◎付琴琴

（晉中市糧油檢測中心，山西 晉中 030600）

響應(yīng)面法優(yōu)化懷山藥水溶性蛋白提取工藝的研究

◎付琴琴

（晉中市糧油檢測中心，山西 晉中 030600）

以懷山藥為原料提取水溶性蛋白，以水料比、提取溫度、提取時間為考察因素，以蛋白含量為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面分析法，比較水料比、提取溫度、提取時間及提取次數(shù)對其提取率影響。確定最佳工藝條件：水料比8.25∶1，提取溫度35.18 ℃，提取時間60.26 min，提取次數(shù)1次，提取率可達(dá)到64.9%。

水溶性蛋白；懷山藥；響應(yīng)面分析法；提取率

山藥為薯蕷科薯蕷屬植物薯蕷塊莖，為藥食同源保健食品，具有降血糖血脂、抗腫瘤、抗突變、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等功能［1］。學(xué)者們對本土山藥研究較多，如蛋白體內(nèi)和體外抗氧化活性［2］、免疫調(diào)節(jié)活性及對血管緊張素轉(zhuǎn)化酶的非競爭性抑制作用［3］。國內(nèi)學(xué)者研究主要集中于山藥種植技術(shù)、多糖提取及活性及深加工［4］等領(lǐng)域。本實驗以懷山藥（Dioscorea opposita polysaccharide，DOPS）為原料，研究其水溶性蛋白質(zhì)的提取工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

懷山藥，產(chǎn)自河南溫縣；濃硫酸、氫氧化鈉、鹽酸等試劑均為分析純。

SPD80型凱氏定氮儀，北京三品科創(chuàng)儀器有限公司；DS-1型高速組織搗碎機(jī)，上海雙旭電子有限公司；DZKW-4型水浴鍋，北京中興偉業(yè)儀器有限公司。

1.2 測定方法

蛋白含量的測定均采用凱氏定氮法。

蛋白提取率=（提取液中蛋白濃度/山藥汁中蛋白濃度）×100%。

1.3 實驗方法

1.3.1 山藥汁樣品制取和山藥蛋白提取

懷山藥表面清洗擦凈，去皮，均漿，得到山藥汁樣品。取上述樣品10 mL于三角瓶，按一定水料比加入蒸餾水，一定溫度下提取一定時間，4 000 r/min離心10 min，取上清液。分別取10 mL山藥汁樣品和10 mL提取液進(jìn)行凱式定氮試驗。

1.3.2 蛋白質(zhì)含量的測定

蛋白含量［4］（g/mL）

=［（V-V0）N×0.014×A×100］/W （1）

式（1）中，V：消耗HCl，mL；V0：空白實驗時消耗的HCl，mL；N：HCl當(dāng)量濃度；A：固定系數(shù)，6.25；W：樣品體積，mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 山藥汁樣品蛋白含量測定結(jié)果

測定V為0.53 mL，V0為0.1 mL，N為0.01 mol/L。帶入公式（1）得山藥汁中蛋白質(zhì)含量為0.376 mg/mL。

2.2 單因素試驗

2.2.1 水料比選擇試驗

提取溫度55 ℃，提取時間60 min，水料比分別2∶1、4∶1、6∶1、8∶1、10∶1和12∶1，提取1次，比較水料比對提取效果影響，結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知水料比增大蛋白提取率也增大，水料比增至8∶1后提取率減小。水料比過低，水分加入量少，混合液黏度較高，蛋白不易析出。水料比過高，加水量多給后續(xù)濃縮增加工作量，確定水料比8∶1。

圖1 水料比對提取效果影響圖

2.2.2 提取溫度的選擇試驗

水料比6∶1，提取時間60 min，提取溫度分別為15 ℃、25 ℃、35 ℃、45 ℃和55℃，提取1次，考察提取溫度對提取效果影響，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，隨提取溫度提高蛋白提取率增大，達(dá)到35 ℃以后，提取率迅速減小。低溫條件下，蛋白質(zhì)不能充分溶于水，提取不充分；溫度升高，蛋白與水作用加強(qiáng)，提取率可能升高；溫度過高，蛋白結(jié)構(gòu)解體，蛋白分子變性凝固沉淀，確定提取溫度35 ℃。

圖2 提取溫度對提取效果影響圖

2.2.3 提取時間的選擇試驗

水料比6∶1，提取溫度55 ℃，依次提取30、60、90、120min和150min，提取1次，考察提取時間對提取效果影響，結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知蛋白析出量最初隨時間增加上升，60 min后開始下降，下降幅度趨于平緩，表明開始時，蛋白析出速率快，之后降低可能與多糖、多酚等結(jié)合的蛋白還未析出；延長提取時間，細(xì)胞充分溶脹，蛋白質(zhì)易溶出；時間過長，蛋白顆粒間作用力增強(qiáng)，易變性凝集沉淀。確定提取時間為60 min。

圖3 提取時間對提取效果影響圖

2.2.4 提取次數(shù)的選擇試驗

水料比1∶6，提取溫度55 ℃，提取時間60 min，依次提取1、2、3、4和5次，考察提取次數(shù)對提取效果影響，結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知，提取1次蛋白提取率最高，隨著提取次數(shù)增加，提取率急劇下降，以提取1次為宜。

圖4 提取次數(shù)對提取效果影響圖

2.3 響應(yīng)面分析及提取工藝優(yōu)化

2.3.1 數(shù)學(xué)模型建立與檢驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，提取1次蛋白提取率最高，選擇水料比、提取溫度和提取時間3個因素，利用Design-Expert 7.1.6軟件中心組合設(shè)計選項，共有17個試驗點(diǎn)，響應(yīng)面分析因素和水平見表1。

表1 響應(yīng)面因素水平表

對17個試驗點(diǎn)的結(jié)果統(tǒng)計分析，得到二次回歸方程：

各變量對響應(yīng)值影響顯著程度由F檢驗判定，P值越小，顯著程度越高［5］。該試驗?zāi)Ｐ头匠蘁值13.03，P＜0.05，整體模型顯著，失擬項不顯著，說明該回歸模型可靠，與實測值擬合良好，可用于蛋白提取條件分析和預(yù)測。

2.3.2 各因素影響程度分析

F值大小可判定各因素對蛋白提取率影響程度。F值越大對指標(biāo)影響越強(qiáng)［6］。對個因素進(jìn)行回歸方程方差分析，結(jié)果見表2。表2中，F(xiàn)Xl=55.93，F(xiàn)X2=4.94，F(xiàn)X3=2.61，各因素影響程度順序為：水料比＞提取溫度＞提取時間。方程一次項X1回歸系數(shù)極顯著，說明水料比對蛋白提取率有極顯著影響；交互項中的X1X3項表現(xiàn)出了高度顯著水平，說明水料比和提取時間的交互作用對提取率有顯著影響。

表2 回歸方程方差分析表

2.3.3 響應(yīng)面分析

響應(yīng)面圖能直觀反映各因素對響應(yīng)值影響及交互作用程度［7］。為考察交互作用對蛋白提取率影響，對模型降維分析。經(jīng)Design-Expert 7.1.6軟件分析，可得到二次方程響應(yīng)曲面圖，如圖5、圖6、圖7所示。

由圖5-7可知，在所選試驗范圍內(nèi)，各因素均有極點(diǎn)；曲面陡峭程度可看出水料比影響最大，提取溫度次之，提取時間影響最小；等高線圖近似橢圓形，說明因素間有一定交互作用，結(jié)果與回歸分析吻合［8］。

圖5 Y=f（X1，X2）的響應(yīng)面

圖6 Y=f（X2，X3）的響應(yīng)面

圖7 Y=f（X1，X3）的響應(yīng)面

2.3.4 模型驗證

為驗證響應(yīng)面法的可靠性，采用最優(yōu)條件試驗，水料比8.25∶1，提取溫度35.18 ℃，提取時間60.26 min，提取次數(shù)1次，試驗重復(fù)3次，實際測得蛋白含量0.244 mg/mL，蛋白提取率64.9%，理論預(yù)測值0.253 mg/mL，蛋白提取率65.4%，相對誤差為－0.7%。

3 結(jié)論

懷山藥水溶性蛋白提取單因素試驗和響應(yīng)面試驗確定最佳工藝條件為水液料比8.25∶1，提取溫度35.18 ℃，提取時間60.26 min，提取次數(shù)1次，蛋白質(zhì)提取率可達(dá)到64.9%。

［1］袁書林.山藥的化學(xué)成分和生物活性作用研究進(jìn)展［J］.食品研究與開發(fā)，2008，29（3）：176-179.

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Extraction of Water-soluble Protein from Dioscorea Opposita Thunb Using Response Surface Method

Fu Qinqin
（Jinzhong Testing Center of Grain and Oils， Jinzhong 030600， China ）

Water-soluble protein was extracted from Dioscorea Opposita Thunb. The efects of solventmaterial ratio， extraction temperature， extraction time， extraction times and their efects on the yield of watersoluble protein were studied. Based on the results of single factor test， the yield response was analyzed using method of response surface analysis. The optimal condition was as follows: solvent-material ratio 8.25，extraction temperature 35.18 ℃， extraction time 60.26 min， and extracting 1 time. Under this condition， the extraction yield of water-soluble protein was 64.9%.

Water-soluble protein； Dioscorea Opposita Thunb； Response surface analysis； Extraction yield

TQ936

10.16736/j.cnki.cn41-1434/ts.2016.16.046

付琴琴（1984-），女，碩士研究生；主要研究方向為食品科學(xué)。