劉書(shū)成，郭明慧，劉　媛，劉蒙娜，鄧倩琳

（廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院//廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室//廣東省海洋食品工程技術(shù)研發(fā)中心//廣東普通高校水產(chǎn)品深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江 524088）

高密度CO2殺菌和鈍酶及其在食品加工中應(yīng)用的研究進(jìn)展

劉書(shū)成，郭明慧，劉媛，劉蒙娜，鄧倩琳

（廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院//廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室//廣東省海洋食品工程技術(shù)研發(fā)中心//廣東普通高校水產(chǎn)品深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江 524088）

總結(jié)近10年來(lái)國(guó)內(nèi)外在高密度CO2（ Dense phase carbon dioxide，DPCD ） 技術(shù)的基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究領(lǐng)域的相關(guān)工作?；A(chǔ)研究領(lǐng)域主要包括DPCD與食品體系的相平衡、DPCD殺滅微生物營(yíng)養(yǎng)體和芽孢的效果與機(jī)制、DPCD鈍酶的效果與機(jī)制等，應(yīng)用研究領(lǐng)域主要包括DPCD在液體（果蔬汁、啤酒、牛奶）和固體食品（鮮切果蔬、肉制品、海洋食品）加工中應(yīng)用。提出DPCD技術(shù)未來(lái)發(fā)展可能需要解決的問(wèn)題。

高密度CO2；殺菌；鈍酶；液體食品；固體食品

高密度 CO2（Dense phase carbon dioxide，DPCD）是一項(xiàng)非常有前景的食品非熱加工技術(shù)，它是指將食品放置在間歇、半連續(xù)或者連續(xù)處理的設(shè)備中，通過(guò)與加壓CO2或者超臨界CO2（通常溫度＜ 60℃，壓強(qiáng)＜50 MPa）接觸一定時(shí)間，利用壓強(qiáng)場(chǎng)下CO2的分子效應(yīng)實(shí)現(xiàn)殺滅微生物和鈍酶以及蛋白質(zhì)變性等目的，從而使食品得以長(zhǎng)期保藏或直接食用。DPCD技術(shù)與超臨界CO2萃取技術(shù)是不完全相同的。在超臨界CO2萃取過(guò)程中，CO2作為溶劑萃取物料中有效成分；而在DPCD處理過(guò)程中，CO2作為溶質(zhì)溶于水再作用于食品。DPCD主要指超臨界狀態(tài)的CO2，但有時(shí)也包括亞臨界氣態(tài)或液態(tài)CO2。與傳統(tǒng)的熱加工相比，由于DPCD處理過(guò)程中無(wú)氧、溫度低，能更好保留食品的熱敏性成分如維生素、生物活性成分等。與超高壓（100～1000 Mpa）相比，DPCD處理壓強(qiáng)更低、能耗低、成本低、容易操作與控制等。雖然DPCD設(shè)備和運(yùn)行成本高于傳統(tǒng)熱加工，但是其成本遠(yuǎn)低于其他非熱加工技術(shù)（超高壓等）。筆者對(duì)近10年來(lái)國(guó)內(nèi)外研究者在DPCD技術(shù)的基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究方面所做的工作進(jìn)行綜述，以期為該技術(shù)的研究與產(chǎn)品開(kāi)發(fā)提供參考。

1　高密度CO2技術(shù)基礎(chǔ)研究領(lǐng)域

DPCD的基礎(chǔ)理論一直是研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域，它對(duì)于指導(dǎo)設(shè)備和工藝的設(shè)計(jì)與研發(fā)以及在生產(chǎn)中應(yīng)用具有重要的意義。DPCD技術(shù)基礎(chǔ)研究領(lǐng)域主要有：DPCD與食品體系的相平衡、DPCD殺菌效果和模型與機(jī)制、DPCD殺滅芽孢的效果和機(jī)制、DPCD鈍酶效果和模型與機(jī)制等。

1.1高密度CO2與食品體系的相平衡

準(zhǔn)確的相平衡數(shù)據(jù)，特別是CO2在食品體系中的溶解度，對(duì)于設(shè)計(jì)和優(yōu)化工藝和設(shè)備是至關(guān)重要的。根據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)，可將CO2相平衡的研究分為4個(gè)方面：1）大氣中CO2的捕集和封存。研究CO2與吸附劑之間的相平衡。2）超臨界 CO2中的化學(xué)反應(yīng)和酶催化反應(yīng)（包括功能材料的制備）。研究CO2與反應(yīng)物和產(chǎn)物之間的相平衡。3）超臨界CO2萃取生物活性物質(zhì)。研究生物活性物質(zhì)與CO2（共溶劑）的相平衡。4）DPCD的殺菌和鈍酶。研究DPCD與食品體系的相平衡。前3個(gè)方面的研究文獻(xiàn)比較多，而專門(mén)研究CO2與食品體系相平衡的文獻(xiàn)比較缺乏，這主要是因?yàn)槭称肥且粋€(gè)比較復(fù)雜的體系。

有研究者以純水和含有離子的模式水溶液體系，從理論上建立高壓下CO2的溶解度預(yù)測(cè)模型和熱動(dòng)力學(xué)模型，獲得了大量的理論基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為研究DPCD與食品體系的相平衡提供了參考。Diamond等［1］研究了CO2在-1.5～100℃和0.1～100 MPa下在純水中的溶解度和熱力學(xué)模型，Portier等［2］研究了CO2在0～300℃和0.1～30 MPa下在純水和NaCl水溶液中的溶解度，Duan等［3］研究了 CO2在 0～260℃和0～200 MPa下在0～4.5 mol/L的Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Cl-、SO42等離子溶液中的溶解度，Zhao等［4］研究了CO2在50、100、150℃和15 MPa下在NaCl水溶液中的溶解度，Tang等［5］研究了CO2在35、55、95、135℃和 0～40MPa下在含有碳酸氫鹽溶液中的溶解度，Pereira等［6］研究了高溫高壓對(duì)CO2與水體系相平衡密度和界面張力的影響，Deering等［7］研究了CO2在45～96℃和0～35 MPa下溶于水的部分摩爾體積，Efika等［8］研究了在20～177℃和0～64 MPa下CO2與水的飽和密度相行為。

以真實(shí)的食品體系為對(duì)象，研究高壓下CO2與食品體系相平衡的文獻(xiàn)是非常少的，僅有的幾篇文獻(xiàn)主要是建立和預(yù)測(cè)CO2在不同液體食品中的溶解度模型。Tomasula等［9］研究CO2在牛奶中的溶解度，Calix等［10］研究了CO2在40℃和7.58、15.86 MPa下在橙汁、蘋(píng)果汁和模型液體食品中的溶解度，F(xiàn)errentino等［11］研究了 CO2在35、60℃和 7.5、15 MPa下在蘋(píng)果汁中的溶解度和熱力學(xué)模型，F(xiàn)errentino 等［12］研究了CO2在35、40、50℃和7.5、15 MPa下在純水和磷酸二氫鈉（質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.24%、2.4%、4.8%）的食品溶液中的溶解度，iplap等［13］研究了CO2在西紅柿漿中的溶解度。Ferrentino 等［14］研究了CO2在25、35、40℃和8、12MPa下在純水和椰子水溶液中的溶解動(dòng)力學(xué)，Spilimbergo等［15］從理論上分析了壓強(qiáng)下CO2的液氣相平衡熱力學(xué)、CO2-水相體系的熱力學(xué) （電解質(zhì)和非電解質(zhì)模型）、固氣相平衡熱力學(xué)，Giovanna Ferrentino等［16］綜述了測(cè)量CO2溶解度試驗(yàn)裝置的設(shè)計(jì)和CO2在水和復(fù)雜溶液中的溶解度。

這些基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)為研究DPCD殺菌和鈍酶機(jī)理以及優(yōu)化處理工藝參數(shù)奠定了重要的理論基礎(chǔ)。CO2在不同食品體系中的溶解度和相平衡參數(shù)是設(shè)計(jì)DPCD殺菌和鈍酶過(guò)程的重要依據(jù)。因此還需要進(jìn)一步加強(qiáng)研究DPCD在各種食品體系中的溶解度和相平衡。

1.2高密度 CO2殺滅微生物營(yíng)養(yǎng)體的效果和模型及其機(jī)制

1.2.1高密度CO2殺滅微生物營(yíng)養(yǎng)體的效果與影響因素一般情況下，DPCD在＜30 MPa和＜60℃的條件下處理2.5～240min，微生物營(yíng)養(yǎng)體數(shù)量可降低1～9-log［17-18］。影響DPCD殺滅微生物營(yíng)養(yǎng)體效果的因素主要有：CO2物理狀態(tài)和濃度、處理溫度和壓強(qiáng)及時(shí)間、加壓和卸壓速率、循環(huán)加壓、是否攪拌、體系水分含量、微生物類型、起始微生物數(shù)量、微生物培養(yǎng)條件和生長(zhǎng)階段、DPCD系統(tǒng)類型、與其他殺菌技術(shù)聯(lián)合等［17-21］。

CO2物理狀態(tài)：DPCD包括了液體CO2、亞臨界氣態(tài)CO2、超臨界CO2。超臨界CO2既具有液體的密度和溶解度，又具有氣體粘度和擴(kuò)散性，還具有低的表面張力，能改變細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的組成，使CO2快速擴(kuò)散和滲透通過(guò)細(xì)胞壁和細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)［3］。因此，超臨界狀態(tài)的CO2比其他狀態(tài)的CO2更容易殺滅微生物［17-18］。另外，當(dāng)溶解在體系中的CO2達(dá)到飽和時(shí)，對(duì)微生物的殺滅效果最好，因?yàn)闈舛葲Q定了CO2在微生物細(xì)胞中的滲透性［17-18］。

處理壓強(qiáng)、溫度和時(shí)間：壓強(qiáng)和溫度的變化能夠改變CO2的物理狀態(tài)。隨著處理壓強(qiáng)增加，CO2的溶解度增加，加強(qiáng)了細(xì)胞和CO2之間的接觸，促進(jìn)CO2滲透到細(xì)胞內(nèi)，從而提高殺滅效果［22-27］。升高溫度會(huì)使CO2粘度下降和擴(kuò)散性增加，有利于其擴(kuò)散到細(xì)胞內(nèi)，破壞細(xì)胞膜的完整性；但是溫度不能過(guò)高于臨界點(diǎn)，因?yàn)闇囟忍撸珻O2的密度和溶解能力下降很快，降低了CO2從細(xì)胞中提取脂溶性物質(zhì)的能力［26-27］。增加處理時(shí)間能增加DPCD對(duì)微生物營(yíng)養(yǎng)體的殺滅效果，主要是因?yàn)檠娱L(zhǎng)了DPCD與微生物營(yíng)養(yǎng)體的接觸時(shí)間［27］。

加壓和卸壓速率：快速加壓和卸壓可以使CO2在細(xì)胞內(nèi)外快速轉(zhuǎn)移，萃取細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)，爆破和機(jī)械性的破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)?？焖偌訅?，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的CO2可使細(xì)胞迅速膨脹，膨脹到一定程度會(huì)發(fā)生機(jī)械性破裂；接著再快速卸壓，細(xì)胞會(huì)像氣球一樣發(fā)生機(jī)械性的破碎［22-24］。循環(huán)加壓和卸壓也可以提使細(xì)胞膜破裂和通透性增加，加強(qiáng)傳質(zhì)，從而提高殺菌效果［23-24］。

攪拌：在DPCD處理過(guò)程中進(jìn)行攪拌，可以增加CO2向懸浮液中轉(zhuǎn)移和溶解速率，增加CO2與微生物營(yíng)養(yǎng)體的接觸，使CO2更容易滲透細(xì)胞膜［26］。

體系水分含量：體系水分含量越高，DPCD對(duì)微生物營(yíng)養(yǎng)體的殺滅效果越好。細(xì)胞吸收的水分也能使細(xì)胞壁和細(xì)胞膜溶脹，使CO2更容易滲透，加強(qiáng)其殺滅效果［27］。

微生物種類：一般來(lái)說(shuō)，革蘭氏陽(yáng)性菌比革蘭氏陰性菌更耐高壓，因?yàn)樗鼈兊募?xì)胞壁組成存在差異。耐壓微生物的細(xì)胞壁可以阻擋CO2的滲透或可能承受足夠大的壓強(qiáng)。在相同處理?xiàng)l件下，DPCD對(duì)初始微生物數(shù)量少的樣品的殺菌效果要好于初始微生物數(shù)量多的［25］。

微生物培養(yǎng)體系和生長(zhǎng)階段：當(dāng)微生物營(yíng)養(yǎng)體在低于最適溫度、低于或高于最適pH下生長(zhǎng)時(shí)，更容易被DPCD殺滅［17-21］。一般來(lái)說(shuō)，幼體細(xì)胞比成熟細(xì)胞對(duì)DPCD更敏感；穩(wěn)定期的細(xì)胞比對(duì)數(shù)期的細(xì)胞更耐受DPCD［28］。微生物細(xì)胞在DPCD處理過(guò)程中會(huì)受損傷，有些損傷的微生物細(xì)胞再進(jìn)行培養(yǎng)又可以修復(fù)再生長(zhǎng)，而有些微生物細(xì)胞則不可以修復(fù)，這主要與DPCD條件和培養(yǎng)介質(zhì)有關(guān)［17-21］。

DPCD處理系統(tǒng)的類型：能快速使CO2在溶液中溶解并達(dá)到飽和的處理系統(tǒng)能更加有效殺滅微生物［17-21］。在相同條件下，連續(xù)式DPCD處理系統(tǒng)比間歇式DPCD處理系統(tǒng)殺菌更有效，所需時(shí)間更短；半連續(xù)DPCD處理系統(tǒng)也比間歇式DPCD處理系統(tǒng)殺菌更有效［17-21］。這是因?yàn)檫B續(xù)的DPCD處理系統(tǒng)可以使更多的 CO2溶解于溶液中。Kobayashi等使用微泡CO2設(shè)備也比傳統(tǒng)的間歇式處理設(shè)備提高了殺菌效果［29-33］。

雖然DPCD對(duì)微生物營(yíng)養(yǎng)體具有較好的殺滅效果，但很難達(dá)到完全滅菌，一方面是因?yàn)橛绊慏PCD殺菌效果的因素較多，另一方面是因?yàn)镈PCD能夠誘導(dǎo)微生物營(yíng)養(yǎng)體形成亞致死狀態(tài)［34-35］和活的不可培養(yǎng)狀態(tài)［36-39］，在合適的條件下這些微生物營(yíng)養(yǎng)體又可以復(fù)蘇生長(zhǎng)，從而影響殺菌效果。尤其是微生物營(yíng)養(yǎng)體的亞致死狀態(tài)和活的不可培養(yǎng)狀態(tài)，它們?nèi)菀自斐蛇^(guò)高估計(jì)殺菌率，使得產(chǎn)品在后期貯藏過(guò)程中提前發(fā)生腐敗變質(zhì)。因此，應(yīng)重視DPCD殺菌過(guò)程中這兩種狀態(tài)的研究，以采取有效措施提高殺菌率。

1.2.2高密度CO2殺滅微生物營(yíng)養(yǎng)體的模型文獻(xiàn)報(bào)道的DPCD微生物營(yíng)養(yǎng)體的殺滅模型可分為三種類型：（1）線性模型；（2）兩段式模型； （3）三段式模型［40］。對(duì)于線性模型，通常采用一級(jí)動(dòng)力學(xué)進(jìn)行擬合。對(duì)于兩段式模型，可以將曲線上的兩個(gè)階段分別采用一級(jí)動(dòng)力學(xué)進(jìn)行擬合。雖然一級(jí)動(dòng)力學(xué)線性模型對(duì)兩段式的快速階段擬合度較高，但由于其并不能模擬完整的殺滅動(dòng)力學(xué)曲線，故存在明顯缺陷。當(dāng)曲線呈現(xiàn)兩段式或三段式模型時(shí)，需要采用非線性模型進(jìn)行擬合。非線性模型主要有Gompertz模型、修正Gompertz模型、修正Multihi模型、Xiong模型、修正Peleg模型等［41］。另外，除了線性模型和非線性模型外，還有學(xué)者應(yīng)用到多項(xiàng)式模型［42］，它是通過(guò)確定多個(gè)相關(guān)參數(shù)的值來(lái)使曲線或響應(yīng)面更好地貼近數(shù)值。DPCD殺滅微生物營(yíng)養(yǎng)體模型的類型可能與試驗(yàn)數(shù)據(jù)的多少有關(guān)。當(dāng)試驗(yàn)數(shù)據(jù)足夠多時(shí)，曲線表現(xiàn)出凹的形狀；當(dāng)試驗(yàn)數(shù)據(jù)較少時(shí)，其曲線可能表現(xiàn)為兩段式或線性［40］。曲線的形狀還與處理時(shí)間和間隔有關(guān)［41］。

1.2.3高密度 CO2殺滅微生物營(yíng)養(yǎng)體的機(jī)制從1951年首次報(bào)道壓強(qiáng)下CO2可以殺滅微生物開(kāi)始，不斷有研究者提出關(guān)于DPCD對(duì)微生物營(yíng)養(yǎng)體殺滅機(jī)制的各種假說(shuō)。2007年Garcia-Gonzalez等總結(jié)了DPCD殺滅微生物營(yíng)養(yǎng)體機(jī)制，主要概括為7個(gè)方面［17］：1） 細(xì)胞外pH值的降低。壓強(qiáng)下CO2溶解于液體食品或者高水分含量的固體食品中形成H2CO3，電離后生成HCO3-、CO32-、H+，降低了細(xì)胞外pH值，抑制微生物營(yíng)養(yǎng)體生長(zhǎng)。2） 細(xì)胞膜受損。CO2是非極性溶劑，當(dāng)CO2與微生物細(xì)胞接觸時(shí)，CO2會(huì)集聚在親脂性（磷脂）內(nèi)層上，集聚到一定量時(shí)會(huì)由于脂質(zhì)流失而造成細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的紊亂，增加細(xì)胞膜的流動(dòng)性和滲透性；也有研究者認(rèn)為HCO3-作用于極性磷脂的頭部基團(tuán)和細(xì)胞膜表面的蛋白，改變了細(xì)胞膜的最佳表面電荷密度，從而改變了細(xì)胞膜的功能。3）細(xì)胞內(nèi)pH值的降低。由于增加了細(xì)胞膜的通透性，壓強(qiáng)下CO2很容易滲透入微生物細(xì)胞內(nèi)，在細(xì)胞質(zhì)里累積到一定量，會(huì)產(chǎn)生大量H+，細(xì)胞不能及時(shí)排出H+，細(xì)胞內(nèi)pH值就會(huì)降低。細(xì)胞內(nèi)外pH值的劇烈變化，使其難以維持酸堿平衡，活力嚴(yán)重受損。4） pH值降低能鈍化與細(xì)胞代謝相關(guān)的關(guān)鍵酶。5） CO2分子和HCO3-對(duì)代謝的直接抑制。HCO3-濃度是調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)酶活性的重要因子。CO2和HCO3-都是細(xì)胞內(nèi)羧基化反應(yīng)的底物，CO2還是脫羧反應(yīng)的產(chǎn)物。羧基化反應(yīng)對(duì)糖異生和氨基酸和核酸的生物合成都非常重要。溶解的 CO2可以抑制脫羧反應(yīng)。6） 細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)平衡被破壞。CO2進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，溶解于水中生成的HCO3-和CO32-離子，可能使細(xì)胞和細(xì)胞膜上的無(wú)機(jī)離子（如Ca2+、Mg2+等）發(fā)生沉淀，而這些離子對(duì)于維持細(xì)胞與周圍環(huán)境的滲透關(guān)系是非常重要的，從而對(duì)細(xì)胞體積產(chǎn)生嚴(yán)重的影響。7） 細(xì)胞及細(xì)胞膜中脂類被萃取。DPCD作為一種非極性溶劑，能夠萃取細(xì)胞和細(xì)胞膜中的脂質(zhì)成分，改變生物膜結(jié)構(gòu)和擾亂其平衡。這7種DPCD殺滅微生物營(yíng)養(yǎng)體的機(jī)制一般不會(huì)連續(xù)發(fā)生，也不是單獨(dú)發(fā)生，而是同時(shí)發(fā)生在一個(gè)非常復(fù)雜而又相互關(guān)聯(lián)的過(guò)程中。

這7種DPCD殺滅微生物營(yíng)養(yǎng)體的機(jī)制主要從細(xì)胞水平進(jìn)行分析。雖然它們能夠解釋大部分DPCD殺滅微生物營(yíng)養(yǎng)體的試驗(yàn)現(xiàn)象，但是當(dāng)時(shí)這些殺菌機(jī)理大多數(shù)都僅僅是假說(shuō)，缺乏相關(guān)的試驗(yàn)證據(jù)。自 2007年后，有很多研究者從不同的角度設(shè)計(jì)試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證和完善DPCD殺滅微生物營(yíng)養(yǎng)體的機(jī)制。周先漢等證實(shí)了DPCD的pH降低酸化殺菌機(jī)制［43］。Spilimbergo、Garcia-Gonzalez、Li、Yao、Tamburini、Liu、廖紅梅等通過(guò)試驗(yàn)觀察到了DPCD造成微生物細(xì)胞壁和細(xì)胞膜損傷、滲透性增加，同時(shí)造成細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)、核酸、離子等的泄漏，改變了細(xì)胞內(nèi)外電解質(zhì)的平衡等［44-50］。Li等證實(shí)了DPCD鈍化了與微生物代謝相關(guān)的酶類［46］。周先漢和Tamburini等通過(guò)試驗(yàn)觀察到了DPCD萃取出了微生物細(xì)胞膜上的脂類成分，從而改變了細(xì)胞膜的滲透性［51-52］。

另外，還有研究者從分子水平研究了DPCD對(duì)微生物營(yíng)養(yǎng)體的殺滅機(jī)制。DPCD殺菌的分子機(jī)制是建立在細(xì)胞水平的研究基礎(chǔ)上，主要是DPCD會(huì)造成微生物細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)變性與酶失活，影響到參與細(xì)胞形成、能量代謝即作為調(diào)控因子的蛋白質(zhì)的合成與表達(dá)，從而抑制細(xì)胞的代謝活動(dòng)而致死微生物。Kim等用DPCD在10 MPa和35℃處理鼠傷寒沙門(mén)氏菌10min，可溶性蛋白急劇減少，不可溶性蛋白大大增加，認(rèn)為這是DPCD誘導(dǎo)蛋白質(zhì)變性造成的［53］。Kim等［54］用DPCD在40℃和10 MPa處理血清型鼠傷寒沙門(mén)氏菌30min，部分蛋白質(zhì)發(fā)生差異表達(dá)，等電點(diǎn)遷移到 pI7～9區(qū)域。饒偉麗等［55］從蛋白質(zhì)組角度研究發(fā)現(xiàn)DPCD在殺滅大腸桿菌過(guò)程中可顯著降低菌體堿溶性（pH8.0）蛋白的溶解性，并使其分子量構(gòu)成發(fā)生顯著變化；在 37℃和 10～50 MPa處理大腸桿菌菌體蛋白30min，蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中α螺旋和轉(zhuǎn)角逐漸向β折疊轉(zhuǎn)化。廖紅梅等用DPCD處理大腸桿菌，采用SDS-PAGE電泳分析發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)蛋白質(zhì)在處理前后，蛋白質(zhì)種類未發(fā)生變化，但是含量顯著減少，這主要是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)流失到胞外；采用Native-PAGE電泳分析發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)蛋白質(zhì)在處理后，蛋白質(zhì)種類發(fā)生了顯著變化，說(shuō)明一些蛋白質(zhì)發(fā)生了變性；通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)方法分析鑒定了一些參與能量代謝、細(xì)胞生存與增殖、細(xì)胞結(jié)構(gòu)、DNA復(fù)制、膜修復(fù)以及作為全局脅迫調(diào)節(jié)子適應(yīng)脅迫條件的蛋白質(zhì)發(fā)生了顯著差異表達(dá)［56］。王瑩瑩等采用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法研究DPCD對(duì)大腸桿菌菌體蛋白的影響，雙向電泳分析發(fā)現(xiàn) 46個(gè)蛋白質(zhì)有較大差異，經(jīng)鑒定認(rèn)為3個(gè)蛋白質(zhì)參與形成細(xì)胞骨架，9個(gè)蛋白質(zhì)參與細(xì)胞新陳代謝，4個(gè)蛋白質(zhì)與DNA密切相關(guān)；DPCD處理還使大腸桿菌細(xì)胞內(nèi) 31 000～20 000 Da蛋白質(zhì)的α-螺旋含量顯著降低，而且α-螺旋有向β-折疊和無(wú)規(guī)則卷曲轉(zhuǎn)變的趨勢(shì)；43 000～31 000 Da的蛋白質(zhì)β-折疊含量顯著增加。這說(shuō)明DPCD處理誘導(dǎo)了一些細(xì)胞內(nèi)關(guān)鍵性蛋白質(zhì)和酶發(fā)生了變性失活，導(dǎo)致細(xì)胞死亡［57］。楊揚(yáng)等采用轉(zhuǎn)錄組學(xué)與蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)、結(jié)合生物信息學(xué)篩選到了DPCD殺滅大腸桿菌過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用的蛋白質(zhì)，其中 3個(gè)蛋白質(zhì)可能與大腸桿菌的DPCD耐受性提高有關(guān)，還有7個(gè)蛋白質(zhì)在保護(hù)細(xì)胞抵御DPCD脅迫中發(fā)揮重要作用，這些蛋白質(zhì)主要與細(xì)胞結(jié)構(gòu)、細(xì)胞代謝、DNA損傷修復(fù)、熱應(yīng)激等密切相關(guān)；另外，通過(guò)全基因組測(cè)序確定大腸桿菌突變菌株有4個(gè)基因可能與其 DPCD 抗性相關(guān)［58］。總體分析來(lái)看，DPCD能誘導(dǎo)微生物細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)發(fā)生變性，但是具有選擇性，而并不能使所有蛋白質(zhì)發(fā)生變性。至于DPCD能誘導(dǎo)哪些蛋白質(zhì)變性，與DPCD處理強(qiáng)度和微生物種類有關(guān)。DPCD對(duì)與微生物代謝相關(guān)酶類的影響，與對(duì)與微生物相關(guān)的蛋白質(zhì)影響的結(jié)果類似，也具有選擇性，而且也與微生物種類和DPCD處理強(qiáng)度有關(guān)［58］。廖紅梅等檢測(cè)到大腸桿菌經(jīng)DPCD處理后大腸桿菌胞內(nèi)的堿性磷酸酶、亮氨酸芳基酰胺酶、β-半乳糖苷酶活性顯著降低，酸性磷脂酶和萘酚-AS-BI-磷酸水解酶活性降低較少，而對(duì)其他酶無(wú)顯著影響。廖紅梅等檢測(cè)大腸桿菌經(jīng) DPCD處理后細(xì)胞懸浮液在260nm（核酸特征吸收峰）的吸光度顯著增加，主要是細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞，核酸泄露到細(xì)胞外所致［56］。Liao等研究發(fā)現(xiàn)大腸桿菌經(jīng)DPCD處理后，細(xì)胞內(nèi)DNA含量顯著下降，隨著處理強(qiáng)度增加而顯著降低；細(xì)胞內(nèi)大多數(shù)雙鏈DNA發(fā)生部分解旋，說(shuō)明其發(fā)生了變性，但是DNA并沒(méi)有降解，即一級(jí)結(jié)構(gòu)不受影響［59］。

廖紅梅等從細(xì)胞水平和分子水平上對(duì)DPCD殺菌微生物營(yíng)養(yǎng)體的機(jī)制進(jìn)行總結(jié)，歸納為四點(diǎn)［20］：（1） CO2溶于細(xì)胞外的水環(huán)境中，降低胞外pH值；（2） 溶解的CO2接觸細(xì)胞，改變細(xì)胞膜組成，使細(xì)胞膜受損，導(dǎo)致細(xì)胞膜流動(dòng)性降低、滲透性增大，CO2滲透入細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)泄漏到細(xì)胞外；（3）進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的CO2，降低胞內(nèi)pH值，使胞內(nèi)部分蛋白質(zhì)發(fā)生變性和鈍化胞內(nèi)相關(guān)酶類，酶活性下降影響蛋白質(zhì)合成及功能表達(dá)；（4） 進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的CO2使細(xì)胞內(nèi)DNA解鏈變性，從而影響參與細(xì)胞組成、能量代謝、生長(zhǎng)和增殖以及作為協(xié)調(diào)因子的蛋白質(zhì)表達(dá)差異，進(jìn)一步會(huì)影響細(xì)胞的活性及代謝，如外膜蛋白下調(diào)導(dǎo)致膜受損、饑餓誘導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白上調(diào)導(dǎo)致DNA 變性、壓強(qiáng)應(yīng)激蛋白保護(hù)DNA 不斷裂；DPCD還可能鈍化與 DNA 相關(guān)的酶，從而可能影響DNA 的合成和復(fù)制。這些不同的過(guò)程可能同時(shí)發(fā)生也可能循序漸進(jìn)地發(fā)生。

1.3高密度CO2對(duì)微生物芽孢的殺滅效果和機(jī)制

1.3.1高密度CO2對(duì)微生物芽孢的殺滅效果和影響因素由于微生物芽孢具有特殊的結(jié)構(gòu)，使其對(duì)高溫、紫外線、干燥、電離輻射和很多有毒的化學(xué)物質(zhì)都有很強(qiáng)的抗性［60］。能否殺滅芽孢是衡量各種殺菌手段和保證食品安全的最重要指標(biāo)。在溫和（20-40℃和＜30MPa）的條件下單獨(dú)使用DPCD是很難完全殺滅芽孢的［17，61］。影響DPCD殺滅微生物芽孢的因素與影響DPCD殺滅微生物營(yíng)養(yǎng)體的因素是一致的，這里不再詳細(xì)綜述。如：CO2物理狀態(tài)、處理壓強(qiáng)和溫度及時(shí)間、處理介質(zhì)的pH值、水分含量、循環(huán)加壓和處理系統(tǒng)等［62］。超臨界狀態(tài)的CO2比高壓氣態(tài)和液體CO2對(duì)芽孢具有更好的殺滅效果；提高處理壓強(qiáng)和溫度以及延長(zhǎng)處理時(shí)間、循環(huán)加壓和卸壓、微泡CO2處理系統(tǒng)等都可以提高殺滅芽孢的效果；低pH值（pH＜4）和高水分含量的介質(zhì)有利于DPCD殺滅芽孢［62］。

為了提高 DPCD技術(shù)對(duì)微生物芽孢的殺滅效果，很多研究者嘗試將DPCD與其他技術(shù)聯(lián)合使用。目前，已經(jīng)報(bào)道的有：DPCD與熱處理聯(lián)合、DPCD與低pH值聯(lián)合、DPCD與脈沖電場(chǎng)聯(lián)合、DPCD與超高壓聯(lián)合、DPCD與抗菌劑聯(lián)合等技術(shù)。一般情況下，采用DPCD和熱處理聯(lián)合在5～30MPa和35～95℃處理20～2880min，可使芽孢數(shù)量下降0.5～7-log［62］；采用DPCD與低pH值聯(lián)合在5～10 MPa、30～70、pH值2.5～4處理30～120min，可使芽孢數(shù)量下降 4～8-log［62］；采用 DPCD和抗菌劑聯(lián)合在8～30 MPa和35～80℃處理15～240min，可使芽孢數(shù)量下降 1～6-log［62］。Watanabe等發(fā)現(xiàn)在 30MPa下75～95℃范圍內(nèi)對(duì)嗜熱脂肪地芽孢桿菌芽孢的殺滅效果要顯著好于35～65℃范圍的，30 MPa和95℃處理120min對(duì)嗜熱脂肪地芽孢桿菌芽孢的殺滅效果好于熱處理的（95℃/120min）和高壓處理的（95℃ / 30 MPa / 120min）［63-64］。Rao等［65］用DPCD與高溫?zé)崽幚硐嘟Y(jié)合在6.5～25 MPa和82、86、91℃處理0～120min，枯草芽孢桿菌芽孢下降了 7-log。Spilimbergo等［66］用脈沖電場(chǎng)（20 pulses / 25 kV/cm）和SC-CO2（20 MPa / 40℃）處理24h 對(duì)蠟樣芽胞桿菌芽孢具有較好的殺滅效果，經(jīng)脈沖電場(chǎng)處理的芽孢結(jié)構(gòu)被壓縮，容易受到SC-CO2的破壞。近年來(lái)，利用DPCD與抗菌劑聯(lián)合殺滅微生物芽孢的研究比較多，用到的抗菌劑主要有過(guò)氧化氫、叔丁基過(guò)氧化氫、乙醇、醋酸、過(guò)氧乙酸、辛酸、甲酸、植物精油等。這些抗菌劑很多是用于環(huán)境消毒的，而不能用于食品殺菌。Zhang等［67］利用 DPCD（40～80℃/10.3～27.5 MPa）與200×10-6H2O2聯(lián)合處理短小芽胞桿菌芽孢，具有非常好殺滅效果，60℃和27.5 MPa處理4h，芽孢數(shù)量下降了6.28-log，而將H2O2換成添加70%的乙醇，沒(méi)有明顯殺滅芽孢的作用。Park等在100 mL DPCD處理設(shè)備中加入2～10 mL的乙醇在10 MPa和60℃處理60～90min，蠟樣芽胞桿菌生物膜中的芽孢被完全殺滅，而單獨(dú)用DPCD處理120min對(duì)其沒(méi)有殺滅效果［68］。Park等用乙醇作為共溶劑在10 MPa和40℃處理45min，含有107CFU/ml的草酸青霉菌芽孢被完全殺滅［69］。Casas等用0.02%牛至（oregano）精油與DPCD聯(lián)合在10 MPa和80℃處理紅辣椒30min，包括芽孢在內(nèi)的所有微生物殺滅 99.5%［70］。Setlow等利用DPCD與過(guò)氧乙酸聯(lián)合作用對(duì)枯草芽孢桿菌芽孢具有很好的殺滅效果［71］。

1.3.2高密度CO2殺滅微生物芽孢的機(jī)制微生物營(yíng)養(yǎng)體和微生物芽孢的結(jié)構(gòu)具有很大的差異，因此，DPCD對(duì)它們的殺滅機(jī)制是不同的。有研究者基于 DPCD殺滅微生物芽孢的動(dòng)力學(xué)，提出了DPCD殺滅微生物芽孢的可能機(jī)制：芽孢首先被DPCD激活和萌發(fā)，而后被DPCD殺滅［63，72-75］。然而，不清楚DPCD是如何誘導(dǎo)芽孢激活和萌發(fā)的。還有研究者通過(guò)觀察DPCD處理前后芽孢的微觀形態(tài)結(jié)構(gòu)，提出了另外一個(gè)DPCD殺滅微生物芽孢的可能機(jī)制：DPCD處理使芽孢結(jié)構(gòu)被破壞而致死［61，66-67，76-78］。Rao等［62］對(duì)現(xiàn)有的DPCD殺滅微生物芽孢的機(jī)制進(jìn)行總結(jié)，見(jiàn)圖1（稍有修改）。

1.4高密度CO2鈍酶效果和動(dòng)力學(xué)及其機(jī)制

1.4.1高密度CO2鈍酶效果及其影響因素DPCD能鈍化大多數(shù)使食品品質(zhì)劣變的酶類，其主要有蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、果膠甲酯酶、多酚氧化酶、果膠酶、脂肪氧合酶、過(guò)氧化物酶等。一般情況下，DPCD在＜ 30 MPa和＜ 60℃的條件下處理 10～60min，可使各種酶的殘留活性降低至20%左右，有的甚至可以100%被鈍化［79-80］。影響DPCD鈍酶的因素主要有：CO2物理狀態(tài)、處理壓強(qiáng)和溫度及時(shí)間、處理介質(zhì)及其初始pH值、食品成分、聯(lián)合處理方式，循環(huán)加壓和卸壓、DPCD處理設(shè)備類型等［79-80］。一般來(lái)說(shuō)，超臨界狀態(tài)的CO2比氣態(tài)和液態(tài)CO2對(duì)酶具有更好的鈍化效果，主要是因?yàn)槌R界CO2同時(shí)具有液體和氣體的特殊性質(zhì)能增強(qiáng)與酶分子的相互作用，導(dǎo)致酶失活［79-80］。隨著DPCD處理壓強(qiáng)和溫度的升高，主要改變了CO2的物理狀態(tài)和密度，從而使酶失活［81-89］。延長(zhǎng)處理時(shí)間，增加了酶與DPCD的接觸時(shí)間，從而增加鈍酶效果［81-89］。酶對(duì)酸性環(huán)境比對(duì)堿性環(huán)境更為敏感。DPCD處理會(huì)降低介質(zhì)的pH值，這可能是導(dǎo)致酶失活的原因之一。食品中的成分如糖、鹽等能保護(hù)酶，可能會(huì)降低DPCD對(duì)酶的鈍化效果。水分活度對(duì)DPCD鈍酶效果也有顯著影響，水分含量高，有利于CO2溶解形成碳酸，降低介質(zhì)的pH值，從而鈍化酶類。采用微泡處理也可以提高鈍酶效果［82-83］。對(duì)于一些耐受DPCD的酶類，可以采用聯(lián)合處理的方式，例如DPCD與超高壓聯(lián)合、DPCD與脈沖電場(chǎng)聯(lián)合、DPCD與超聲波聯(lián)合等。另外，循環(huán)進(jìn)行升壓/卸壓處理也可以提高對(duì)酶的鈍化效果。這些影響因素的作用原理與之前對(duì)殺菌影響有類似之處，這里不再詳述。

圖1　DPCD殺滅芽孢的可能機(jī)制［62］Fig.1　Possible mechanism of inactivation spores by DPCD

1.4.2高密度CO2鈍酶動(dòng)力學(xué)動(dòng)力學(xué)參數(shù)是描述鈍化速率常數(shù)與壓強(qiáng)和溫度改變的關(guān)系，是設(shè)計(jì)和優(yōu)化加工食品的參考依據(jù)。對(duì)現(xiàn)有的文獻(xiàn)進(jìn)行分析可知，DPCD鈍酶動(dòng)力學(xué)可分為3類［79-80］：一是一級(jí)動(dòng)力學(xué)，二是分段式動(dòng)力學(xué)，三是部分轉(zhuǎn)化式動(dòng)力學(xué)。一般情況下，先用一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型擬合DPCD鈍酶動(dòng)力學(xué)。在一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型中，酶活是隨時(shí)間線性降低的。對(duì)于不符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型的數(shù)據(jù)可以進(jìn)一步利用分段式動(dòng)力學(xué)模型進(jìn)行擬合，該模型將DPCD鈍酶過(guò)程分為兩個(gè)階段（快速鈍化期和穩(wěn)定鈍化期），兩個(gè)階段也分別符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型。還有一種部分轉(zhuǎn)化式動(dòng)力學(xué)模型。該動(dòng)力學(xué)模型主要考慮到在溫?zé)岷透邏禾幚碇?，只有不穩(wěn)定部分酶被鈍化，隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)，穩(wěn)定部分的酶活性依然不變；采用更劇烈的溫度或者壓強(qiáng)條件可導(dǎo)致酶快速失活，之后失活速度下降。該模型可用于分析等溫-等壓鈍化數(shù)據(jù)。部分轉(zhuǎn)化式模型通常用于一種組分被鈍化而另一組分保持非零值的常數(shù)。

1.4.3高密度 CO2鈍酶機(jī)制在超高壓鈍酶研究中，有研究者認(rèn)為200 MPa以下的壓強(qiáng)對(duì)酶活性無(wú)直接影響，而DPCD處理壓強(qiáng)一般小于50 MPa，這說(shuō)明超高壓和DPCD的鈍酶機(jī)制可能存在本質(zhì)性的差異。關(guān)于DPCD鈍酶機(jī)制，HU等［80］提出了兩種可能機(jī)制：第一，DPCD引起的pH值降低效應(yīng)。因?yàn)?CO2溶于水能形成碳酸，并進(jìn)一步解離出HCO3-、CO32-、H+，從而降低處理介質(zhì)的pH值。升高壓強(qiáng)和溫度會(huì)增加CO2的溶解度，促進(jìn)處理介質(zhì)的酸化，加強(qiáng)CO2與酶分子的相互作用。有些酶對(duì)介質(zhì)pH值的變化比較敏感，因此介質(zhì)pH值降低可能是DPCD鈍化該類酶的主要機(jī)制之一；但是，有些酶對(duì)介質(zhì)pH值的變化不敏感，因此DPCD鈍酶可能存在另外的機(jī)制。第二，CO2的分子效應(yīng)。CO2與酶分子能形成復(fù)合物，降低酶活。精氨酸在低pH值下與CO2接觸，可形成重碳酸鹽復(fù)合物，過(guò)量的CO2還能與蛋白質(zhì)表面的氨基酸殘基形成共價(jià)的氨基甲酸鹽。這些氨基甲酸鹽可引起組氨酸和賴氨酸殘基之間的電荷轉(zhuǎn)移，從而造成酶失活。因此，有學(xué)者提出堿性氨基酸（精氨酸、賴氨酸和組氨酸）可能是 CO2與酶蛋白質(zhì)的結(jié)合位點(diǎn)［90-94］。還有研究認(rèn)為，一些酶能被CO2解離，DPCD的壓強(qiáng)效應(yīng)引起蛋白質(zhì)主鏈結(jié)構(gòu)變化、亞基解聚，導(dǎo)致失活［95-96］。CO2還能與酶活性中心的疏水區(qū)相互作用導(dǎo)致酶失活。隨著壓強(qiáng)升高，CO2密度增加，CO2發(fā)揮其疏水的功能改變了蛋白質(zhì)與分子相互作用的平衡，使蛋白質(zhì)疏水基團(tuán)暴露于親水環(huán)境中［96-97］。CO2的表面張力為零，可以輕松穿過(guò)比其大的分子，破壞酶分子的活性中心。壓強(qiáng)下CO2還具有萃取作用，除去維持酶分子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的必要水分子，改變?nèi)軇┖兔阜肿又g水平衡，導(dǎo)致酶失活［98-99］。DPCD鈍酶很難說(shuō)是某一種效應(yīng)引起的，可能是CO2的多種作用共同引起的。目前關(guān)于DPCD鈍酶機(jī)制還有很多爭(zhēng)論，有些還缺乏試驗(yàn)證據(jù)，還有待于進(jìn)一步深入研究和討論。

2　高密度CO2技術(shù)在食品加工中的應(yīng)用

DPCD已被確認(rèn)為是一種非常有效的非熱殺菌和鈍酶技術(shù)，已在液體食品（果汁、啤酒、牛奶等）和固體食品（鮮切果蔬、肉制品、海產(chǎn)品等）加工領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用研究，也有開(kāi)展DPCD在其他領(lǐng)域（例如制備納米材料、醫(yī)療滅菌、廢水處理等）中的應(yīng)用研究。

2.1高密度CO2在液體食品加工中的應(yīng)用

傳統(tǒng)的果蔬汁加工中采用熱殺菌和鈍酶，但是果蔬汁含有很多對(duì)熱敏感的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)（如維生素、色素等），熱處理不僅使熱敏性營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)喪失，而且會(huì)嚴(yán)重影響其感官品質(zhì)等理化特性。國(guó)內(nèi)外已有大量的研究表明：DPCD對(duì)果汁的殺菌和鈍酶效果是比較好的；與未處理的新鮮果汁相比，DPCD處理的果汁除了維生素C會(huì)稍有損失之外，其感官品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)等理化特性無(wú)顯著變化；但與熱處理相比，DPCD對(duì)果汁感官品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)等理化特性的影響是比較小的。QULE等［100］用 DPCD在25 MPa和40℃處理鮮榨橙汁（pH3.7）90min后，在4℃下貯藏 56 d，未發(fā)現(xiàn)有微生物的生長(zhǎng)，而且橙汁的感官和理化特性與鮮榨果汁無(wú)顯著差異，僅僅維生素 C損失 12%，而熱殺菌損失 46%。LIAO等［101］用DPCD在45 MPa和52℃處理蘋(píng)果汁30min，大腸桿菌數(shù)量下降了7.66-log。Ferrentino等［102］用DPCD在16 MPa和60℃處理蘋(píng)果汁40min，其菌落總數(shù)下降了5-log，而在4℃下貯藏14 d，pH值、糖度和色澤等品質(zhì)與鮮榨果汁無(wú)顯著差異。NIU等［103］用DPCD在20 MPa和20～65℃處理蘋(píng)果汁20min，多酚氧化酶被完全鈍化，果膠甲酯酶被鈍化61.4%，在4℃下貯藏7 d，色澤、濁度等品質(zhì)無(wú)顯著變化。Bae等［78］用DPCD在10 MPa和65℃處理蘋(píng)果汁40min或在8 MPa和70℃處理蘋(píng)果汁30min，Alicyclobacillus acidoterrestris芽孢被完全殺滅，但是對(duì)果汁的pH和糖度等品質(zhì)沒(méi)有影響。廖紅梅等［104-105］用DPCD在30 MPa和40℃處理梨汁60min，細(xì)菌菌落總數(shù)的殘存率降低了2.66-log，殘存酶活為19%，且在4℃條件下貯藏56 d也能較好抑制多酚氧化酶 酶活和保持其品質(zhì)特性。周林燕等［106］用 DPCD在 30 MPa和 55℃處理桃汁 10～40min，與未處理的相比，桃汁的pH值、糖度和酚類物質(zhì)含量無(wú)顯著變化，色澤稍有變暗，抗氧化活性提高。LIU等［107-109］用DPCD在30 MPa和50℃處理西瓜汁30min，可使多酚氧化酶殘留酶活降至4.2%，過(guò)氧化物酶殘存酶活降至40%左右；菌落總數(shù)降低至26 CFU/mL，達(dá)到了GB19297-2003《果蔬汁飲料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》的要求（≤100 CFU/mL）；番茄紅素含量略有下降，總酚含量無(wú)顯著變化，而對(duì)風(fēng)味成分的影響較?。辉?℃貯藏30 d，對(duì)西瓜汁的風(fēng)味影響較小。CHEN等［110-111］用DPCD在35 MPa和55℃處理哈密瓜汁60min，微生物全部被殺滅；多酚氧化酶、過(guò)氧化物酶和脂肪氧合酶的殘留酶活分別降至25.26%、38.46%和0.02%；對(duì)哈密瓜汁的香氣影響較??；在4℃貯藏28 d，風(fēng)味仍然與新鮮的哈密瓜汁接近，但是維生素C有所損失，但是損失的量小于未處理的。Cappelletti和De等［112-113］用DPCD在12MPa和40℃處理椰子水30min，菌落總數(shù)下降了7-log，但降低了揮發(fā)成分含量，其他感官品質(zhì)則與未處理的無(wú)顯著差異，顯著好于熱處理的（90℃ 1min）。

啤酒在熱殺菌過(guò)程中容易產(chǎn)生不良風(fēng)味。Dagan等［114］采用連續(xù)的DPCD處理系統(tǒng)（27.6 MPa / 21℃ / 5%CO2/ 5min）對(duì)啤酒進(jìn)行處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)啤酒的風(fēng)味、泡沫及其穩(wěn)定性、殺菌效果都顯著好于熱處理的（74℃ 30 s）。因此，采用DPCD對(duì)啤酒進(jìn)行冷殺菌既能保證啤酒的新鮮，又不改變啤酒顏色和風(fēng)味，避免了不良風(fēng)味的產(chǎn)生。

DPCD還可有效地殺滅牛奶中的致病菌和腐敗菌。Erkmen等［115］用100 bar / 30℃處理牛乳360min，大腸桿菌下降了94.7%，同樣的條件處理脫脂乳，其大腸桿菌下降了99.36%。廖紅梅等［116］在20 MPa / 37℃下用DPCD處理牛初乳30min，較好地實(shí)現(xiàn)了殺菌，牛初乳色澤變亮，但是粒度增大，粘度和pH值降低，對(duì)其懸浮穩(wěn)定性和口感造成一定影響。鐘葵等［117］在30 MPa /50℃處理牛奶70min，牛奶中菌落總數(shù)降低了5.082個(gè)數(shù)量級(jí)，實(shí)現(xiàn)了較好的殺菌效果。姚春艷等［118］研究發(fā)現(xiàn)，DPCD對(duì)牛乳中微生物具有較好的殺滅效果；DPCD能鈍化牛乳中的蛋白酶，抑制蛋白質(zhì)在貯藏過(guò)程中的分解，短時(shí)加壓的抑制效果好，但溫度對(duì)抑制效果影響較小；但DPCD處理可能使脂肪酶活性增加，導(dǎo)致原料乳脂肪在貯藏過(guò)程中的分解程度變大。

2.2高密度CO2在固體食品加工中的應(yīng)用

與液體食品相比，DPCD技術(shù)要應(yīng)用到固體食品加工中要困難一些。主要是因?yàn)楣腆w食品不能連續(xù)加工，CO2在固體食品中溶解和擴(kuò)散較慢（尤其是含水量少的），還可能對(duì)質(zhì)構(gòu)和品質(zhì)產(chǎn)生不良影響。目前，DPCD技術(shù)應(yīng)用的固體食品主要有鮮切果蔬、肉與肉制品、海洋食品等。

鮮切果蔬是一種受快節(jié)奏生活的城市人歡迎的方便食品，就是去除水果蔬菜的不可食部分，經(jīng)清洗、修整、切割等后，進(jìn)行簡(jiǎn)單包裝，供消費(fèi)者、餐飲業(yè)立即食用或使用，具有新鮮、方便、可百分百食用的特點(diǎn)。但是如何保證鮮切果蔬在加工和貯藏過(guò)程中的食用安全，保持產(chǎn)品品質(zhì)和延長(zhǎng)貨架期？近年來(lái)，很多研究者逐步將DPCD技術(shù)應(yīng)用到鮮切果蔬加工中。Ferrentino等［119］以DPCD對(duì)接種在鮮切胡蘿卜片上的大腸桿菌的殺滅效果為基礎(chǔ)，建立了一個(gè)Weibull模型用于預(yù)測(cè)DPCD對(duì)鮮切胡蘿卜片的殺菌效果。Spilimbergo等［120］在12 MPa和40℃下用DPCD處理胡蘿卜片15min，有效地殺滅了胡蘿卜片中存在的微生物，在4℃可貯藏28 d，活性成分變化較小，但是質(zhì)構(gòu)發(fā)生顯著變化。BI等［121］在5 MPa和20℃下用DPCD處理胡蘿卜片20min，細(xì)菌總數(shù)下降了1.86-log，酵母和霉菌下降了 1.25-log，過(guò)氧化物酶、多酚氧化酶、果膠甲酯酶的殘留活性在處理 15min時(shí)達(dá)到最低，雖然DPCD對(duì)胡蘿卜的硬度（損失僅7.9%）影響較小，但會(huì)造成細(xì)胞膜損傷。Ferrentino等［122］在12 MPa和45℃下DPCD處理鮮切椰肉15min，微生物數(shù)量下降了4-log，椰肉的硬度雖然不受影響，但是其微觀結(jié)構(gòu)遭到了破壞。Valverde等［123］研究發(fā)現(xiàn)，雖然DPCD能抑制梨片中酵母活性，并對(duì)pH值和糖度無(wú)影響，但是使梨片軟化和表面發(fā)黑。因此，Valverde認(rèn)為DPCD可能適用于對(duì)硬度較低的果蔬進(jìn)行低溫殺菌處理。張華等［124-126］用18 MPa和30℃的DPCD處理鮮切蓮藕片30min，實(shí)現(xiàn)了對(duì)鮮切蓮藕片的有效殺菌，鈍化多酚氧化酶和過(guò)氧化物酶等酶活性，并能較好的保護(hù)了鮮切蓮藕片的色澤和品質(zhì)。以上文獻(xiàn)研究表明：DPCD雖然對(duì)鮮切果蔬具有良好的殺菌和鈍酶效果，但對(duì)質(zhì)構(gòu)會(huì)產(chǎn)生一定影響。因此，DPCD應(yīng)用于鮮切果蔬加工，還需要深入開(kāi)展適合的果蔬產(chǎn)品、優(yōu)化操作參數(shù)、合理評(píng)價(jià)品質(zhì)等方面研究。

肉制品和海產(chǎn)品是人類食物蛋白質(zhì)的重要來(lái)源，食用前的殺菌處理一直是加工處理的重要環(huán)節(jié)。有研究表明，DPCD 能夠殺滅肉制品和海產(chǎn)品中的致病菌和腐敗菌。關(guān)于DPCD對(duì)肉制品殺菌的研究主要涉及的材料有豬肉［127-130］、雞肉［131-132］和牛肉［133-135］等，殺菌對(duì)象主要是致病菌。關(guān)于DPCD對(duì)海產(chǎn)品殺菌的研究主要涉及的材料有對(duì)蝦［136-137］和牡蠣［138-139］等，殺菌對(duì)象主要是腐敗菌和致病菌等。筆者曾對(duì)該部分的內(nèi)容做過(guò)綜述［140］，這里不再詳述。與液體食品相比，DPCD 對(duì)肉制品和海產(chǎn)品的殺菌處理強(qiáng)度要大，主要是因?yàn)镃O2在固體食品中不易滲透。雖然DPCD對(duì)肉制品和海產(chǎn)品具有較好的殺菌效果，但是不可避免對(duì)其品質(zhì)會(huì)產(chǎn)生一些影響，例如降低其pH值、持水力下降造成汁液損失、使紅色肉類呈現(xiàn)煮熟的外觀等等。但是相對(duì)于熱處理來(lái)講，DPCD對(duì)肉制品和海產(chǎn)品的品質(zhì)影響要小很多。另外，利用DPCD能誘導(dǎo)蛋白質(zhì)變性的特點(diǎn)，還可將其用于改善蛋白質(zhì)的功能特性［141］和制備凝膠制品［142-144］，例如肉丸、肉腸等。

3　高密度CO2技術(shù)尚待解決的問(wèn)題

一項(xiàng)新的技術(shù)要應(yīng)用于食品工業(yè)化生產(chǎn)，不僅要保障食品安全，還要保障食品品質(zhì)，并使其具有一定的貨架期，同時(shí)還要考慮生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)性。雖然目前已經(jīng)有大量的文獻(xiàn)研究表明DPCD具有很好的殺菌和鈍酶效果，在食品保鮮和加工中具有巨大的應(yīng)用潛力，但是目前尚有許多問(wèn)題有待解決：1）DPCD對(duì)于不同微生物的殺滅效果有差異，不能達(dá)到完全滅菌的效果，尤其是對(duì)芽孢的殺滅效果較差。雖然很多研究者已經(jīng)闡述了DPCD的殺菌機(jī)制，解釋了部分實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象，但是如何提高DPCD的殺菌效果，還需要進(jìn)一步闡明DPCD的殺菌靶點(diǎn)；另外要重視DPCD處理后微生物亞致死和不可培養(yǎng)狀態(tài)的研究，闡明其機(jī)制，以期提供合理措施提高殺菌效果。2） DPCD對(duì)不同酶的鈍化效果也存在差異，對(duì)有的酶（如多酚氧化酶）可以完全鈍化，有的酶（如果膠甲酯酶）則不能完全鈍化，對(duì)有的酶（如脂肪酶）甚至有激活的作用。研究者也提出了DPCD鈍酶的一些機(jī)制，但是DPCD對(duì)鈍酶的選擇性機(jī)制還不清楚，尚待深入研究，為DPCD在不同領(lǐng)域中的應(yīng)用提供參考。3）DPCD與不同類型食品之間相平衡的研究還非常缺乏，需要特別加強(qiáng)深入研究，以期準(zhǔn)確預(yù)測(cè)CO2在不同食品中的溶解度以及處理的工藝參數(shù)（壓強(qiáng)、溫度和處理時(shí)間等）。4）目前關(guān)于DPCD研究的重點(diǎn)在殺菌和鈍酶方面，而對(duì)于處理前后產(chǎn)品的品質(zhì)變化、產(chǎn)品包裝方式、貯藏方式、貯藏過(guò)程的品質(zhì)變化與貨架期等的研究還相對(duì)較少，這是作為技術(shù)應(yīng)用和產(chǎn)品開(kāi)發(fā)必須的一個(gè)環(huán)節(jié)，需要加強(qiáng)研究。5） 通過(guò)積累大量的基礎(chǔ)研究，選擇適合于DPCD處理的食品；6）對(duì)于不同類型的食品（如液體食品和固體食品），可能需要的DPCD設(shè)備有所差異，因此需要針對(duì)食品類型研發(fā)專用的DPCD研究和工業(yè)化生產(chǎn)設(shè)備，并研發(fā)設(shè)備清洗和消毒技術(shù)；7）合理評(píng)估DPCD技術(shù)的經(jīng)濟(jì)性等。相信隨著科學(xué)研究的深入和發(fā)展，這些問(wèn)題都將逐步得到解決，逐步推廣DPCD加工技術(shù)在為食品加工業(yè)領(lǐng)域中的應(yīng)用。

［1］DIAMOND L W，AKINFIEV N N.Solubility of CO2in water from -1.5 to 100℃and from 0.1 to 100 MPa：evaluation of literature data and thermodynamic modeling［J］.Fluid phase equilibria，2003，208（1）：265-290.

［2］PORTIER S，ROCHELLE C.Modelling CO2solubility in pure water and NaCl-type waters from 0 to 300℃ and from 1 to 300 bar：Application to the utsira formation at sleipner［J］.Chemical Geology，2005，217（3）：187-199.

［3］DUAN Z，SUN R.An improved model calculating CO2solubility in pure water and aqueous NaCl solutions from 273 to 533 K and from 0 to 2000 bar［J］.Chemical geology，2003，193（3）：257-271.

［4］ZHAO H，F(xiàn)EDKIN M V，Dilmore R M，et al.Carbon dioxide solubility in aqueous solutions of sodium chloride at geological conditions：Experimental results at 323.15，373.15，and 423.15 K and 150 bar and modeling up to 573.15 K and 2000 bar［J］.Geochimica et Cosmochimica Acta，2015，149（1）：165-189.

［5］TANG Y，BIAN X，DU Z，et al.Measurement and prediction model of carbon dioxide solubility in aqueous solutions containing bicarbonate anion［J］.Fluid Phase Equilibria，2015，386（1）：56-64.

［6］PEREIRA L M，CHAPOY A，BURGASS R，et al.Study of the impact of high temperatures and pressures on the equilibrium densities and interfacial tension of the carbon dioxide/water system［J］.The Journal of Chemical Thermodynamics，2016，93（1）：404-415.

［7］DEERING C E，CAIRNS E C，Mcisaac J D，et al.The partial molar volumes for water dissolved in high-pressure carbon dioxide from T =（318.28 to 369.40）K and pressures to P = 35MPa［J］.The Journal of Chemical Thermodynamics，2016，93（1）：337-346.

［8］EFIKA E C，HOBALLAH R，LI X，et al.Saturated phase densities of（CO2+ H2O）at temperatures from（293 to 450）K and pressures up to 64 MPa［J］.The Journal of Chemical Thermodynamics，2016，93（1）：347-359.

［9］TOMASULA P M，BOSWELL R T.Measurement of the solubility of carbon dioxide in milk at high pressures［J］.The Journal of Supercritical Fluids，1999，16（1）：21-26.

［10］CALIX T F，F(xiàn)ERRENTINO G，BALABAN M O.Measurement of high-pressure carbon dioxide solubility in orange juice，apple juice，and model liquid foods［J］.Journal of Food Science，2008，73（9）：439-445.

［11］FERRENTINO G，BARLETTA D，DONSì F，et al.Experimentalmeasurementsandthermodynamic modeling of CO2solubility at high pressure in model apple juices［J］.Industrial & Engineering Chemistry Research，2010，49（6）：2992-3000.

［12］FERRENTINO G，BARLETTA D，BALABAN M O，et al.Measurement and prediction of CO2solubility in sodium phosphate monobasic solutions for food treatment with high pressure carbon dioxide［J］.The Journal of Supercritical Fluids，2010，52（1）：142-150.

［13］LIPLAP P，RENNIE T J，RAGHAVAN G V.Measurement of CO2solubility in tomato slurry using manometricmethod［J］.AppliedEngineering in Agriculture，2014，30（1）：59-67.

［14］FERRENTINO G，SCHUSTER J，BRAEUER A，et al.In situ Raman quantification of the dissolution kinetics of carbon dioxide in liquid solutions during a dense phase and ultrasound treatment for the inactivation of Saccharomycescerevisiae［J］.TheJournalof Supercritical Fluids，2016，111（1）：104-111.

［15］SPILIMBERGO S，KIKIC I.Thermodynamics of solutions of CO2with effects of pressure and temperature.In Dense Phase Carbon Dioxide：Food and Pharmaceutical Applications［M］.Edited by Murat O B & Giovanna F，A John Wiley & Sons，Ltd，2012.

［16］GIOVANNA F，THELMA C，MASSIMO P，et al.ExperimentalMeasurementofCarbonDioxide Solubility.In Dense Phase Carbon Dioxide：Food and Pharmaceutical Applications［M］.Edited by Murat O B & Giovanna F，A John Wiley & Sons，Ltd.，2012.

［17］GARCIA-GONZALEZ L，GEERAERD A H，SPILIMBERGO S，et al.High pressure carbon dioxide inactivation of microorganisms in foods：The past，the present and the future［J］.International Journal of Food Microbiology，2007，117（1）：1-28.

［18］OSMAN E.Effects of dense phase carbon dioxide on vegetative cells［M］//Dense Phase Carbon Dioxide：Food and Pharmaceutical Applications.Murat O B，Giovanna F.New Jersey：A John Wiley & Sons，Ltd，2012.

［19］DAMAR S，BALABAN M O.Review of dense phase CO2technology：microbial and enzyme inactivation，and effects on food quality［J］.Journal of Food Science，2006，71（1）：1-11.

［20］廖紅梅，廖小軍，胡小松.高壓二氧化碳?xì)⒕鷻C(jī)理研究進(jìn)展［J］.食品工業(yè)科技，2012，33（19）：387-390.

［21］廖紅梅，廖小軍，胡小松，等.影響DPCD技術(shù)殺菌效果的因素與殺菌機(jī)理分析［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2007，33（1）：96-99.

［22］CUPPINI M，ZENI J，BARBOSA J，et al.Inactivation of Staphylococcus aureus in raw salmon with supercritical CO2using experimental design［J］.Food Science and Technology（Campinas），2016，https：//dx.doi.org/10.1590/1678-457X.0038.

［23］SOARES D，LERIN L A，CANSIAN R L，et al.InactivationofListeriamonocytogenesusing supercritical carbon dioxide in a high-pressure variable-volume reactor［J］.Food control，2013，31（2）：514-518.

［24］SILVA J M，RIGO A A，DALMOLIN I A，et al.Effect of pressure，depressurization rate and pressure cycling on the inactivation of Escherichia coli by supercritical carbon dioxide［J］.Food Control，2013，29（1）：76-81.

［25］GARCIA-GONZALEZ L，GEERAERD A H，ELST K，et al.Influence of type of microorganism，food ingredients and food properties on high-pressure carbon dioxide inactivation of microorganisms［J］.International Journal of Food Microbiology，2009，129（3）：253-263.

［26］GARCIA-GONZALEZ L，GEERAERD A H，ELST K，et al.Inactivation of naturally occurring microorganisms in liquid whole egg using high pressure carbon dioxide processing as an alternative to heat pasteurization［J］.The Journal of Supercritical Fluids，2009，51（1）：74-82.

［27］CALVO L，TORRES E.Microbial inactivation of paprika using high-pressure CO2［J］.The Journal of Supercritical Fluids，2010，52（1）：134-141.

［28］ORTU?O C，MARTíNEZ-PASTOR M T，MULET A，et al.Supercritical carbon dioxide inactivation ofEscherichia coli and Saccharomyces cerevisiae in different growth stages［J］.The Journal of Supercritical Fluids，2012，63（1）：8-15.

［29］KOBAYASHI F，HAYATA Y，IKEURA H，et al.Inactivation of Escherichia coli by CO2microbubbles at a lower pressure and near room temperature［J］.Transactions of the ASABE，2009，52（5）：1621-1626.

［30］KOBAYASHI F，HAYATA Y，IKEURA H，et al.Inactivation of Saccharomyces cerevisiae by CO2microbubbles at a lower pressure and near ambient temperature［J］.Transactions of the ASABE，2010，53（4）：1217-1222.

［31］KOBAYASHI F，IKEURA H，ODAKE S，et al.Inactivation of Lactobacillus fructivorans suspended in various buffer solutions by low-pressure CO2microbubbles［J］.LWT-Food Science and Technology，2012，48（2）：330-333.

［32］KOBAYASHI F，SUGAWARA D，TAKATOMI T，et al.InactivationofLactobacillusfructivoransin physiological saline and unpasteurised sake using CO2microbubbles at ambient temperature and low pressure［J］.International Journal of Food Science & Technology，2012，47（6）：1151-1157.

［33］KOBAYASHI F，ODAKE S，MIURA T，et al.Pasteurization and changes of casein and free amino acid contents of bovine milk by low-pressure CO2microbubbles［J］.LWT-Food Science and Technology，2016，71：221-226.

［34］YUK H G，GeVEKE D J.Nonthermal inactivation and sublethal injury of Lactobacillus plantarum in apple cider by a pilot plant scale continuous supercritical carbon dioxide system［J］.Food Microbiology，2011，28（3）：377-383.

［35］BI X F，WANG Y T，ZHAO F，et a1.Sublethal injury and recovery of Eschedchia coli O157：H7 by high pressure carbon dioxide［J］.Food Control，2015，50（1）：705-713.

［36］LIAO H，ZHANG L，HU X，et al.Effect of high pressure CO2and mild heat processing on natural microorganisms in apple juice［J］.International Journal of Food Microbiology，2010，137（1）：81-87.

［37］LI H，DENG L，CHEN Y，et al.Inactivation，morphology，interior structure and enzymatic activity of high pressure CO2-treated Saccharomyces cerevisiae［J］.Innovative Food Science & Emerging Technologies，2012，14（1）：99-106.

［38］SPILIMBERGO S，F(xiàn)OLADORI P，MANTOAN D，et al.High-pressure CO2inactivation and induced damage on Saccharomyces cerevisiae evaluated by flow cytometry［J］.Process Biochemistry，2010，45（5）：647-654.

［39］ZHAO F，BI X，HAO Y，et al.Induction of viable but nonculturable Escherichia coli O157：H7 by high pressure CO2and its characteristics［J］.PloS one，2013，8（4）：e62388.

［40］XIONG R，XIE G，EDMONDSON A E，et al.A mathematical model for bacterial inactivation［J］.International Journal of Food Microbiology，1999，46（1）：45-55

［41］廖紅梅，成玉梁，廖小軍，等.預(yù)測(cè)微生物學(xué)在高壓二氧化碳?xì)⒕鷦?dòng)力學(xué)的應(yīng)用進(jìn)展［J］.食品工業(yè)科技，2012，33（13）：366-372.

［42］GUNES G，BLUM LK，HOTCHKISS JH.Inactivation of Escherichia coli（ATCC 4157）in apple cider by dense phase carbon dioxide［J］.Journal of Food Protection，2006，69（1）：12-16

［43］周先漢，宋俊驊，曾慶梅，等.高壓CO2酸化殺菌機(jī)理的研究［J］.食品科學(xué)，2010，31（11）：11-14.

［44］SPILIMBERGO S，MANTOAN D，QUARANTA A，et al.Real-time monitoring of cell membrane modification during supercritical CO2pasteurization［J］.The Journal of Supercritical Fluids，2009，48（1）：93-97.

［45］GARCIA-GONZALEZ L，GEERAERD A H，MAST J，et al.Membrane permeabilization and cellular death of Escherichia coli，Listeria monocytogenes and Saccharomyces cerevisiae as induced by high pressure carbon dioxide treatment［J］.Food Microbiology，2010，27（4）：541-549.

［46］LI H，DENG L，CHEN Y，et al.Inactivation，morphology，interior structure and enzymatic activity of high pressure CO2-treated Saccharomyces cerevisiae［J］.Innovative Food Science & Emerging Technologies，2012，14（1）：99-106.

［47］LI J，WANG A，ZHU F，et al.Membrane damage induced by supercritical carbon dioxide in Rhodotorula mucilaginosa［J］.Indian Journal of Microbiology，2013，53（3）：352-358.

［48］YAO C，LI X，BI W，et al.Relationship betweenmembrane damage，leakage of intracellular compounds，and inactivation of Escherichia coli treated by pressurized CO2［J］.Journal of Basic Microbiology，2014，54（8）：858-865.

［49］TAMBURINI S，BALLARINI A，F(xiàn)ERRENTINO G，et al.Comparison of quantitative PCR and flow cytometry as cellular viability methods to study bacterial membrane permeabilization following supercritical CO2treatment［J］.Microbiology，2013，159（6）：1056-1066.

［50］LIU S，ZHANG L，JI H，et al.Sterilizing effect of dense phase carbon dioxide on dominant spoilage bacteria from shrimp and its mechanism［J］.Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering，2013，29（14）：284-292.

［51］周先漢，程麗梅，曾慶梅，等.超臨界CO2殺菌過(guò)程中萃取機(jī)制研究［J］.食品科學(xué)，2010，31（17）：14-17.

［52］TAMBURINi S，ANESI A，F(xiàn)ERRENTINO G，et al.Supercritical CO2induces marked changes in membrane phospholipids composition in Escherichia coli K12［J］.The Journal of Membrane Biology，2014，247（6）：469-477.

［53］KIM S R，RHEE M S，KIM B C，et al.Modeling of the inactivation of Salmonella typhimurium by supercritical carbondioxideinphysiologicalsalineand phosphate-buffered saline［J］.Journal of Microbiology Methods，2007，70（1）：132-141.

［54］KIM S R，KIM H T，PARK H J，et al.Fatty acid profiling and proteomic analysis of Salmonella enterica serotype Typhimurium inactivated with supercritical carbon dioxide［J］.International Journal of Food Microbiology，2009，134（3）：190-195.

［55］饒偉麗，張德權(quán)，李淑榮，等.超臨界CO2殺滅大腸桿菌過(guò)程中菌體蛋白的變化［J］.核農(nóng)學(xué)報(bào)，2009，23（3）：471-476.

［56］廖紅梅.高壓二氧化碳對(duì)蘋(píng)果汁中微生物的殺菌效果及對(duì)大腸桿菌結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)和DNA 的影響［D］.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010.

［57］王瑩瑩.高密度CO2對(duì)大腸桿菌膜滲透性及蛋白質(zhì)的影響［D］.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2011.

［58］楊揚(yáng).高密度二氧化碳致死大腸桿菌過(guò)程中關(guān)鍵蛋白質(zhì)的研究［D］.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2014.

［59］LIAO H，ZHANG F，HU X，et al.Effects of high-pressure carbon dioxide on proteins and DNA in Escherichia coli［J］.Microbiology，2011，157（3）：709-720.

［60］SETLOW P.Spores of Bacillus subtilis：their resistance to and killing by radiation，heat and chemicals［J］.Journal of Applied Microbiology，2006，101（3）：514-525.

［61］PERRUT M.Sterilization and virus inactivation by supercritical fluids（a review）［J］.The Journal of Supercritical Fluids，2012，66（1）：359-371.

［62］RAO L，BI X F，ZHAO F，et al.Effect of high-pressure CO2processing on bacterial spores［J］.Critical Reviews in Food Science and Nutrition，2016，56（11）：1808-1825.

［63］ WATANABE T，F(xiàn)URUKAWA S，HIRATA J，et al.Inactivation of Geobacillus stearothermophilus spores by high pressure carbon dioxide treatment［J］.Applied and Environmental Microbiology，2003，69（12）：7124-7129.

［64］WATANABE T，F(xiàn)URUKAWA S，TAI T，et al.High pressure carbon dioxide decreases the heat tolerance of the bacterial spores［J］.Food Science and Technology Research，2003，9（4）：342-344.

［65］RAO L，XU Z，WANG Y，et al.Inactivation of Bacillus subtilis spores by high pressure CO2with high temperature［J］.InternationalJournalofFood Microbiology，2015，205（1）：73-80.

［66］SPILIMBERGO S，DEHGHANI F，BERTUCCO A，et al.Inactivation of bacteria and spores by pulse electric field and high pressure CO2at low temperature［J］.Biotechnology and Bioengineering，2003，82（1）：118-125.

［67］ZHANG J，DALAL N，MATTHEWS M A，et al.Supercritical carbon dioxide and hydrogen peroxide cause mild changes in spore structures associated with high killing rate［J］.Journal of Microbiological Methods，2007，70（3）：442-451.

［68］PARK H S，CHOI H J，KIM M D，et al.Addition of ethanol to supercritical carbon dioxide enhances the inactivation of bacterial spores in the biofilm of Bacillus cereus［J］.International journal of food microbiology，2013，166（2）：207-212.

［69］PARK H S，KIM K H.Enhancement of supercritical CO2inactivation of spores of Penicillium oxalicum by ethanol cosolvent［J］.Journal of Microbiology and Biotechnology，2013，23（6）：833-836.

［70］CASAS J，TELLO J，GATTO F，et al.Microbialinactivation of paprika using oregano essential oil combined with high-pressure CO2［J］.The Journal of Supercritical Fluids，2016，doi：10.1016/j.supflu.2016，04，012.

［71］SETLOW B，KORZA G，BLATT K M，et al.Mechanism of Bacillus subtilis spore inactivation by and resistance to supercritical CO2plus peracetic acid［J］.Journal of Applied Microbiology，2016，120（1）：57-69.

［72］BALLESTRA P，CUQ J L.Influence of pressurized carbon dioxide on the thermal inactivation of bacterial and fungal spores.LWT-Food Science and Technology，1998，31（1）：84-88.

［73］SPILIMBERGO S，ELVASSORE N，BERTUCCO A.Microbial inactivation by high-pressure［J］.The Journal of Supercritical Fluids，2002，22（1）：55-63.

［74］SPILIMBERGO S，BERTUCCO A，LAURO F M，et al.Inactivation of Bacillus subtilis spores by supercritical CO2treatment.Innovative Food Science & Emerging Technologies，2003，4（2）：161-165.

［75］FURUKAWA S，WATANABE T，TAI T，et al.Effect of high pressure gaseous carbon dioxide on the germination of bacterial spores［J］.International Journal of Food Microbiology，2004，91（2）：209-213.

［76］ZHANG J，BURROWS S，GLEASON C，et al.Sterilizing Bacillus pumilus spores using supercritical carbon dioxide［J］.Journal of Microbiology methods，2006，66（3）：479-485.

［77］ZHANG J，DALAL N，GLEASON C，et al.On the mechanisms of deactivation of Bacillus atrophaeus spores using supercritical carbon dioxide［J］.The Journal of Supercritical Fluids，2006，38（2）：268-273.

［78］BAE Y Y，LEE H J，KIM S A，et al.Inactivation of Alicyclobacillus acidoterrestris spores in apple juice by supercritical carbon dioxide［J］.International Journal of Food Microbiology，2009，136（1）：95-100.

［79］WIMMER Z，ZAREVúCKA M.A review on the effects of supercritical carbon dioxide on enzyme activity［J］.International Journal of Molecular Sciences，2010，11（1）：233-253.

［80］HU W，ZHOU L，XU Z，et al.Enzyme inactivation in food processing using high pressure carbon dioxide technology［J］.Critical Reviews in Food Science and Nutrition，2013，53（2）：145-161.

［81］MANZOCCO L，IGNAT A，VALOPPI F，et al.Inactivation of mushroom polyphenoloxidase in model systems exposed to high-pressure carbon dioxide［J］.The Journal of Supercritical Fluids，2016，107（1）：669-675.

［82］KOBAYASHI F，IKEURA H，ODAKE S，et al.Inactivation kinetics of polyphenol oxidase using a two-stage method with low pressurized carbon dioxide microbubbles［J］.Journal of Food Engineering，2013，114（2）：215-220.

［83］KOBAYASHI F，IKEURA H，ODAKE S，et al.Inactivation of enzymes and Lactobacillus fructivorans in unpasteurized sake by a two-stage method with low-pressure CO2microbubbles and quality of the treated sake［J］.Innovative Food Science & Emerging Technologies，2013，18（1）：108-114.

［84］GIACOMO G D，TAGLIERI L，SCIMIA F，et al.Effect of supercritical carbon dioxide on the enzymes inactivationinsingle-strengthcarrotjuice［J］.International Journal of Food Science and Nutrition Engineering，2014，4（4）：106-111.

［85］MELGOSA R，SANZ M T，GARCíA-SOLAESA ángela，et al.Enzymatic activity and conformational and morphological studies of four commercial lipases treated with supercritical carbon dioxide［J］.The Journal of Supercritical Fluids，2015，97（1）：51-62.

［86］LIU Y，HU X S，ZHAO X Y，et al.Inactivation of polyphenol oxidase from watermelon juice by high pressure carbon dioxide treatment［J］.Journal of Food Science and Technology，2013，50（2）：317-324.

［87］LEITGEB M，COLNIK M，PRIMOZIC M，et al.Activity of cellulase and α-amylase from Hortaea werneckii after cell treatment with supercritical carbon dioxide［J］.The Journal of Supercritical Fluids，2013，78（1）：143-148.

［88］MARSZA?EK K，SK?PSKA S，WOZNIAK，et al.Application of supercritical carbon dioxide for the preservation of strawberry juice：Microbial and physicochemical quality，enzymatic activity and the degradation kinetics of anthocyanins during storage［J］.Innovative Food Science & Emerging Technologies，2015，32（1）：101-109.

［89］IFTIKHAR T，WAGNER M E，RIZVI S S H.Enhanced inactivation of pectin methyl esterase in orange juice using modified supercritical carbon dioxide treatment［J］.International Journal of Food Science & Technology，2013，49（3）：804-810.

［90］WEDER J K P，BOKOR M V，HEGARTY M P.Effect of supercritical carbon dioxide on arginine［J］.Food Chemistry，1992，44（4）：281-290.

［91］FRICKS A T，SOUZA D P B，OESTREICHER E G，et al.Evaluation of radish（Raphanus sativus L.）peroxidase activity after high-pressure treatment with carbon dioxide［J］.The Journal of Supercritical Fluids，2006，38（3）：347-353.

［92］KAMAT S V，BECKMAN E J，RUSSELL A J.Enzyme activity in supercritical fluids［J］.Critical Reviews in Biotechnology，1995，15（1）：41-71.

［93］KAMAT S V，CRITCHLEY G，BECKMAN E J，et al.Biocatalytic synthesis of acrylates in organic solvents and supercritical fluids：III.Does carbon dioxide covalently modify enzymes［J］.Biotechnology and Bioengineering，1995，46（6）：610-620.

［94］CUNDARI T R，WILSON A K，DRUMMOND M L，et al.CO2-formatics：how do proteins bind carbon dioxide？［J］.Journal of Chemical Information and Modeling，2009，49（9）：2111-2115.

［95］MüLLER K，LüDEMANN H D，JAENICKE R.Pressure-dependent deactivation and reactivation of dimeric enzymes［J］.Naturwissenschaften，1981，68（10）：524-525.

［96］YOSHIMURA T，SHIMODA M，ISHIKAWA H，et al.Inactivation kinetics of enzymes by using continuous treatment with microbubbles of supercritical carbon dioxide［J］.Journal of Food Science，2001，66（5）：694-697.

［97］TSOU C L.Location of the active sites of some enzymes in limited and flexible molecular regions［J］.Trends in Biochemical Sciences，1986，11（10）：427-429.

［98］ZAKS A，KLIBANOV A M.Enzymatic catalysis in nonaqueoussolvents［J］.JournalofBiological Chemistry，1988，263（7）：3194-3201.

［99］KNEZ ?，HABULIN M.Compressed gases as alternative enzymatic-reaction solvents：a short review［J］.The Journal of Supercritical Fluids，2002，23（1）：29-42.

［100］OULé K M，DICKMAN M，ARUL J.Properties of orange juice with supercritical carbon dioxide treatment［J］.International Journal of Food Properties，2013，16（8）：1693-1710.

［101］LIAO H，HU X，LIAO X，et al.Inactivation of Escherichia coli inoculated into cloudy apple juice exposed to dense phase carbon dioxide［J］.International Journal of Food Microbiology，2007，118（2）：126-131.

［102］FERRENTINO G，BRUNO M，F(xiàn)ERRARI G，et al.Microbial inactivation and shelf life of apple juice treated with high pressure carbon dioxide［J］.Journal of Biological Engineering，2009，3（1）：1-9.

［103］NIU S，XU Z，F(xiàn)ANG Y，et al.Comparative study on cloudy apple juice qualities from apple slices treated by high pressure carbon dioxide and mild heat［J］.Innovative Food Science & Emerging Technologies.2010，11（1）：91-97.

［104］廖紅梅，丁占生，鐘葵，等.高壓二氧化碳對(duì)鮮榨梨汁貯藏穩(wěn)定性的影響研究［J］.食品工業(yè)科技，2013，34（23）：131-133.

［105］廖紅梅，丁占生，鐘葵，等.高壓二氧化碳對(duì)鮮榨梨汁殺菌效果及動(dòng)力學(xué)研究［J］.食品工業(yè)科技，2013，34（24）：83-87.

［106］周林燕，王永濤，劉鳳霞，等.高壓CO2處理保持非還原桃汁的品質(zhì)［J］.農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2013，29（23）：262-267.

［107］LIU Y，HU X S，ZHAO X Y，et al.Inactivation of polyphenol oxidase from watermelon juice by high pressure carbon dioxide treatment［J］.Journal of Food Science and Technology，2013，50（2）：317-324.

［108］劉野，張超，趙曉燕，等.高壓二氧化碳抑制西瓜汁褐變的試驗(yàn)［J］.農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2010，26（8）：373-378.

［109］劉野，趙曉燕，鄒磊，等.高壓二氧化碳對(duì)鮮榨西瓜汁殺菌效果和風(fēng)味的影響［J］.食品科學(xué)，2012，33（3）：82-88.

［110］CHEN J，ZHANG J，F(xiàn)ENG Z，et al.Influence of thermal and dense-phase carbon dioxide pasteurization on physicochemical properties and flavor compounds in Hami melon juice［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2009，57（13）：5805-5808.

［111］CHEN J，ZHANG J，SONG L，et al.Changes in microorganism，enzyme，aroma of hami melon（Cucumis melo L.）juice treated with dense phase carbon dioxide and stored at 4℃［J］.Innovative Food Science & Emerging Technologies，2010，11（4）：623-629.

［112］CAPPELLETTI M，F(xiàn)ERRENTINO G，ENDRIZZI I，et al.High pressure carbon dioxide pasteurization ofcoconut water：a sport drink with high nutritional and sensory quality［J］.Journal of Food Engineering，2015，145（1）：73-81.

［113］MARCHI F D，APREA E，ENDRIZZI I，et al.Effects of Pasteurization on Volatile Compounds and Sensory Properties of Coconut （ Cocos nucifera，L.）Water：Thermal vs.High-Pressure Carbon Dioxide Pasteurization［J］.Food & Bioprocess Technology，2015，8（7）：1-12.，APREA E，ENDRIZZI I，et al.Effects of pasteurization on volatile compounds and sensory properties of coconut （Cocos nucifera L.）water：Thermalvs.high-pressurecarbondioxide pasteurization［J］.Food and Bioprocess Technology，2015，8（7）：1393-1404.

［113］ Marchi F D，Aprea E，Endrizzi I，et al.Effects of pasteurization on volatile compounds and sensory propertiesofcoconut（Cocosnucifera L.）water：Thermal vs.high-pressure carbon dioxide pasteurization［J］.FoodandBioprocess Technology，2015，8（7）：1-12.

［114］DAGAN G F，BALABAN M O.Pasteurization of beer by a continuous dense-phase CO2system［J］.Journal of Food Science，2006，71（3）：E164-E169.

［115］ERKMEN O.Effects of high-pressure carbon dioxide on Escherichia coli in nutrient broth and milk［J］.International Journal of Food Microbiology，2001，65（1）：131-135.

［116］廖紅梅，周林燕，廖小軍，等.高密度二氧化碳對(duì)牛初乳的殺菌效果及對(duì)理化性質(zhì)影響［J］.農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2009，25（4）：260-264.

［117］鐘葵，黃文，廖小軍，等.高密度二氧化碳技術(shù)對(duì)牛奶殺菌效果動(dòng)力學(xué)分析［J］.化工學(xué)報(bào)，2010，61（1）：146-151.

［118］姚春艷.加壓CO2殺菌機(jī)理初探及對(duì)乳中酶和細(xì)菌活性的影響［D］.哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013.

［119］FERRENTINO G，CALLIARI N，BERTUCCO A，

et al.Validation of a mathematical model for predicting high pressure carbon dioxide inactivation kinetics of Escherichia coli spiked on fresh cut carrot［J］.The Journal of Supercritical Fluids，2014，85（1）：17-23.

［120］SPILIMBERGO S，KOMES D，VOJVODIC A，et al.High pressure carbon dioxide pasteurization of fresh-cut carrot［J］.The Journal of Supercritical Fluids，2013，79（1）：92-100.

［121］BI X，WU J，ZHANG Y，et al.High pressure carbon dioxide treatment for fresh-cut carrot slices［J］.Innovative Food Science & Emerging Technologies.2011，12（3）：298-304.

［122］FERRENTINO G，BALZAN S，DORIGATO A，et al.Effect of supercritical carbon dioxide pasteurization on natural microbiota，texture，and microstructure of fresh-cut coconut［J］.Journal of Food Science，2012，77（5）：137-143.

［123］VALVERDE M T，MARíN-INIESTA F，CALVO L.Inactivation of Saccharomyces cerevisiae in conference pear with high pressure carbon dioxide and effects on pear quality［J］.Journal of Food Engineering，2010，98（4）：421-428.

［124］張華，董月強(qiáng)，李青，等.高密度二氧化碳技術(shù)對(duì)鮮切蓮藕褐變相關(guān)酶活的影響［J］.食品工業(yè)科技，2013，34（22）：290-293.

［125］張華，董月強(qiáng)，李星科，等.高密度二氧化碳技術(shù)對(duì)鮮切蓮藕酶活性的影響［J］.食品與機(jī)械，2013，29（1）：170-172.

［126］張華，董月強(qiáng)，袁博，等.高密度二氧化碳技術(shù)對(duì)鮮切蓮藕貯藏品質(zhì)的影響［J］.食品工業(yè)，2014，35（3）：76-79.

［127］CHOI Y M，BAE Y Y，KIM K H，et al.Effects of supercritical carbon dioxide treatment against generic Escherichia coli，Listeria monocytogenes，Salmonella typhimurium，and E.coli O157：H7 in marinades and marinated pork ［J］.Meat Science，2009，82（4）：419-424.

［128］CHOI YM，KIM O Y，KIM K H，et al.Combined effect of organic acids and supercritical carbon dioxide treatments against nonpathogenic Escherichia coli，Listeria monocytogenes，Salmonella typhimurium and E.coli O157：H7 in fresh pork ［J］.Letters in Applied Microbiology，2009，49（4）：510-515.

［129］孫源源，張德權(quán)，李春紅，等.肉餡高密度CO2殺菌效果和殺菌動(dòng)力學(xué)研究［J］.核農(nóng)學(xué)報(bào)，2009，23（6）：1014-1020.

［130］閆文杰，崔建云，戴瑞彤，等.高密度二氧化碳處理對(duì)冷卻豬肉品質(zhì)及理化性質(zhì)的影響［J］.農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2010，26（7）：346-350.

［131］WEI C I，BALABAN M O，F(xiàn)ERNANDO S Y，et al.Bacterial effect of high pressure CO2treatment on foods spiked with Listeria or Salmonella ［J］.Journal ofFood Protection，1991，54（3）：189-193.

［132］饒偉麗，劉琳，張德權(quán)，等.高密度CO2對(duì)生鮮調(diào)理雞肉殺菌動(dòng)力學(xué)模型構(gòu)建［J］.食品工業(yè)科技，2013，34（11）：320-324.

［133］SIRISEE U，HSIEH F，HUFF H E，et al.Microbial safety of supercritical carbon dioxide processes［J］.Journal of Food Processing and Preservation，1998，22（5）：387-403

［134］ERKMEN O.Antimicrobial effects of pressurised carbon dioxide on Brochothrix thermosphacta in broth and foods［J］.Journal of the Science of Food and Agriculture，2000，80（9）：1365-1370.

［135］姚中峰，李興民，劉潔潔，等.高壓二氧化碳處理對(duì)牛通脊顏色和肌紅蛋白的影響［J］.食品工業(yè)科技，2012，33（4）：142-145.

［136］JI H W，ZHANG L，LIU S C，et al.Optimization of microbial inactivation of shrimp by dense phase carbon dioxide［J］.InternationalJournalofFood Microbiology，2012，156（1）：44-49.

［137］ZHANG L，LIU S C，JI H W，et al.Inactivation of polyphenol oxidase from Pacific white shrimp by dense phase carbon dioxide ［J］.Innovative Food Science & Emerging Technologies，2011，12（4）：635-641.

［138］MEUJO D F，KEVIN D A，PENG J，et al.Reducing oyster-associated bacteria levels using supercritical fluid CO2as an agent of warm pasteurization ［J］.International Journal of Food Microbiology，2010，138（1-2）：63-70.

［139］張良，劉書(shū)成，章超樺，等.神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)優(yōu)化牡蠣的高密度CO2殺菌工藝［J］.農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2011，27（12）：369-373.

［140］ 陳亞勵(lì)，屈小娟，郭明慧，等.高密度CO2在肉制品和水產(chǎn)品加工中的應(yīng)用［J］.現(xiàn)代食品科技，2014，30 （9）：304-311.

［141］XU D，YUAN F，JIANG J，et al.Structural and conformational modification of whey proteins induced by supercritical carbon dioxide ［J］.Innovative Food Science & Emerging Technologies，2011，12（1）：32-37.

［142］屈小娟，劉書(shū)成，吉宏武，等.高密度CO2誘導(dǎo)制備蝦糜凝膠的特性［J］.農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2012，28（20）：282-287.

［143］曲亞琳，張德權(quán)，饒偉麗，等.高密度CO2對(duì)羊肉糜凝膠特性的影響［J］.核農(nóng)學(xué)報(bào)，2010，24（6）：1226-1231.

［144］郭明慧，鄧倩琳，劉書(shū)成，等.高密度CO2對(duì)凡納濱對(duì)蝦肌球蛋白疏水性的影響［J］.廣東海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2016，36（1）：73-78.

（責(zé)任編輯：陳莊）

Review on Inactivation of Microorganisms and Enzyme by Dense Phase Carbon Dioxide and the Application

LIU Shu-cheng，GUO Ming-hui，LIU Yuan，LIU Meng-na，DENG Qian-lin
（College of Food Science and Technology，Guangdong Ocean University//Guangdong Provincial Key Laboratory of Aquatic Products Processing and Safety//Guangdong Provincial Seafood Engineering Technology Research Center//Key Laboratory of Advanced Processing of Aquatic Products of Guangdong Higher Education Institution，Zhanjiang 524088，China）

Dense phase carbon dioxide（DPCD）is one of the very promising food non-thermal processing technologies，which was mainly used to inactivate microorganism and enzyme in food.The paper reviews the progress of last decade made in the basic research and application research of DPCD technology at home and abroad.The basic research fields of DPCD technology include phase equilibrium between DPCD and food system，effect and mechanism of inactivation microbial vegetative and spore by DPCD，effect and mechanism of inactivation enzyme by DPCD.The application research fields of DPCD technology include liquid food（fruit and vegetable juice，beer，milk）and solid food （fresh cut fruit and vegetable，meat，seafood） processing.Finally，some problems to be solved are discussed on the development of DPCD technology in future.The reviews will provide the reference for the research and application of DPCD in food processing.

Dense phase carbon dioxide；Inactivation microorganisms；Inactivation enzyme；Liquid food；Solid food

TS254.4

A

1673-9159（2016）04-0101-16

10.3969/j.issn.1673-9159.2016.04.017

2016-04-15

國(guó)家自然科學(xué)基金（31371801）；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2015A020209158）；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(xiàng)基金（CARS-47）

劉書(shū)成（1977－），男，教授，研究方向?yàn)樗a(chǎn)品非熱加工技術(shù)基礎(chǔ)理論與應(yīng)用。Email：Lsc771017@163.com