姚　歡，黃郁蔥，蔡雙虎，魯義善，蔡小輝，簡(jiǎn)紀(jì)常

（（1.廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院 // 2.廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病原生物學(xué)及流行病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 // 3.廣東高等學(xué)校水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病害控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江 524088；4.廣西海洋研究所 // 5.廣西海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 北海 536000）

眼斑擬石首魚爛尾病病原菌的分離鑒定及滅活疫苗的免疫效果

姚歡1，2，3，黃郁蔥1，2，3，蔡雙虎1，2，3，魯義善1，2，3，蔡小輝4，5，簡(jiǎn)紀(jì)常1，2，3

（（1.廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院 // 2.廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病原生物學(xué)及流行病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 // 3.廣東高等學(xué)校水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病害控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江 524088；4.廣西海洋研究所 // 5.廣西海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 北海 536000）

從患爛尾病眼斑擬石首魚（Sciaenops ocellatus）的潰瘍處分離到一株優(yōu)勢(shì)菌SoGZ1401，回歸感染試驗(yàn)證實(shí)該菌是引起爛尾病的病原菌，對(duì)眼斑擬石首魚的半致死量（LD50）為8.6×103CFU·g-1；結(jié)合其形態(tài)學(xué)和生理生化特征及HSP60測(cè)序分析，鑒定為哈維氏弧菌（Vibrio harveyi）；利用杯碟法研究其胞外產(chǎn)物性質(zhì)，結(jié)果表明：其胞外產(chǎn)物具有淀粉酶、明膠酶、酪蛋白酶、卵磷脂酶、脂酶活性以及溶血活性，但無(wú)脲酶活性。藥敏試驗(yàn)表明，該菌株對(duì)氟哌酸、恩諾沙星、氟苯尼考和復(fù)方新諾明等抗菌藥有較高的敏感性。制備哈維氏弧菌滅活疫苗，采用注射和浸泡2 種途徑免疫眼斑擬石首魚，測(cè)定受免疫魚的血清抗體效價(jià)和疫苗對(duì)眼斑擬石首魚的免疫保護(hù)率。結(jié)果顯示，免疫組血清中的抗體效價(jià)水平均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05），注射組和浸泡組的抗體效價(jià)最高值分別達(dá)718.4和128，哈維氏弧菌攻毒后免疫保護(hù)率分別為75.0%～86.7%和46.4%～56.7%。哈維氏弧菌滅活疫苗對(duì)眼斑擬石首魚具有較好的免疫保護(hù)性。

眼斑擬石首魚；爛尾?。徊≡?；哈維氏弧菌；免疫效果

眼斑擬石首魚 （Sciaenops ocellatus）俗稱美國(guó)紅魚（red fish）、紅鼓（red drum）、紅擬石首魚、斑尾鱸（spot-tail bass）和海峽鱸（channel bass）等，屬鱸形目石首魚科擬石首魚屬，系溯河性、廣溫、廣鹽魚類。我國(guó)于1991年引種試養(yǎng)，1995年種苗繁育成功并開始養(yǎng)殖，因其生長(zhǎng)速度快、產(chǎn)量高、抗逆力強(qiáng)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高，目前已成為我國(guó)南方和北方部分地區(qū)池塘和網(wǎng)箱養(yǎng)殖的重要魚種［1］。但由于近年來(lái)養(yǎng)殖集約化程度逐漸提高，近海環(huán)境污染嚴(yán)重，養(yǎng)殖海域環(huán)境惡化，養(yǎng)殖過(guò)程中病害日益增多，先后分離和鑒定的病原有虹彩病毒［2］、海藻施萬(wàn)氏菌（Sheumatella relgae）［3-4］、河流弧菌（Vibrio fluvialis）［5］和海豚鏈球菌（Streptococcus iniae）［6］等。2013年12底至2014年2月初，湛江港養(yǎng)殖海域的眼斑擬石首魚暴發(fā)嚴(yán)重的爛尾病，病魚發(fā)病初期尾部體表輕微充血發(fā)炎，隨著病程的發(fā)展，鱗片脫落，皮膚潰爛，充血發(fā)紅，嚴(yán)重時(shí)肌肉和骨骼外露甚至斷尾。該病傳染速度快，死亡率為 50% ～80%，給養(yǎng)殖戶造成巨大損失，確定病原和有效的防治措施對(duì)該病防控有重要意義。本研究對(duì)該病原菌進(jìn)行了分離和生理生化鑒定，并制備滅活疫苗，為眼斑擬石首魚的病害防治提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

眼斑擬石首魚病魚取自湛江某養(yǎng)殖網(wǎng)箱，有典型病征，體質(zhì)量20～30g；健康魚體質(zhì)量35g，購(gòu)自湛江某育苗場(chǎng)，于水泥池中暫養(yǎng)7 d后用于試驗(yàn)。暫養(yǎng)水溫25～29℃，每天早上投餌和換水1次，24h充氣。

新型微生物微量生化鑒定盒購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，Biolog GN2 Microplate購(gòu)自美國(guó) Biolog 公司（Biolog Inc.Hayward，CA，USA），藥敏紙片購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司，Gel Extraction Kit 購(gòu)自O(shè)mega公司。

1.2細(xì)菌的分離

取瀕死病魚，從潰瘍部位挑取少量組織，接種于TSA和TCBS培養(yǎng)基平板，于28℃條件下培養(yǎng)24h后，挑取優(yōu)勢(shì)菌落于TSA培養(yǎng)基平板反復(fù)劃線分離純化，直至獲得純培養(yǎng)物，接種于胰蛋白胨大豆肉湯（Tryptic Soy Broth，TSB），培養(yǎng)12h后加入1/5體積的甘油，保存于- 80℃。

1.3致病性試驗(yàn)

1.3.1分離菌株浸泡感染將分離菌株在 TSB培養(yǎng)12h后，用沙濾海水稀釋為2×107CFU·mL-1，分別浸泡感染健康、刮去幾片鱗片和剪去部分尾鰭的眼斑擬石首魚各 20尾，同時(shí)設(shè)不經(jīng)菌浴的對(duì)照組，浸浴24h后分別飼養(yǎng)于玻璃鋼養(yǎng)殖桶中，試驗(yàn)期間水溫25～30℃，每天早上投餌和換水1次，24h充氣，連續(xù)觀察14 d，記錄魚體發(fā)病死亡情況，及時(shí)去除死魚。

1.3.2分離菌株注射感染將分離菌株在 TSB擴(kuò)大培養(yǎng)12h后，用無(wú)菌磷酸緩沖液PBS（pH7.2）稀釋為1×108CFU·mL-1，分別肌肉和腹腔注射感染健康眼斑擬石首魚20尾，每尾魚注射0.1 mL，對(duì)照組注射等量無(wú)菌PBS。

取因感染而病死的眼斑擬石首魚，于病灶處分離細(xì)菌（無(wú)菌操作），接種于TSA培養(yǎng)基，取單菌落重復(fù)劃線純化并鑒定。

1.4半致死量（LD50）的測(cè)定

將 1×108、1×107、1×106、1×105、1×104CFU·mL-1等 5個(gè)濃度梯度的菌懸液分別腹腔注射健康眼斑擬石首魚，每個(gè)濃度梯度 10尾，每尾魚注射0.1 mL，以注射等量無(wú)菌磷酸緩沖液PBS（pH 7.2）的健康眼斑擬石首魚10尾作對(duì)照，注射后的眼斑擬石首魚分別飼養(yǎng)于玻璃鋼養(yǎng)殖桶，水溫25～30℃，每天早上投餌和換水1次，24h充氣，連續(xù)觀察14 d，用改良寇氏法計(jì)算半數(shù)致死量LD50。

1.5分離菌株胞外產(chǎn)物分析

挑取單菌落接種于TSA斜面，活化18h，用PBS（pH 7.2）洗下，取菌懸液涂于鋪有無(wú)菌玻璃紙的TSA平板上，于28℃條件下培養(yǎng)24h，每培養(yǎng)皿中加入PBS 5 mL將菌洗入無(wú)菌三角瓶中，用磁力攪拌器攪拌30min，在4℃、12 000g條件下離心20min，除去菌體，上清液經(jīng)孔徑0.22μm的纖維素膜過(guò)濾，濾液置4℃下保存待用。用杯碟法分析胞外產(chǎn)物活性［7］。

1.6細(xì)菌的形態(tài)特征及鑒定

參照東秀株等［8］和伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)［9］的方法對(duì)分離菌株進(jìn)行常規(guī)生理生化反應(yīng)鑒定，同時(shí)應(yīng)用Biolog公司的革蘭陰性細(xì)菌鑒定板進(jìn)行95種唯一碳源的生化反應(yīng)鑒定，用 Biolog MicroStation System 3450 軟件分析結(jié)果。

1.7系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析

分離菌株基因組的提取和HSP60基因PCR擴(kuò)增參考東秀株等［8］和 Kwok［10］方法。擴(kuò)增的正向引物：5′-TGTAAAACGACGGCCAGTGAATTCGAIIII CGIGGIGA（TC）GGIACIACIAC-3′（記作H279MT），反向引物：5′-CAGGAAACAGCTATGACCGGATC C（TC）（TG）I（TC）（TG）ITCICC（AG）AAICCIGGIGC（T C）TT-3′（記作 H280MT）。PCR反應(yīng)體系：ExTaq DNA聚合酶（5 U·μL-1，含Mg2+）0.5μL，dNTP 4μL，10×PCR緩沖液5μL，正反向引物（10μmol·L-1）各1μL，DNA模板2μL，加超純水至總體積50μL。PCR反應(yīng)條件：94℃ 4min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 45 s，共32個(gè)循環(huán)；72℃下延伸5min。PCR產(chǎn)物采用Gel Extraction Kit回收，送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)Blast分析后，選取GenBank中所獲的弧菌屬相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)菌株運(yùn)用 Clustalx軟件進(jìn)行同源性分析，最后用Mega5.0軟件采用鄰接法（Neighbor-joining）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，自展數(shù)為1 000次。

1.8藥敏試驗(yàn)

采用WHO推薦的K-B法（紙片擴(kuò)散法）進(jìn)行。將分離菌株培養(yǎng)6h后，將菌液濃度調(diào)整至1.5×108CFU·mL-1，均勻涂布于MHA培養(yǎng)基平板上，當(dāng)平板上的水分被瓊脂完全吸收后貼上藥物試紙片，經(jīng)28℃恒溫培養(yǎng)24h，用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑，根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明書標(biāo)準(zhǔn)判定待測(cè)菌株對(duì)藥物的敏感程度。

1.9疫苗制備與免疫

將分離菌株SoGZ1401接種于TSB培養(yǎng)基中，以28℃、180r/min條件振蕩培養(yǎng)16h，將培養(yǎng)液進(jìn)行梯度稀釋后用平板計(jì)數(shù)法測(cè)定培養(yǎng)液的活菌數(shù)，加入體積分?jǐn)?shù)0.4%福爾馬林于28℃下滅活48h，用 PBS洗滌 3次，將菌液濃度調(diào)整為 1×109CFU·mL-1，然后進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)和安全檢驗(yàn)。安全檢驗(yàn)方法為將制備的疫苗注射30～40g健康眼斑擬石首魚20尾，0.2 mL/尾，連續(xù)觀察14 d，試驗(yàn)魚應(yīng)健康、活力好、無(wú)異常行為，表明疫苗滅活徹底。免疫試驗(yàn)設(shè)對(duì)照組、注射組和浸泡組3組，每組魚100尾，對(duì)照組不做任何處理；注射組首次免疫腹腔注射疫苗0.2 mL，14 d后以相同劑量再次注射免疫；浸泡組于含濃度1×108CFU·mL-1疫苗的海水中充氣浸泡接種30min，14 d后以相同濃度再次浸泡免疫。

1.10采血、抗體效價(jià)測(cè)定與免疫保護(hù)效果評(píng)價(jià)

首次免疫后每周采血1次，連續(xù)8周，每次每組隨機(jī)撈取5尾免疫魚尾靜脈采血，于室溫下靜置2h，以4 000r/min離心10min，收集血清，于- 20℃條件下保存?zhèn)溆?。按陳賀等［11］方法，采用96孔V型血凝板來(lái)測(cè)定各組免疫血清的凝聚效價(jià)。免疫后的第8周，分別從每組隨機(jī)撈取魚20尾，以2×LD50濃度腹腔注射，攻毒后分別飼養(yǎng)于玻璃鋼養(yǎng)殖桶，水溫25～30℃，每天早上投餌和換水，24h充氣，連續(xù)觀察14 d，每天記錄試驗(yàn)魚的發(fā)病與死亡情況，并對(duì)發(fā)病魚進(jìn)行病原菌分離鑒定。計(jì)算魚的免疫保護(hù)率（RPS）：

相對(duì)免疫保護(hù)率=（1-免疫組死亡率/對(duì)照組死亡率） ×100%

2　結(jié) 果

2.1病原菌及形態(tài)特征

從患病魚潰瘍處分離到一株優(yōu)勢(shì)菌株，命名為SoGZ1401，人工感染的瀕死病魚內(nèi)臟分離得到的優(yōu)勢(shì)菌株命名為AiSo。分離菌株在28℃條件下培養(yǎng)24h后，在TSA培養(yǎng)基上菌落圓形，表面光滑，邊緣整齊，淡黃色，直徑約1.5～2.5mm；在TCBS上培養(yǎng)基上菌落呈黃色，直徑2.0～3.5mm。革蘭染色陰性，短桿狀，兩端鈍圓，具一極生單鞭毛，用水浸片檢查和半固體穿刺培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)SoGZ1401菌有運(yùn)動(dòng)能力。

2.2致病性試驗(yàn)

致病性試驗(yàn)結(jié)果見表1。表1可見，刮鱗后菌浴和剪尾后菌浴均可使魚感染發(fā)病，刮鱗后菌浴和剪尾后菌浴分別于感染后4 d和5 d時(shí)開始出現(xiàn)死亡，至14 d時(shí)死亡率分別為75%和65%，對(duì)照組無(wú)死亡，發(fā)病魚的癥狀與自然感染發(fā)病魚相似，尾鰭充血發(fā)紅，之后發(fā)生潰爛死亡。肌肉和腹腔注射感染，魚在2 d內(nèi)全部死亡，死亡率100%，對(duì)照組無(wú)死亡，從病魚病灶處再次分離的菌株經(jīng)鑒定后表明為同一種菌，故確定SoGZ1401菌株為本次眼斑擬石首魚爛尾病的病原菌。

表1　人工感染試驗(yàn)結(jié)果Table 1　Result s of artificial infection test

2.3半數(shù)致死量（LD50）

根據(jù)致病性結(jié)果測(cè)定的 LD50見表 2，計(jì)算得SoGZ1401菌株的LD50為8.6×103CFU·g-1，其95%可信限為2.7×103～ 2.8×104CFU·g-1。根據(jù)Devesa對(duì)魚類致病菌毒力的劃分標(biāo)準(zhǔn)［12］，可判定該菌具有較強(qiáng)的毒力。

2.4胞外產(chǎn)物

測(cè)定SoGZ1401胞外產(chǎn)物的酶活性如表3。表3可見，該細(xì)菌胞外產(chǎn)物有明膠酶、淀粉酶、酪蛋白酶、脂肪酶、卵磷脂酶等多種酶活性，但未檢測(cè)到脲酶活性。相同體積胞外產(chǎn)物提取液中，明膠酶、淀粉酶的活性最高；其次是酪蛋白酶、脂肪酶，卵磷脂酶的活性較低。此外，該菌株對(duì)眼斑擬石首魚的紅細(xì)胞具有一定的溶解能力。

表2　SoGZ1401對(duì)眼斑擬石首魚的半數(shù)致死量Table 2　LD50 of SoGZ1401 to S.ocellatus

表3　胞外產(chǎn)物的酶活性Table 3 The enzymatic activities of ECP of SoGZ1401

2.5細(xì)菌生理生化特性

SoGZ1401菌株生理生化特性見表4。表4顯示，菌株SoGZ1401革蘭陰性，氧化酶陽(yáng)性，4℃以下和42℃以上皆不生長(zhǎng)，無(wú)鹽不生長(zhǎng)，在80g/L 以上NaCl胨水中不生長(zhǎng)，O/129（10和150 μg·片-1）敏感，還原硝酸鹽，含賴氨酸、鳥氨酸脫羧酶，不含精氨酸脫羧酶和雙水解酶，發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，MR、V-P陽(yáng)性，利用水楊素、葡萄糖、蔗糖、纖維二糖、麥芽糖、甘露糖等糖類，不利用阿拉伯糖、鼠李糖、木糖、乳糖等糖類，與文獻(xiàn)［8-9］對(duì)哈維氏弧菌描述基本一致；Biolog系統(tǒng)軟件分析表明，與哈維氏弧菌（V.harveyi）標(biāo)準(zhǔn)株的相似性高達(dá)99%，相似率為0.745（最大相似度為1.000）。結(jié)合生理生化特性和 Biolog系統(tǒng)鑒定結(jié)果，將SoGZ1401菌鑒定為哈維氏弧菌。

2.6系統(tǒng)發(fā)育樹

為進(jìn)一步確定該分離菌株SoGZ1401的分類地位，測(cè)定其HSP60的部分序列，經(jīng)Blast比較，發(fā)現(xiàn)SoGZ1401序列與哈維氏弧菌同源性高達(dá)99.9%。根據(jù)SoGZ1401與相關(guān)屬種HSP60基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹見圖1。圖1可見，SoGZ1401與哈維氏弧菌自然聚為一支，說(shuō)明與哈維氏弧菌親緣關(guān)系最近，可將SoGZ1401進(jìn)一步確認(rèn)為哈維氏弧菌。

表4　分離菌株和哈維氏弧菌的生理生化特性Table 4　Physiological and biochemical characters of SoGZ1401 strain and V.harveyi

2.7藥敏試驗(yàn)結(jié)果

SoGZ1401對(duì)24種藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果見表5。表5表明，分離菌株SoGZ1401對(duì)青霉素G、阿莫西林、先鋒V、氨芐青霉素、頭孢噻吩、卡那霉素、新生霉素、多黏菌素B、呋喃唑酮、萬(wàn)古霉素和林可霉素等耐藥；對(duì)慶大霉素、四環(huán)素、紅霉素、利福平、鏈霉素等中度敏感；對(duì)復(fù)方新諾明、諾氟沙星、氧氟沙星、恩諾沙星和氟苯尼考等高度敏感。

2.8血清抗體效價(jià)測(cè)定和疫苗保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果

免疫魚血清抗體效價(jià)如圖2所示。圖2表明，抗體效價(jià)在免疫后均呈現(xiàn)明顯的升高趨勢(shì)，免疫組與對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05）。免疫 1周后可檢測(cè)到抗體，注射組和浸泡組抗體效價(jià)分別在免疫后4周和5周時(shí)達(dá)到高峰，分別為718.4和128，之后逐漸下降，至8周時(shí)，免疫組的抗體效價(jià)均在32以上。從表6可見，免疫接種后，注射組和浸泡組均獲得一定的免疫保護(hù)力，其免疫保護(hù)率分別為75.0%～86.7%和46.4%～56.7%。

圖1　基于HSP60序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1　Phylogenetic tree based on HSP60 sequences

表5　病原株SoGZ1401的藥敏試驗(yàn)結(jié)果Table 5　Result of drug sensitivity test on the pathogen strain SoGZ1401

圖2　免疫魚的抗體效價(jià)Fig.2　Antibody titers of vaccinated fish

表6　分離菌株疫苗免疫后眼斑擬石首魚的免疫保護(hù)率Table 6　RPS of S.ocellatus immunized with the V.harveyi vaccine

3　討 論

哈維氏弧菌是引起多種海水養(yǎng)殖魚類疾病的重要病原菌，導(dǎo)致臺(tái)灣地區(qū)軍曹魚（Rachycentron canadum L.）［13］以及我國(guó)大陸?zhàn)B殖花鱸（Lateolobrax japonicus）［14］、大黃魚（Pseudosciaena crocea）［15］、斜帶石斑魚（Epinephelus coioides）［16-17］、青石斑魚（E.awoara）［18］、大菱鲆（Scophthalmus maximus）［19］和鮸魚（Miichthys miiuy）［20］暴發(fā)弧菌病，可引起病魚潰瘍和內(nèi)部器官病變，最終導(dǎo)致死亡。本研究通過(guò)回歸感染試驗(yàn)和生化鑒定確認(rèn)病原為哈維氏弧菌，與大黃魚［15］和斜帶石斑魚［16-17］爛尾病的報(bào)道一致。哈維氏弧菌引起眼斑擬石首魚暴發(fā)爛尾病尚屬首次報(bào)道，可見隨著養(yǎng)殖業(yè)集約化進(jìn)一步發(fā)展和海水養(yǎng)殖環(huán)境的日益惡化，哈維氏弧菌已經(jīng)成為目前危害我國(guó)海水養(yǎng)殖魚類的主要病原菌。

哈維氏弧菌作為一種條件致病菌，在一定條件下通過(guò)水產(chǎn)動(dòng)物傷口或消化道感染［20］。范文輝等［19］發(fā)現(xiàn)，大菱鲆潰瘍病的發(fā)生與寄生蟲感染密切相關(guān)，本研究表明，所分離菌株可通過(guò)創(chuàng)傷感染眼斑擬石首魚，感染后死亡率高。因此，在眼斑擬石首魚的運(yùn)輸或養(yǎng)殖過(guò)程中，應(yīng)盡量避免受傷，同時(shí)需做好寄生蟲的防治工作，以減少發(fā)病機(jī)率。

弧菌胞外產(chǎn)物是一類重要的毒力因子［20-23］，包含外毒素和各種酶，在致病過(guò)程中發(fā)揮重要作用。Saeed等［24］發(fā)現(xiàn)哈維氏弧菌的胞外產(chǎn)物對(duì)棕點(diǎn)石斑魚（E.tauvina）具有較強(qiáng)的毒性，Liu等［25］發(fā)現(xiàn)，來(lái)源于斑節(jié)對(duì)蝦（Penaeus monodon）的病原哈維氏弧菌胞外產(chǎn)物具有蛋白酶、磷脂酶和溶血素等。本研究中，爛尾病病原菌SoGZ1401胞外產(chǎn)物同樣含有脂肪酶、蛋白酶、淀粉酶、明膠酶及溶血素等成分，這與Liu等［25］和白方方等［26］的報(bào)道基本一致。因此，病原哈維氏弧菌可通過(guò)產(chǎn)生大量蛋白酶和外毒素，直接破壞宿主組織的結(jié)構(gòu)和功能，溶血素又能使魚的血細(xì)胞溶解，從而促進(jìn)病原菌的定殖、擴(kuò)散和侵染，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，機(jī)體最終衰竭死亡。

目前我國(guó)在水產(chǎn)養(yǎng)殖疾病防治時(shí)普遍使用抗生素，一定程度上導(dǎo)致養(yǎng)殖環(huán)境中病原弧菌耐藥菌的種類和數(shù)量增加，同時(shí)危害水產(chǎn)品質(zhì)量安全和人類身體健康［27］。最近檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，我國(guó)地表水含有68種抗生素且濃度較高，其中部分來(lái)源于養(yǎng)殖業(yè)［28］，須對(duì)環(huán)境的抗生素污染保持高度警惕。本研究表明，分離菌株SoGZ1401僅對(duì)喹諾酮類藥物氟哌酸、氧氟沙星、恩諾沙星和磺胺類藥物復(fù)方新諾明以及氟苯尼考敏感，對(duì)其他藥物有抗性，呈現(xiàn)多重耐藥，因此，應(yīng)該選用敏感藥物防治眼斑擬石首魚爛尾病，防止濫用藥物導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性日益增強(qiáng)以及對(duì)微生物生態(tài)的破壞。此外，還可通過(guò)疫苗、有益微生物和生態(tài)防病等綜合措施防控疾病。

使用疫苗是水生動(dòng)物疾病防控的重要手段。沈錦玉和毛芝娟等［29-30］研制哈維氏弧菌滅活疫苗，運(yùn)用注射和浸泡免疫方式免疫大黃魚，發(fā)現(xiàn)受免疫魚抗體效價(jià)和存活率有較大提高。本研究中將哈維氏弧菌滅活疫苗運(yùn)用注射和浸泡免疫方式接種眼斑擬石首魚，注射免疫組和浸泡免疫組的抗體水平均有顯著提高，注射免疫組保護(hù)率高于浸泡免疫組，可見哈維氏弧菌疫苗通過(guò)腹腔注射和浸泡免疫眼斑擬石首魚后均可刺激機(jī)體產(chǎn)生明顯的體液免疫應(yīng)答，而且免疫組血清抗體水平與保護(hù)率存在一定的相關(guān)性，這與沈錦玉等［29］和毛芝娟等［30］的研究結(jié)果相一致。雖然注射免疫的免疫保護(hù)效果優(yōu)于浸泡免疫，但注射免疫工作量大，操作繁瑣，而且易造成魚體應(yīng)激和受傷，在養(yǎng)殖生產(chǎn)上受到一定限制。浸泡免疫操作較方便，對(duì)魚體應(yīng)激較小，可對(duì)大批量幼魚進(jìn)行免疫。因此可進(jìn)一步探討浸泡免疫和注射免疫途徑相結(jié)合的免疫接種程序，即育苗期可采用浸泡免疫，而對(duì)魚種進(jìn)行注射免疫，以提高疫苗免疫保護(hù)率和延長(zhǎng)保護(hù)時(shí)間，推動(dòng)漁用疫苗的實(shí)用化研究和生產(chǎn)應(yīng)用，保障水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。

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（責(zé)任編輯：劉慶穎）

Isolation and Identification of Bacterial Pathogens from Sciaenops ocellatus with Tail-rotted Disease and Evaluation of Immune Efficacy of Inactived Vaccine

YAO Huan1，2，3，HUANG Yu-cong1，2，3，CAI Shuang-hu1，2，3，LU Yi-shan1，2，3，CAI Xiao-hui4，5，JIAN Ji-chang1，2，3
（1.Fisheries College of Guangdong Ocean University // 2.Provincial Key Laboratory of Pathogenic Biology and Epidemiology for Aquatic Economic Animals of Guangdong // 3.Key Laboratory of Control for Diseases of Aquatic Economic Animals of Guangdong Higher Education Institute，Zhanjiang 524088，China； 4.Guangxi Key Laboratory of Marine Biotechnology //5.Guangxi Institute of Oceanology，Beihai 536000，China）

A dominant bacterial strain designated as SoGZ1401 was isolated from ulcer of the moribund Sciaenops ocellatus with rotted-tail disease and was confirmed to be the pathogen by artificial infection test.The 50% lethal dose of SoGZ1401 to the S.ocellatus was 8.6×103CFUg-1.The strain SoGZ1401was identified as Vibrio harveyi based on morphology，physiological & biochemical tests and HSP60 DNA sequence analysis.The extracellular products of V.harveyi strain were studied by cylinde-plate method.The results indicated that the extracellular products show the activities of amylase，gelatinase，casease，lipase，lecithinase and haemolysin，but without urease activity.Drug sensitivity tests revealed that V.harveyi strain was sensitive to norfloxacin，Enrofloxacin，F(xiàn)lorfenicol and compound sulfamethoxazole.The vaccine was prepared with formalin-inactivated strain SoGZ1401 to study antibody titer and immune efficacy on S.ocellatus.The vaccination was administered by intraperitoneal injection and bath immersion route.Antibody titer in the serum of the injected group and immersion group were significantly increased compared with the control group and the maximal titers reach 718.4 and 128，respectively.The Relative Percentage Survival （RPS） values of the injected group and immersion group were 75.0% - 86.7% and 46.4% - 56.7%，respectively.It is concluded that S.ocellatus can produced strong immune response immunized with V.harveyi bacterin，and the vaccine provide good protection efficiency against bacterial disease cause V.harveyi.

Sciaenops ocellatus； tail-rotted disease； pathogen； Vibrio harveyi； immune efficacy

S941.42； S942.5

A

1673-9159（2016）04-0037-08

10.3969/j.issn.1673-9159.2016.04.007

2016-01-17

廣東省海洋經(jīng)濟(jì)創(chuàng)新發(fā)展區(qū)域示范專項(xiàng)（GD2012-B01-004）；廣西海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金 （GLMBT-201404）； 農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)公益項(xiàng)目（201203085）；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2012020800006）

姚歡（1987－），碩士生，從事水產(chǎn)動(dòng)物病害防治研究。E-mail：yaohhmail@163.com

黃郁蔥（1978－），男，助理研究員，博士，從事水產(chǎn)動(dòng)物免疫學(xué)及病害控制。E-mail：hyczjou@163.com