孫陽，張豪杰，郭文學，王哲，賈宇馳，祁偉

鮑氏志賀菌臨床分離株的毒力基因檢測及分子分型

孫陽，張豪杰，郭文學，王哲，賈宇馳，祁偉△.

目的了解鮑氏志賀菌臨床分離株毒力基因分布、耐藥性、分子分型及菌株間流行病學相關性。方法從我院2015年6月—10月間門診就診腹瀉病患者的糞便中分離收集9株鮑氏志賀菌。采用K-B紙片擴散法行抗生素藥敏試驗，聚合酶鏈反應技術檢測毒力基因，脈沖場凝膠電泳技術及多位點序列分型確定分子分型，分析菌株間流行病學相關性。結(jié)果9株鮑氏志賀菌共分為3個血清亞型:Ⅰ型1株，Ⅱ型3株，Ⅳ型5株。9株菌均為多重耐藥菌:對氨芐西林耐藥率為9/9，對頭孢他啶、鏈霉素、慶大霉素、復方新諾明、頭孢噻肟、頭孢曲松、四環(huán)素、諾氟沙星和左氧氟沙星的耐藥率分別為1/9、4/9、4/9、4/9、5/9、5/9、6/9、6/9、6/9，未發(fā)現(xiàn)阿米卡星、頭孢哌酮-舒巴坦和亞胺培南耐藥株；ipaH的檢出率為100%，sen、set1A、set1B、ial、virA、icsA、sigA的檢出率均為0，pic、sepA、sat的檢出率分別為4/9、5/9、7/9；9株鮑氏志賀菌通過脈沖場凝膠電泳共分為8種譜型，相似性在63.21%～100%。多位點序列分析結(jié)果顯示6株為ST648，2株為ST131、1株為ST10。結(jié)論本院分離的9株鮑氏志賀菌共分3個血清亞型，多重耐藥情況嚴重，菌株間親緣關系相對較遠，屬非暴發(fā)病例。

志賀菌屬，鮑氏；微生物敏感性試驗；電泳，凝膠，脈沖場；毒力基因；脈沖場凝膠電泳；多位點序列分型

志賀菌是引起細菌性痢疾的重要病原菌，主要分為4個血清型:A群痢疾志賀菌除了有內(nèi)毒素外，還存在外毒素，即志賀毒素，因此引起的病情較重；B群福氏志賀菌感染易轉(zhuǎn)變?yōu)槁?；C型主要為鮑氏志賀菌，研究較少；D群宋內(nèi)志賀菌抗原單一，只有1個血清型，多引起輕型感染［1］。研究認為，D群志賀菌的作用機制可能與細菌內(nèi)的鳥氨酸脫羧酶有關，鳥氨酸脫羧酶能夠促使腸道黏膜細胞的增生和分化［2］。目前，有關鮑氏志賀菌的臨床資料較少，而我院夏季腸道門診感染鮑氏志賀菌的患者均會有腹瀉癥狀，且多為黏液樣和水樣便。據(jù)估計，每年全球大約1.65億人感染細菌性痢疾，死于該疾病者約110萬人［3］。目前，引起感染的優(yōu)勢菌在我國主要為福氏志賀菌，鮑氏志賀菌感染較少［4］。本研究旨在分析鮑氏志賀菌的特點及親緣關系，應用聚合酶鏈反應、脈沖場凝膠電泳（PFGE）和多位點序列分型（MLST）技術分析其進化軌跡及菌株的相似性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及來源收集2015年6月—10月分離自天津醫(yī)科大學第二醫(yī)院腸道門診就診患者的糞便標本，共計9株，經(jīng)常規(guī)生化及血清凝集試驗均已證實為鮑氏志賀菌。質(zhì)控菌株大腸桿菌ATCC25922和沙門菌布倫敦盧普（Braenderup）血清型H9815為本研究所保存。

1.1.2 主要儀器與試劑DNA擴增熱循環(huán)（PCR）儀（德國Eppendorf公司）、DYY-6D型電泳儀（北京六一儀器廠）、GEL-DOC-200型凝膠成像系統(tǒng)（美國BIO-RAD公司）。高壓蒸汽滅菌器（山東安得醫(yī)療科技有限公司）、DNP-9082BS-Ⅲ型電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海市新苗醫(yī)療器械制造有限公司）。志賀菌4種多價混合血清及分群血清購自寧波天潤生物藥業(yè)有限公司。水解酪蛋白（MH）瓊脂購自上海伊華生物科技有限公司。13種藥敏紙片:氨芐西林（AMP）、頭孢他啶（CTZ）、頭孢噻肟（CTX）、頭孢曲松（CTR）、亞胺培南（IMP）、慶大霉素（GM）、鏈霉素（STR）、四環(huán)素（TE）、左氧氟沙星（LVP）、諾氟沙星（NOR）、阿米卡星（AMK）、復方新諾明（SMZco）及頭孢哌酮-舒巴坦購自北京天壇生物制品研究所。瓊脂糖（Sea Kem GoldAgarose）購自龍沙（中國）投資有限公司，DNA聚合酶、蛋白酶K、內(nèi)切酶XbaⅠ、月桂酰基肌氨酸鈉購自生工生物工程（上海）股份有限公司，引物序列由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，見表1?；驕y序委托南天生物（北京）貿(mào)易有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 血清分型及生化鑒定菌株血清及生化鑒定按照《細菌性和阿米巴性痢疾診斷標準（WS 287-2008）》附錄A進行，生化反應采用API20E生化鑒定卡（法國梅里埃公司）。

1.2.2 抗生素敏感（藥敏）試驗采用改良KirbyBauer（K-B）紙片擴散法，質(zhì)控菌株為ATCC25922。根據(jù)美國臨床實驗室標準化研究所CLSI/NC-CLS 2013版標準進行判讀［5］。

1.2.3 毒力基因檢測實驗引物設計及退火溫度、循環(huán)次數(shù)參考文獻［6-7］的方法進行。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色后，GEL-DOC-200型凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果。測序結(jié)果經(jīng)BLAST程序與GenBank數(shù)據(jù)庫公布的標準菌序列進行比對、分析。

1.2.4 PFGE及MLST分型測定志賀菌adk、fumC、gyrB、icd、mdh、purA及recA這7個管家基因，并將基因序列提交至大腸埃希菌/志賀菌MLST數(shù)據(jù)庫（http://mlst.warwick.ac.uk/ mlst/dbs/Ecoli/），查詢等位基因值，確定其ST分型，實驗步驟及反應參數(shù)參考標準指南［8］，Marker為沙門菌布倫敦盧普（Braen-derup）血清型H9812株，內(nèi)切酶為XbaⅠ，圖譜提交網(wǎng)站（http://www.idwhat.com:8080/pulsenet/banthaccisEntryTable. do）進行分析處理。

Tab.1The sequence of primer表1 引物序列

2 結(jié)果

2.1 血清分型及生化鑒定結(jié)果9株鮑氏志賀菌分為3個亞型:Ⅰ型1株（C2），Ⅱ型3株（C10、C12、C13），Ⅳ型5株（C4、C8、C14、C15、C16）。

2.2 藥敏試驗結(jié)果9株鮑氏志賀菌均為多重耐藥菌。其中，AMP的耐藥率為9/9，TE、NOR、LVP的耐藥率為6/9，CTX、CTR的耐藥率為5/9，STR、GM、SMZco的耐藥率均為4/9，CTZ的耐藥率1/9，9株鮑氏志賀菌全部對AMK、頭孢哌酮-舒巴坦和IMP敏感。

2.3 毒力基因檢測結(jié)果9株鮑氏志賀菌中，ipaH的檢出率為9/9，pic的檢出率為4/9（C8、C14、C15、C16），sepA的檢出率為5/9（C8、C12、C14、C15、C16），sat的檢出率為7/9（C4、C10、C12、C13、C14、C15、C16），sen、set1A、set1B、ial、virA、icsA、sigA的基因檢出率均為0。其中3株菌同時攜帶pic、sat、sepA，1株菌同時攜帶pic和sepA，1株菌同時攜帶sat和sepA。

2.4 PFGE和MLST分析結(jié)果從PFGE聚類分析圖可以發(fā)現(xiàn):9株鮑氏志賀菌共分為8個帶型，相似性在63.21%～100%。以相似度＞90%判斷為同一克隆群:C10和C13屬于同一型，相似率為100%，其余菌株各為一型，見圖1。MLST庫分析顯示，兩株（C10和C13）屬于ST131:adk（53）、fumC（40）、gyrB（47）、icd（13）、mdh（36）、purA（28）、recA（29）；6株（C4、C8、C12、C14、C15、C16）屬于ST648:adk（92）、fumC（4）、gyrB（87）、icd（96）、mdh（70）、purA（58）、recA（2）；1株（C2）為ST10:adk（10）、fumC（11）、gyrB（4）、icd（8）、mdh（8）、purA（8）、recA（2），見表2。

Fig.1Cluster analysis of PFGE圖1 PFGE聚類分析

3 討論

志賀菌是細菌性痢疾的主要致病菌。一般情況下，在發(fā)達國家志賀菌引起腹瀉的優(yōu)勢菌群通常以宋內(nèi)為主，我國長期以來以福氏為主。但近年來包括天津地區(qū)在內(nèi)的國內(nèi)很多地區(qū)的優(yōu)勢菌群逐漸被宋內(nèi)菌取代，這可能是因為隨著經(jīng)濟的發(fā)展，人們免疫力逐漸提高，也可能是基因突變導致非致病菌向致病菌發(fā)生了轉(zhuǎn)變［9］。鮑氏志賀菌的感染主要集中在非洲和亞洲部分地區(qū)［10］，有關鮑氏志賀菌的生化特點、耐藥特點、遺傳學特性尚少見報道。本研究結(jié)果顯示，9株鮑氏志賀菌血分為3個血清型，其中Ⅳ型的菌株占大部分，與Smith等［10-11］研究結(jié)果不同。研究認為，這可能和地域相關，鮑氏志賀菌包含3個演化支，因此也可能和來自不同的進化支有關［12］。

本研究藥敏試驗結(jié)果顯示，9株鮑氏菌對喹諾酮類藥物、CTR和CTX的敏感率較低，這可能和菌株攜帶的酶（CTX-M）能夠水解CTX有關［13］；9株鮑氏菌對第三代頭孢中的CTZ耐藥株僅1株，對AMK、頭孢哌酮-舒巴坦和IMP均敏感。但根據(jù)2013年CLSI/NC-CLS文件規(guī)定，志賀菌和沙門菌在體外對氨基糖苷類藥物敏感，但臨床治療無效，故臨床治療過程中一般不報告其結(jié)果。此外，本研究顯示，9株鮑氏志賀菌對世界衛(wèi)生組織推薦臨床應用的LVP和CTR的耐藥率較高，在臨床經(jīng)驗性治療中已不適合使用，若腹瀉患者癥狀無好轉(zhuǎn)可調(diào)整應用CTZ。

Tab.2The characteristics of nine Shigella boydii isolates表2 9株鮑氏志賀菌屬的特點

本所分離的9株鮑氏志賀菌對喹諾酮類和第三代頭孢菌素的耐藥率高于其他血清型。徐明玉等［14］研究顯示，宋內(nèi)志賀菌對環(huán)丙沙星的敏感率為100%，對CTX也較敏感。朱美娟等［15］報道宋內(nèi)志賀菌對氟喹諾酮類藥物較為敏感，福氏志賀菌對頭孢類藥物相對敏感。張國祥等［16］認為宋內(nèi)志賀菌對氟喹諾酮類藥物的敏感性較高。與國外地區(qū)相比，有研究認為鮑氏志賀菌對頭孢類及喹諾酮類藥物均有較好的敏感性，而El-Gendy等［17］研究則顯示鮑氏志賀菌對頭孢類藥物的耐藥性較高。因此，雖然細菌的耐藥性不斷增強，但是宋內(nèi)和福氏志賀菌并沒有對頭孢類和氟喹諾酮類均產(chǎn)生嚴重的耐藥性，結(jié)合本研究結(jié)果筆者認為，除了CTZ，其他藥物并不適合應用于腹瀉患者的經(jīng)驗性治療，考慮這可能和其耐藥基因的整合相關，也可能和頻繁使用抗生素導致基因gyrA突變及細菌產(chǎn)超廣譜β內(nèi)酰胺酶（ESBLs）［18］和AmpC酶有關［19］，抑或存在基因缺陷，尚需要對更多鮑氏志賀菌進行基因水平的深入研究。

志賀菌通過M細胞進入腸道上皮細胞并釋放相關的毒力因子，引發(fā)炎癥反應，可引起腹痛、腹瀉等臨床癥狀，這些臨床癥狀和志賀菌的毒力基因密切相關。侵襲性質(zhì)粒相關抗原ipaH和侵襲性相關位點ial基因在志賀菌侵入宿主細胞的過程中起重要作用。ipaH位于細菌染色體和質(zhì)粒上，是多拷貝克隆，不隨細菌的反復傳代而消失，可用于志賀菌的分子鑒定。9株鮑氏志賀菌均攜帶ipaH，與相關研究相近［20-21］；ial位于質(zhì)粒上，易隨質(zhì)粒的丟失而消失［22］。本研究中，9株菌株的ial的基因檢出率為0，低于相關報道［7，23］，因菌株均為近期收集，故質(zhì)粒丟失的可能性較小，具體原因還需進一步研究驗證。virA基因位于毒力大質(zhì)粒上，編碼的virA蛋白是EspG/VirA家族的一個成員，在志賀菌侵入到宿主細胞時誘導局部的微管蛋白的降解，釋放微管相關蛋白，通過活化Rac1和RhoA，從而導致皺膜形成，有助于細菌進入到宿主細胞內(nèi)［24］。ial和virA負責細菌侵入宿主細胞，褔氏和宋內(nèi)志賀菌ial和virA攜帶率較高［25-26］。但是，9株鮑氏志賀菌均未檢測到上述2個基因，考慮可能在致病過程中，其功能被其他毒力基因所取代，這是C群志賀菌的基因特點還是偶然的現(xiàn)象，還需要更多的樣本進行佐證。set1和sen分別編碼志賀腸毒力1和志賀腸毒素2，其中set1只存在于福氏志賀菌，sen存在于各型志賀菌中，仍以福氏為主［27］。本所收集的9株鮑氏志賀菌中未檢出sen和set1，但有研究在鮑氏志賀菌中檢出了志賀腸毒素2［28］。另外，志賀菌的毒力因子還包括絲氨酸蛋白酶自轉(zhuǎn)運蛋白（SPATEs）［29］。SPATEs家族分為兩類:一類可以對腸上皮細胞產(chǎn)生毒性作用，包括質(zhì)粒編碼毒素（pet）、sat、sigA，其中sat和pet的氨基酸相似率達52%，可以推測二者在可能具有相同的致病機制；第二類對腸道細胞沒有毒性作用，包括pic和sepA，pic編碼的蛋白酶能夠溶解腸道表面的黏液層，臨床上可出現(xiàn)水樣腹瀉的癥狀，并且有利于細菌的定植；sepA則參與腸道炎癥反應的應答。本研究中，9株鮑氏志賀菌的SPATEs攜帶率相對較高，這與相關報道較為相似［30］。這是否是鮑氏志賀菌的基因特點還需更多的菌株做進一步驗證。

PFGE廣泛用于菌株的流行病學研究中，能夠準確地反映菌株的克隆關系。本研究中的9株鮑氏志賀菌分為8個帶型，其中僅2株的相似性為96.72%，ST分型為ST131，與其他7株菌的親緣關系較遠，相似性為63.21%。其余7株各成一型，相似性在70%以上，除C2外都屬于ST648，考慮他們可能來自于同一祖先的不同分支。C2屬于ST10，和其他菌株的關系較遠，但其藥敏特點及毒力基因的攜帶特點和ST131較為相似。

另外，聚類分析顯示兩株親緣關系非常近的C10和C13具有相同的耐藥表型、ST分型和毒力基因攜帶狀況，屬于ST648的6株菌除C14都對AMP、LVP和CTX顯示耐藥，將菌株的各個特點集中比較，能夠清晰地展示親緣關系相近的菌株之間的特點，也能夠通過相同的基因分型在一定程度上預測菌株的分子特性。從PFGE的圖譜分析可以看出這9株菌中除C10和C13外，其他各菌株的親緣關系較遠，菌株間無流行病學相關性，非一次暴發(fā)病例，屬于普通的散發(fā)病例。

雖然本研究樣本量較小，暫時無法在統(tǒng)計學方面分析鮑氏志賀菌的分子特點，但是本研究準確地提供了本所分離的鮑氏志賀菌的相關信息，這對其他學者在研究鮑氏志賀菌時具有一定的參考價值。

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（2016-05-24收稿2016-07-05修回）

（本文編輯陸榮展）

Detection of virulence gene and molecular typing of Shigella boydii isolated from clinical sources

SUN Yang，ZHANG Haojie，GUO Wenxue，WANG Zhe，JIA Yuchi，QI Wei.△
Infectious Disease Institute，the Second Hospital of Tianjin Medical University，Tianjin 300211，China△

ObjectiveTo understand genetic distribution，drug resistance，molecular typing and the epidemiological relativeness between strains of the Shigella boydii virulence.MethodsNine Shigella boydii strains were isolated form stool samples of patients with diarrhea from the Enteric Disease Clinic of the Second Hospital of Tianjin Medical University in June-October 2015.The strains were identified by biochemical test and serum agglutination test.Antibiotics susceptibility test was carried out using the Kirby-Bauer method.Polymerase chain reaction was used for detecting virulence genes. Pulsed-field gel electrophoresis（PFGE）and multilocus sequence typing（MLST）technique were used to determine the epidemiological relationship between nine Shigella boydii strains.ResultsThere were three subtypes in nine isolated Shigella boydii samples，including one，three and five isolates inⅠ，Ⅱ，Ⅳsubtypes respectively.All of the 9 isolates were multi-drug resistant.The resistant rate of these strains for ampicillin was 100%（9/9），and then the resistant rates of these strains for ceftazidime，streptomycin，gentamicin，trimethoprim/sulfamethoxazole，cefotaxime，ceftriaxone，norfloxacin and levofloxacin were 1/9，4/9，4/9，4/9，5/9，5/9，6/9，6/9 and 6/9，respectively.All of these strains were sensitive to amikacin，cefperazone-sulbactam and imipenem.The ipaH was carried by all the testing strains，and none of the strains carried the sen，set1A，set1B，ial，virA，icsA and SigA.The detective rates of pic，sepA and sat were 4/9，5/9 and 7/9 strains，respectively.Nine shigella boydii strains were divided into 8 PFGE types.The similarity between the spectrums of PFGE was 63.21%-100%. Multilocus sequence typing showed that six isolates were belonged to ST648，two isolates were ST131 and one isolate was ST10.ConclusionNine isolates of Shigella boydii（divided into three subtyping）isolated from our hospital are multi-drug resistant and they have distant relationships，belonging to the dissemination of case.

Shigella，Boydii；microbial sensitivity tests；electrophoresis，gel，pulsed-field；virulence genes；pulsedfield gel electrophoresis；multilocus sequence typing

R378.2，R516.43

A

10.11958/20160440

天津醫(yī)科大學第二醫(yī)院感染性疾病研究所（郵編300211）

孫陽（1991），女，碩士在讀，主要從事感染性疾病研究

△通訊作者E-mail:qiweiwyx@yahoo.com