1）。

表1　應(yīng)用建立的PCR檢測(cè)方法對(duì)不同地區(qū)臨床樣品EHP的檢測(cè)結(jié)果Table 1　Detection results of EHP in clinical samples collected from different areas using this method

3　討 論

在最初發(fā)現(xiàn)EHP時(shí)，并未發(fā)現(xiàn)其與對(duì)蝦生長(zhǎng)緩慢有關(guān)。盡管EHP不會(huì)引起病蝦死亡，但對(duì)蝦生長(zhǎng)極其緩慢［11］，目前已在越南、泰國(guó)、馬來(lái)西亞、印度尼西亞和中國(guó)等亞洲國(guó)家養(yǎng)殖的凡納濱對(duì)蝦中發(fā)現(xiàn)，被認(rèn)為是近年來(lái)養(yǎng)殖凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)緩慢的主要原因之一。我國(guó)廣東、廣西、江蘇、山東、海南、天津等地養(yǎng)殖的凡納濱對(duì)蝦中已發(fā)現(xiàn)腸道上皮細(xì)胞微胞子蟲(chóng)。

PCR 檢測(cè)技術(shù)作為一種靈敏的病原檢測(cè)手段，已應(yīng)用于許多病原微生物的檢測(cè)中。本研究根據(jù)GenBank中EHP的基因保守序列，設(shè)計(jì)合成一對(duì)特異性引物，建立EHP 的PCR 檢測(cè)方法。特異性實(shí)驗(yàn)表明，該檢測(cè)方法僅對(duì) EHP 的基因組片段進(jìn)行特異性 PCR 擴(kuò)增。敏感性試驗(yàn)表明，最低可檢測(cè)約100 fg的EHP 基因組DNA?？梢?jiàn)，本研究建立的凡納濱對(duì)蝦腸道上皮細(xì)胞微胞子蟲(chóng)的 PCR檢測(cè)方法具有特異、敏感、準(zhǔn)確檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)。利用建立的檢測(cè)方法，對(duì)大量的臨床病料進(jìn)行檢測(cè)，其檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確，可用于 EHP 感染初期或處于潛伏期的幼蝦、親蝦以及池塘底泥、水質(zhì)的檢測(cè)。因此，該P(yáng)CR 方法可為EHP 的流行病學(xué)調(diào)查、診斷及進(jìn)出口檢疫提供可靠的技術(shù)手段。

［1］謝數(shù)濤，何建國(guó)，楊曉明，等.套式PCR檢測(cè)斑節(jié)對(duì)蝦白斑癥病毒（WSSV）［J］.青島海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，31（2）：220-224.

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（責(zé)任編輯：劉慶穎）

Development and Application of a PCR Detection Assay of Microsporidium Enterocytozoon hepatopenaei in Pacific White Leg Shrimp Litopenaeus vannamei

LEI Yan1，2，XIAO Yang1，2，ZHANG Hui-jun1，2，WANG Juan1，2，ZHANG Wen-wen1，2，LU Gang1，2，WANG Xue-peng3
（1.Guangzhou Liyang Aqua-Technology Co.Ltd，Guangzhou 510515，China； 2.Guangzhou Jinshui Animal Health Products Co.Ltd.，Guangzhou 510515，China； 3.College of Animal Science and Technology，Shandong Agricultural University，Tai'an 271018，China）

A pair of specific primers was designed，and a rapid PCR method was established for detection of microsporidium Enterocytozoon hepatopenaei in Pacific white leg shrimp Litopenaeus vannamei according to the published gene sequences in GenBank by optimization of the reaction parameters.The specific band of 330 bp were amplified from the positive shrimps，but no specific band was found from shrimps with white spot syndrome virus （WSSV），Taura syndrome virus （TSV），infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus （IHHNV），Baculovirus penaei （BP），andPleistophora-like microsporidium，Myxosporea and healthy shrimps.According to the Sequencing analysis，the sequence of PCR product had 99.8% homology with that of EHP gene in GenBank which indicated the high accuracy of this method.The sensitivity test of this method showed that the lowest detectable limit DNA plasmid of the microsporida was 100 fg.755 clinical shrimp samples collected from provinces of Guangdong，Guangxi，Jiangsu，Shandong，and Hainan were detected by this method，and then 21 positive samples were found.The findings indicated that the PCR assay could be used in the detection of Pacific white leg shrimp samples.

Litopenaeus vannamei； Enterocytozoon hepatopenaei； PCR detection； clinical application

S941.51+3

A

1673-9159（2016）04-0050-05

10.3969/j.issn.1673-9159.2016.04.009

2016-03-12

山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（SDAⅠT-19）；泰安市科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（201440774）；浙江省近岸水域生物資源開(kāi)發(fā)與保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金項(xiàng)目（J2013006）

雷燕（1983－）男，碩士。E-mail：leikunnuy@163.com

王雪鵬（1980—），男，博士，副教授。Email：xpwang@sdau.edu.cn