章晶晶，王 贊，張翠俠，馬超峰，周 巍,2,，張 巖（.河北省食品檢驗研究院，河北省食品安全重點實驗室，河北 石家莊 05007；2.河北農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，河北 保定 07000）

應(yīng)用依賴解旋酶DNA擴增技術(shù)檢測轉(zhuǎn)基因大豆

章晶晶1，王 贊1，張翠俠1，馬超峰1，周 巍1,2,*，張 巖1
（1.河北省食品檢驗研究院，河北省食品安全重點實驗室，河北 石家莊 050071；2.河北農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，河北 保定 071000）

目的：基于依賴解旋酶DNA恒溫擴增（helicase-dependent isothermal DNA amplifi cation，HDA）技術(shù)，建立快速檢測轉(zhuǎn)基因大豆的方法。方法：采用以CaMV35S、NOS、CP4-EPSPS 3 種外源基因和內(nèi)源基因Lectin（大豆凝集素基因）為目的片段設(shè)計4 對特異引物，建立反應(yīng)體系，通過HDA方法對內(nèi)源基因和3 種外源基因的檢測特異性和靈敏度進行實驗，并對結(jié)果進行同源性分析。結(jié)果：建立了轉(zhuǎn)基因大豆HDA檢測法，檢測特異性良好，3 種外源基因的檢出限為0.2%。結(jié)論：轉(zhuǎn)基因大豆的HDA檢測方法具有普通聚合酶鏈式反應(yīng)的特異、靈敏等特點，并且對儀器要求更低，極適合基層實驗室使用，具有廣闊的應(yīng)用前景。

依賴解旋酶DNA擴增；轉(zhuǎn)基因大豆；檢測

隨著現(xiàn)代科技在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用，轉(zhuǎn)基因作物近年來得到迅速發(fā)展。轉(zhuǎn)基因食品在傳統(tǒng)食品市場中份額不斷加大并進入了食物鏈。轉(zhuǎn)基因大豆是較早商業(yè)化生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因作物之一，與非轉(zhuǎn)基因大豆相比，轉(zhuǎn)基因大豆在提高產(chǎn)量、抗逆能力、品質(zhì)改良、解決人類面臨的環(huán)境污染、溫飽問題及資源短缺等方面日益顯出巨大作用。同時，轉(zhuǎn)基因作物的安全性也逐漸成為人們關(guān)注的焦點，具體包括食用安全性和生態(tài)安全性[1-2]。由于轉(zhuǎn)基因食品的安全性短時間內(nèi)難以確定，各國對轉(zhuǎn)基因食品使用標簽制度進行管理[3]，所以急需建立一套準確、快速檢測轉(zhuǎn)基因食品的方法。

目前，對轉(zhuǎn)基因大豆的實驗室檢測包括基于核酸的檢測技術(shù)主要有聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）方法[4]和基于PCR原理的其他檢測方法如實時熒光PCR[5-7]、多重PCR[8]、巢式PCR[9-10]、等溫環(huán)介導(dǎo)PCR[11-12]，這些方法檢測速度快，特異性高，但需要特定儀器，難以普及應(yīng)用并且檢測費用昂貴?；诘鞍讬z測的方法主要是酶聯(lián)免疫法[13]，此方法需要的抗體和抗原制備較為困難，價格昂貴。

近年來，一種新型核酸恒溫擴增技術(shù)依賴解旋酶DNA恒溫擴增（helicase-dependent isothermal DNA amplification，HDA）技術(shù)因其操作簡單、結(jié)果準確、反應(yīng)靈敏、無需特殊儀器、便于普及而廣泛受到關(guān)注。HDA技術(shù)是核酸等溫擴增技術(shù)的一種，主要利用解旋酶在恒溫條件下解開DNA雙鏈，同時DNA單鏈結(jié)合蛋白穩(wěn)定解開的單鏈為引物提供結(jié)合的模板，之后由DNA聚合酶催化合成互補鏈。新合成的雙鏈在解旋酶作用下又解成單鏈，并作為下一輪合成的模板進入上述循環(huán)擴增反應(yīng)，最終實現(xiàn)靶序列的指數(shù)式增長[14]。HDA法目前已經(jīng)應(yīng)用于一些致病菌的檢測[15-19]以及轉(zhuǎn)基因成分檢測[20]，本研究擬采用以35S啟動子（cauliflower mosaic virus 35S，CaMV35S）、NOS終止子（nopaline synthase，NOS）、5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶（5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase，CP4-EPSPS）3 種外源基因和內(nèi)標基因Lectin為目的片段設(shè)計4 對特異引物，建立快速檢測轉(zhuǎn)基因大豆的新方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

非轉(zhuǎn)基因大豆、轉(zhuǎn)基因大豆 國家標準物質(zhì)中心。

十六烷三甲基溴化銨（hexadecyltrimethylammonium bromide，CTAB） 天津市科密歐化學試劑有限公司；三羥甲基氨基甲烷（tirs hydroxymethyl aminomethane，Tris） 天津市博迪化工有限公司；乙二胺四乙酸二鈉（ethylene diaminetetraacetic acid disodium，Na2EDTA）北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責任公司；三氯甲烷、異戊醇、無水乙醇、氯化鈉（均為分析純） 天津市永大化學試劑有限公司；大腸桿菌解旋酶Ⅱ（UvrD） 上海富眾生物科學有限公司；MutL蛋白、T4噬菌體基因32編碼蛋白（T4 gp 32）、Bst聚合酶 美國NEB公司；dNTP，100 bp DNA Ladder Marker、三磷酸腺苷 大連寶生物技術(shù)公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DXY-33A型電泳儀 北京市六一廠；Gel Doc XR凝膠成像系統(tǒng) 美國伯樂公司；6400型恒溫金屬浴 上海東升儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 大豆DNA的提取

將大豆研磨成粉末狀，稱取100 mg大豆粉末，加入2 mL離心管中；加入1 000 μL CTAB提取液和2 μL RNase酶溶液，充分混勻，65 ℃孵育30 min，不時振蕩；12 000 r/min室溫離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移至另一干凈的2 mL離心管中；加入三氯甲烷-異戊醇（24∶1，V/V）溶液，輕緩顛倒數(shù)次后室溫靜置5 min，12 000 r/min室溫離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移至另一干凈的1.5 mL離心管中；加入2 倍體積CTAB沉淀液，顛倒混勻后，室溫靜置1 h；加入400 μL 1 mol/L氯化鈉溶解沉淀，56 ℃孵育15 min，期間輕搖離心管數(shù)次助溶，加入800 μL經(jīng)－20 ℃預(yù)冷的無水乙醇，顛倒混勻后－20 ℃靜置 1 h，15 000 r/min，室溫離心10 min，小心棄去上清液；體積分數(shù)70%乙醇溶液洗滌沉淀2～3 次，干燥DNA；50 μL 0.1×TE溶解沉淀，4 ℃保存?zhèn)溆肹21]。

1.3.2 引物設(shè)計

根據(jù)抗除草劑草甘膦的轉(zhuǎn)基因大豆，轉(zhuǎn)入外源基因有CaMV35S、NOS和CP4-EPSPS基因，以此類基因為檢測目的片段，以Lectin基因作為內(nèi)源基因檢測DNA的提取質(zhì)量，本實驗就轉(zhuǎn)基因成分的引物設(shè)計一般遵循目的靶序列較小控制在100～200 bp，一定程度上克服了深加工食品高溫蒸煮等加工工藝對檢測方法的限制。根據(jù)美國國家生物技術(shù)信息中心公布的外源基因和內(nèi)源基因的準確序列，使用Primer Premier 5.0引物設(shè)計軟件，并進行BLAST比對，設(shè)計4 對特異性擴增引物如表1所示。

表1 引物序列與目的擴增產(chǎn)物大小Table 1 Primer sequences and corresponding lengths of PCR products

1.3.3 HDA擴增體系的建立

[22]優(yōu)化并建立反應(yīng)體系，反應(yīng)體系為50 μL，采用兩步法反應(yīng)。

反應(yīng)液Ⅰ：2 μL模板DNA，引物（10 μmol/L）各2 μL，用ddH2O補至25 μL。

反應(yīng)液Ⅱ：10×buffer（100 mmol/L 二硫蘇糖醇、350 mmol/L Tris-HAc、100 mmol/L MgSO4、1 mg/mL牛血清白蛋白）5 μL，dNTPs（10 mmol/L）4 μL，ATP（100 mmol/L）2 μL，Bst polymerase（8 000 U/mL）2 μL，UvrD helicase（100 mg/L）1 μL，MutL蛋白（600 mg/L）1 μL，T4 gp32（10 mg/mL）0.6 μL，海藻糖（5 mol/L）5 μL，用ddH2O補至25 μL。

反應(yīng)液Ⅰ在95 ℃水浴5 min然后于55 ℃水浴退火3 min，取出后于室溫將反應(yīng)液Ⅱ加入反應(yīng)液Ⅰ混勻，置65 ℃恒溫擴增90 min。質(zhì)量分數(shù)2%瓊脂糖凝膠電泳（100 V）45 min檢測產(chǎn)物。

1.3.4 HDA法檢測轉(zhuǎn)基因大豆特異性

利用表1所列外源基因CaMV35S、NOS、CP4-EPSPS的3 組引物和內(nèi)源基因Lectin的一組引物，分別對轉(zhuǎn)基因大豆和非轉(zhuǎn)基因大豆進行HDA法檢測。按照1.3.3節(jié)建立的HDA反應(yīng)體系進行HDA法檢測，驗證HDA法檢測的特異性。

1.3.5 HDA法檢測轉(zhuǎn)基因大豆的產(chǎn)物分析

按照1.3.3節(jié)建立的HDA反應(yīng)體系，分別配制外源基因CaMV35S、NOS、CP4-EPSPS和內(nèi)源基因Lectin的反應(yīng)體系進行HDA擴增反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后對擴增產(chǎn)物進行純化并送專業(yè)測序機構(gòu)測序，測序結(jié)果通過NCBI進行在線BLAST從而驗證擴增產(chǎn)物的同源性。

1.3.6 HDA法檢測轉(zhuǎn)基因大豆的檢出限

將非轉(zhuǎn)基因大豆和轉(zhuǎn)基因大豆按比例混合，混合后使轉(zhuǎn)基因大豆所占比例為100%、10%、5%、2.5%、1%、0.5%、0.2%、0.1%、0.01%，使用高速粉碎機從低濃度到高濃度粉碎大豆樣品，按照1.3.1節(jié)方法提取大豆基因組，并依據(jù)1.3.3節(jié)建立的HDA擴增體系進行PCR，確定非轉(zhuǎn)基因大豆和轉(zhuǎn)基因大豆混合樣的檢出限。

2 結(jié)果與分析

如圖1所示，由于內(nèi)源基因植物凝集素Lectin基因是大豆內(nèi)源基因，轉(zhuǎn)基因大豆和非轉(zhuǎn)基因大豆均能夠擴增出來409 bp的植物凝集素Lectin基因，符合理論要求，通過電泳結(jié)果證明與理論相符，因此，植物凝集素Lectin可以作為檢測大豆轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灥膬?nèi)源參照基因，來達到檢測整個檢測體系是否正常運行的目的。

只有轉(zhuǎn)基因大豆能夠擴增出單一且清晰的191 bp的CaMV35S基因、101 bp的NOS基因、255 bp的CP4-EPSPS基因，而非轉(zhuǎn)基因大豆沒有擴增出相應(yīng)的電泳條帶，并且電泳條帶清晰、無非特異性擴增現(xiàn)象，說明轉(zhuǎn)基因大豆根據(jù)CaMV35S、NOS、CP4-EPSPS基因設(shè)計的引物特異性較強，可以用于轉(zhuǎn)基因大豆的轉(zhuǎn)基因成分的檢測。

2.2 HDA法檢測轉(zhuǎn)基因大豆產(chǎn)物分析結(jié)果

擴增產(chǎn)物由上海生物工程公司進行測序，利用美國州立生物技術(shù)信息中心生物信息平臺進行在線BLAST，對擴增產(chǎn)物進行同源性分析，結(jié)果均為100%，如表2所示，證明外源基因CaMV35S、NOS、CP4-EPSPS和內(nèi)源基因Lectin的擴增產(chǎn)物為符合轉(zhuǎn)基因大豆特異性要求的靶標基因，符合檢測需要。

表2 HDA法檢測轉(zhuǎn)基因大豆擴增片斷的比對結(jié)果Table 2 Homology analysis of HDA amplified fragments from genetically modified soybean by BLAST (basic local alignment search tool)

2.1 HDA法檢測轉(zhuǎn)基因大豆的特異性

利用設(shè)計的針對轉(zhuǎn)基因大豆中常見的CaMV35S、NOS、CP4-EPSPS 3 種外源基因和大豆內(nèi)源基因植物凝集素Lectin基因的4 對特異性引物進行HDA法檢測，以非轉(zhuǎn)基因大豆DNA作為陰性對照，檢測這4 對引物的特異性。

圖1 HDA法檢測轉(zhuǎn)基因大豆的特異性Fig.1 Specificity of HDA for the detection of transgenetic soybean

2.3 HDA法檢測轉(zhuǎn)基因大豆的檢出限

將已知的轉(zhuǎn)基因大豆和已知的非轉(zhuǎn)基因大豆按照不同比例混合，轉(zhuǎn)基因大豆所占的比例分別為100%、10%、5%、2.5%、1%、0.5%、0.2%、0.1%、0.01%，按照1.3.1節(jié)建立的大豆基因組DNA提取方法提取大豆基因組，并配以非轉(zhuǎn)基因大豆對照和陰性對照，按1.3.3節(jié)建立的HDA擴增體系進行擴增，確定大豆不同外源基因的檢出限。

圖2 HDA法檢測轉(zhuǎn)基因大豆外源基因CaMV35S（A）、NOS（B）、CP4 EPSPS（C）的檢出限Fig.2 Electrophorograms showing the detection limit of HDA for CaMV35S (A), NOS (B) and CP4-EPSPS (C) genes

表3 HDA法檢測轉(zhuǎn)基因大豆的最出限Table 3 The detection limit of HDA for genetically modified soybean

由圖2和表3可知，轉(zhuǎn)基因大豆含量在100%、10%、5%、2.5%、1%、0.5%、0.2%時，外源基因CaMV35S、NOS、CP4-EPSPS均能夠產(chǎn)生單一、清晰的目的基因片段條帶，長度分別約為191、101、255 bp，符合特異性引物設(shè)計目的，而轉(zhuǎn)基因大豆含量在0.1%、0.01%時則無清晰可見的目的電泳條帶產(chǎn)生，因此，可以證明HDA法檢測大豆不同外源基因的檢出限為0.2%。

3 討 論

目前轉(zhuǎn)基因大豆的檢測已經(jīng)有了許多相關(guān)研究，黃昆侖等[9]用巢式和半巢式對大豆中的內(nèi)源基因Lectin和轉(zhuǎn)基因大豆中的外源基因進行了定量檢測；勵建榮等[4]通過設(shè)計特異性引物和探針對豆粕中外源基因CaMV35S、NOS、CP4-EPSPS進行了定性檢測；王華[5]、葉可萍[7]等采用實時熒光定量PCR技術(shù)，通過使用特異的引物和探針對轉(zhuǎn)基因大豆外源基因進行檢測；Thongsri等[23]使用巢式PCR針對轉(zhuǎn)基因大豆顆粒中提取的DNA作為模板梯度稀釋成不同濃度梯度的DNA溶液進行擴增反應(yīng)，但經(jīng)典的半巢式PCR操作繁瑣，還需進行兩輪PCR反應(yīng)，會大大增加污染的可能性；張秀豐等[8]建立了五重PCR反應(yīng)體系用于檢測轉(zhuǎn)基因大豆；邵碧英等[11]據(jù)轉(zhuǎn)基因大豆A2704-12品系的特異序列設(shè)計環(huán)介導(dǎo)等溫擴增引物建立了轉(zhuǎn)基因大豆A2704-12品系的LAMP檢測方法，袁瑛娜等[12]以CP4-EPSPS基因的保守區(qū)域設(shè)計內(nèi)、外引物和環(huán)引物通過采用改良環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)檢測抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆；曾有研究[24]報道使用HDA法可用于檢測人乳頭瘤病毒導(dǎo)致的宮頸癌；Zahradnik等[25]針對幾種常用等溫擴增方法在檢測轉(zhuǎn)基因木薯方面進行比較，發(fā)現(xiàn)針對轉(zhuǎn)基因木薯的CaMV35S基因設(shè)計引物，使用HDA和環(huán)介導(dǎo)等溫擴增方法并進行檢測效果較好，并且HDA法檢測限可以達到0.5%[25]。

目前常用的轉(zhuǎn)基因大豆檢測方法是實時熒光PCR技術(shù)，通過在線實時監(jiān)測PCR反應(yīng)并捕捉熒光信號強度來實現(xiàn)即時定量地檢測待檢樣品中轉(zhuǎn)基因成分，并且無需打開擴增體系這樣封閉操作，也不會造成氣溶膠污染的潛在污染情況的發(fā)生，毫無疑問是檢測行業(yè)首推的檢測方法；環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)雖然也具備不需要昂貴的儀器設(shè)備這樣的優(yōu)勢，但因其引物的靈敏度極高很容易造成假陽性，因此實際檢測過程中也很難得到應(yīng)用。在檢測效率以及防止交叉污染方面，本研究建立HDA技術(shù)檢測轉(zhuǎn)基因大豆方法無法與熒光定量PCR相媲美，但HDA技術(shù)因其不需要昂貴的PCR儀，引物設(shè)計簡單無需熒光探針，且操作簡便，僅需要恒溫水浴槽就能進行反應(yīng)，所以在很多條件受限的基層檢驗檢測機構(gòu)還是有一定應(yīng)用前景[26]，同時HDA法假陽性率相對較低，很好地保證了檢測結(jié)果的可信性。隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，轉(zhuǎn)基因植物品系確實越來越多，本實驗應(yīng)用HDA技術(shù)檢測轉(zhuǎn)基因大豆成分只是針對CaMV35S、NOS、CP4-EPSPS等外源基因的篩查檢測，無法做到品系鑒定，確實滯后于當前轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)的發(fā)展要求，相信通過篩查檢測的實驗積累和條件優(yōu)化摸索可以為實現(xiàn)品系鑒定打下一定的技術(shù)基礎(chǔ)。隨著轉(zhuǎn)基因作物種植面積的日益增加以及消費者對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品關(guān)注度的日漸提高，使得轉(zhuǎn)基因的檢測任務(wù)也將日趨繁重，這就要求檢測方法具備高特異性、高靈敏度和操作簡便，因此HDA法用于轉(zhuǎn)基因大豆的檢測工作將會有很廣泛的應(yīng)用前景。

4 結(jié) 論

針對轉(zhuǎn)基因大豆外源調(diào)控序列CaMV35S、NOS、CP4-EPSPS基因和目的基因Lectin序列設(shè)計引物，成功建立了檢測轉(zhuǎn)基因大豆中轉(zhuǎn)基因成分的HDA方法。HDA法檢測轉(zhuǎn)基因大豆的特異性強，無非特異性擴增，方法檢測檢出限為0.2%。

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Detection of Genetically Modified Soybean by Helicase-Dependent Isothermal DNA Amplification Assay

ZHANG Jingjing1, WANG Zan1, ZHANG Cuixia1, MA Chaofeng1, ZHOU Wei1,2,*, ZHANG Yan1
(1. Hebei Food Safety Key Laboratory, Hebei Food Inspection and Research Institute, Shijiazhuang 050071, China; 2. College of Food Science and Technology, Agricultural University of Hebei, Baoding 071000, China)

Objective: To establish a new rapid method to detect genetically modifi ed soybean based on helicase-dependent isothermal DNA amplification (HDA). Methods: With four highly specific sets of primers synthesized to target genes including Lectin in soybean and CaMV35S, NOS and CP4-EPSPS foreign genes, PCR reaction system was established. The specifi city and sensitivity of the PCR method were tested based on HDA and homology analysis was performed. Results: The helicase-dependent isothermal DNA amplifi cation method for the rapid detection of genetically modifi ed soybean has been established. The detection limits of CaMV35S, NOS and CP4-EPSPS genes in genetically modifi ed soybeans by HDA were all 0.2%. Conclusion: HDA is a rapid, user-friendly, specifi c and sensitive method for the detection of genetically modifi ed soybean, and is very suitable for use in grassroots laboratories with a broad prospect.

helicase-dependent isothermal DNA amplifi cation (HDA); genetically modifi ed soybean; detection

10.7506/spkx1002-6630-201604029

TS207.3

A

1002-6630（2016）04-0164-05

章晶晶, 王贊, 張翠俠, 等. 應(yīng)用依賴解旋酶DNA擴增技術(shù)檢測轉(zhuǎn)基因大豆[J]. 食品科學, 2016, 37(4): 164-168.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201604029. http://www.spkx.net.cn

ZHANG Jingjing, WANG Zan, ZHANG Cuixia, et al. Detection on genetically modified soybean by helicase-dependent isothermal DNA amplification assay[J]. Food Science, 2016, 37(4): 164-168. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201604029. http://www.spkx.net.cn

2015-06-07

國家自然科學基金面上項目（31401584）

章晶晶（1988—），女，助理工程師，碩士，研究方向為生物化學與分子生物學。E-mail：zhangjj@qibebt.ac.cn

*通信作者：周?。?983—），男，高級工程師，博士研究生，研究方向為農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程。E-mail：zhouwei0311@163.com