張蕭蕭，牛丹丹,2,*，沈 微，李 玉，路福平

（1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；2.福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，福建 福州 350108；3.江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214036）

β-淀粉酶的表達(dá)與酶學(xué)性質(zhì)

張蕭蕭1，牛丹丹1,2,*，沈 微3，李 玉1，路福平1

（1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；2.福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，福建 福州 350108；3.江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214036）

本研究在構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC-BBA的基礎(chǔ)上，構(gòu)建并篩選獲得了高分泌表達(dá)大麥β-淀粉酶的重組巴斯德畢赤酵母GS-BBA。重組酵母在搖瓶發(fā)酵條件下，能夠分泌表達(dá)180 U/mL的β-淀粉酶酶活力。進(jìn)一步對該重組酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了分析，重組β-淀粉酶的最適作用溫度為55 ℃，最適作用pH值為5.0，在不高于55 ℃和在pH 3.0～10.0之間有良好的熱穩(wěn)定性和pH值穩(wěn)定性。重組酶水解淀粉的主要產(chǎn)物為麥芽糖，在普魯蘭酶的協(xié)助下，其水解淀粉形成麥芽糖的最大轉(zhuǎn)化率為78.28%。

β-淀粉酶；表達(dá)；酶學(xué)性質(zhì)；麥芽糖

β-淀粉酶（β-amylase，BBA，EC3.2.1.2）是一種外切淀粉酶，作用于淀粉時(shí)，從α-1,4-糖苷鍵的非還原性末端順次切下一個(gè)麥芽糖單位。β-淀粉酶水解直鏈淀粉分子時(shí)，水解產(chǎn)物主要是麥芽糖；β-淀粉酶作用于支鏈淀粉時(shí)，水解產(chǎn)物為麥芽糖和β-極限糊精。該酶作用底物時(shí)發(fā)生沃爾登轉(zhuǎn)位反應(yīng)，使產(chǎn)物由α型變?yōu)棣滦望溠刻枪拭?淀粉酶[1-5]。

β-淀粉酶在食品加工等工業(yè)體系中的核心應(yīng)用價(jià)值是麥芽糖制造[6]。后者不僅是糖果糕點(diǎn)、啤酒發(fā)酵、醫(yī)藥輔料等多種工業(yè)加工中的基本原（輔）料，同時(shí)也是多種主要新型糖品如海藻糖、麥芽糖醇、低聚麥芽糖等生產(chǎn)中的重要或主要原料[7-8]。

β-淀粉酶最早發(fā)現(xiàn)于高等植物中，主要包括大麥、小麥、甘薯、大豆等高等植物的種子內(nèi)[9-10]?，F(xiàn)今，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有報(bào)道微生物產(chǎn)生β-淀粉酶[11]。目前，工業(yè)上來源的β-淀粉酶主要是通過植物提取獲得，在目前已知的β-淀粉酶中，大麥來源的β-淀粉酶認(rèn)識最清楚，使用最多，也是目前唯一商業(yè)化供應(yīng)的β-淀粉酶，大麥來源的β-淀粉酶在酶學(xué)性質(zhì)，特別是很好的最適作用pH值與最適作用溫度，使其有利于其工業(yè)化應(yīng)用[12-13]。但由于植物來源的β-淀粉酶在植物中的含量較低，提取成本偏高，且所有這些酶制劑提取物都或多或少含有其他無關(guān)淀粉水解酶活，如α-淀粉酶、糖化酶等，影響其使用效果（麥芽糖漿中含有較高濃度的葡萄糖）。此外，微生物來源的β-淀粉酶盡管較早即有報(bào)道，但因?yàn)楫a(chǎn)酶水平太低以及其最適作用溫度偏低，一直未能實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)[14]。最近，國外有酶制劑企業(yè)在試圖實(shí)施大豆β-淀粉酶的重組表達(dá)與高效制備[15]。

為此，本研究運(yùn)用巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris）表達(dá)系統(tǒng)，探索其分泌表達(dá)大麥β-淀粉酶的可行性，并在研究重組酶的酶學(xué)性質(zhì)基礎(chǔ)上，分析其水解淀粉后相應(yīng)產(chǎn)物的組成特征。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及質(zhì)粒

巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris）GS115用作表達(dá)宿主，質(zhì)粒pPIC9K用作表達(dá)載體構(gòu)建質(zhì)粒，大腸桿菌（Escherichia coli）JM109用于質(zhì)粒構(gòu)建，由天津科技大學(xué)酶與應(yīng)用微生物實(shí)驗(yàn)室保藏。質(zhì)粒pMD-BBA由本實(shí)驗(yàn)室前期保藏，內(nèi)含有編碼大麥β-淀粉酶的人工合成基因序列。

1.1.2 試劑

限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、NotⅠ、SalⅠ 立陶宛Fermentas公司；T4 DNA連接酶、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增引物 生工生物工程（上海）股份有限公司；質(zhì)粒小提試劑盒、產(chǎn)物純化回收試劑盒和DNA膠回收試劑盒 美國Axygen公司；G418 美國Invitrogen公司；酵母氮基 美國BBI公司；DNA分子參照 寶生物工程（大連）有限公司；β-淀粉酶參照品及其糖品參照標(biāo)準(zhǔn)、真菌α-淀粉酶、普魯蘭酶 江蘇銳陽生物科技有限公司；其他生化試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基及其配制方法

LB、YPD、MD、G418-YPD、BMGY、BMMY等培養(yǎng)基及其配制方法參考美國Invitrogen公司的畢赤酵母表達(dá)手冊[16]。

1.2 方法

1.2.1 表達(dá)質(zhì)粒pPIC-BBA的構(gòu)建

以pMD-BBA質(zhì)粒DNA為模板，以分別添加EcoRⅠ、NotⅠ酶切位點(diǎn)的寡核苷酸序列BBA-F：5’-CGGAATTCG ACAACGTCTTCCC AGACAAG-3’和BBA-R：5’-TTGCG GCCGCCTATTAGTCGAATGGGTTA-3’為引物，PCR擴(kuò)增出β-淀粉酶成熟肽基因序列。PCR擴(kuò)增條件設(shè)定為：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。

將上述PCR產(chǎn)物用PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化，再用EcoRⅠ、NotⅠ雙酶切并純化，將此酶切后PCR產(chǎn)物克隆入pPIC9 K的EcoRⅠ、NotⅠ位點(diǎn)，重組質(zhì)粒pPIC-BBA在E. coli JM109中鑒定與保藏。

1.2.2 重組畢赤酵母的構(gòu)建

將重組質(zhì)粒pPIC-BBA經(jīng)SalⅠ線性化后，電擊轉(zhuǎn)化入畢赤酵母GS115，涂布MD平板，30 ℃培養(yǎng)至轉(zhuǎn)化子長出篩選His＋表型，將長出的轉(zhuǎn)化子點(diǎn)種至補(bǔ)加有G418的YPD平板（G418質(zhì)量濃度分別為0.5、2 mg/mL），30 ℃培養(yǎng)2 d，觀察其生長，篩選多拷貝轉(zhuǎn)化子，同時(shí)點(diǎn)至YPD淀粉檢測平板，30 ℃培養(yǎng)2 d觀察透明圈，挑選透明圈較大且生長良好的重組菌進(jìn)行后續(xù)搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 β-淀粉酶的誘導(dǎo)表達(dá)與酶活力測定

將上述透明圈較大且生長良好的重組菌株，按照畢赤酵母手冊[16]進(jìn)行搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，誘導(dǎo)表達(dá)階段每隔24 h補(bǔ)加甲醇至終體積分?jǐn)?shù)為0.5%，期間每隔24 h取樣，8 000 r/min離心10 min后對上清液中的β-淀粉酶活力進(jìn)行測定。

β-淀粉酶酶活力測定采用3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）法。酶活力單位定義為：1 mL酶液在pH 5.5、60 ℃的條件下，1 h水解可溶性淀粉產(chǎn)生1 mg麥芽糖即為一個(gè)酶活力單位，以U/mL表示。

測定步驟為：取9.0 mL 1.0 g/100 mL淀粉溶液含20 mmol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸（pH 5.5）于試管中，60 ℃預(yù)熱5 min后加入1.0 mL的酶液準(zhǔn)確反應(yīng)30 min，立即移取0.5 mL反應(yīng)液至裝有1.5 mL DNS溶液的具塞比色管中，沸水浴15 min，取出，冷卻至室溫，加入10.5 mL蒸餾水搖勻并于550 nm波長處進(jìn)行比色（OD550nm），空白管以失活的酶液代替原酶液。

繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：以O(shè)D550nm值為縱坐標(biāo)，以葡萄糖毫克數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

測得OD550nm值后，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出相應(yīng)的葡萄糖毫克數(shù)，得常數(shù)K，再乘以1.9 倍，即為麥芽糖毫克數(shù)。

酶活力/（U/mL）＝K×n×2×20×1.9

式中：K為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和OD550nm值計(jì)算得出的葡萄糖毫克數(shù)；n為稀釋倍數(shù)；2為反應(yīng)30 min換算成1 h；20為將吸取0.5 mL反應(yīng)液換成10 mL；1.9為葡萄糖換算成麥芽糖系數(shù)。

1.2.4 酶學(xué)性質(zhì)的測定

1.2.4.1 最適反應(yīng)溫度

分別在不同的溫度（40、45、50、55、60、65、70 ℃）下按照1.2.3節(jié)中的方法測定β-淀粉酶酶活力，以最高酶活力為100%，計(jì)算其他溫度下的相對酶活力，以確定其最適反應(yīng)溫度。

1.2.4.2 最適作用pH值

分別在不同pH值（4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0），緩沖液體系為20 mmol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液下測定酶活力，以最高酶活力為100%，計(jì)算其他作用pH值下的相對酶活力，以確定β-淀粉酶的最適作用pH值。

1.2.4.3 熱穩(wěn)定性

將粗酶液分別放到50、55、60、65、70 ℃保溫1 h，每隔15 min取樣，在冰上放置10 min后測定酶活力，以未進(jìn)行熱處理的酶液的酶活力為100%，計(jì)算相對酶活力，確定β-淀粉酶的熱穩(wěn)定性。

1.2.4.4 pH值穩(wěn)定性

將粗酶液用不同pH值緩沖液稀釋（pH 3.0～8.0為20 mmol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，pH 9.0為20 mmol/L Tris-HCl緩沖液，pH 10.0～11.0 20 mmol/L碳酸氫鈉-氫氧化鈉緩沖液），在30 ℃保溫1 h后測定酶活力，以未進(jìn)行pH值作用的酶液的酶活力為100%計(jì)算殘余酶活力，確定β-淀粉酶的pH值穩(wěn)定性。

1.2.4.5 金屬離子的影響

在底物中加入不同金屬離子至終濃度分別為1 mmol/L和5 mmol/L，按照1.2.3節(jié)的方法測定酶活力，以不添加任何其他金屬離子下測得的酶活力為100%，計(jì)算相對酶活力以比較不同金屬離子對β-淀粉酶酶活力的影響。

1.2.5 制糖實(shí)驗(yàn)

稱取適量麥芽糊精，配制成20 g/100 mL的溶液。調(diào)節(jié)pH值至5.0，預(yù)熱后按50 U/g（干基）加入β-淀粉酶或按50 U/g（干基）加入β-淀粉酶和0.5 U/g（干基）加入普魯蘭酶，同時(shí)采用商品酶β-淀粉酶及真菌α-淀粉酶作為對照，分別按50 U/g（干基）及15 U/g（干基）的加酶量密封，于恒溫水浴鍋中進(jìn)行糖化，溫度維持在55 ℃，糖化反應(yīng)50 h。糖化結(jié)束后取樣，用高效液相色譜進(jìn)行分析。

1.2.6 糖液組分的高效液相色譜分析

糖液樣本用70%的無水乙醇沉淀預(yù)處理，4 ℃靜置4 h后，離心20 min，取上清液用0.45 ?m微孔濾膜過濾。色譜條件：Agilent ZORBAX NH2氨基柱（4.6 mm×250 mm，5 ?m），示差折光檢測器，流動(dòng)相：乙腈-水（68∶32，V/V），流速：0.7 mL/min，柱溫：室溫。麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)參照品用純凈水配制成0.5～2.5 mg/mL；以保留時(shí)間定性出峰組成，以外標(biāo)法通過峰面積計(jì)算糖液中麥芽糖含量。麥芽糖生成率定義為單位麥芽糊精（絕干）在酶促反應(yīng)后的麥芽糖生成量，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組菌的構(gòu)建與鑒定

通過電轉(zhuǎn)化法將線性化的重組質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化入畢赤酵母GS115中，分別經(jīng)過營養(yǎng)互補(bǔ)篩選、G418抗性復(fù)篩、PCR擴(kuò)增驗(yàn)證以及淀粉平板水解圈篩選，獲得具有較好分泌β-淀粉酶的重組酵母，將其命名為GS-BBA。由圖1可知，GS-BBA在MD平板上生長良好，可以在含2 mg/mL的G418平板上生長，在淀粉平板上經(jīng)甲醇誘導(dǎo)后可以形成清澈的淀粉水解圈，表明大麥β-淀粉酶已經(jīng)在畢赤酵母GS115中成功實(shí)現(xiàn)分泌表達(dá)。

圖1 重組酵母GS-BBA水解淀粉的能力Fig.1 Starch hydrolysis activity of recombinant strain GS-BBA

2.2 重組酵母GS-BBA的發(fā)酵產(chǎn)酶進(jìn)程

圖2 重組菌搖瓶發(fā)酵產(chǎn)酶過程Fig.2 β-Amylase produced by recombinant strain in shaking flask culture

誘導(dǎo)型表達(dá)搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)按畢赤酵母操作手冊進(jìn)行[16]。在250 mL三角瓶中進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，定時(shí)取樣分析酶活力，結(jié)果如圖2所示。重組菌GS115-BBA在甲醇的誘導(dǎo)下能夠持續(xù)合成與分泌β-淀粉酶，在發(fā)酵進(jìn)行到120 h時(shí)，其產(chǎn)酶水平達(dá)到最高，為180 U/mL。

2.3 重組酶的酶學(xué)性質(zhì)

2.3.1 最適反應(yīng)溫度

圖3 重組-淀粉酶的最適溫度Fig.3 Optimal temperature of recombinant β-amylase

由圖3可知，重組β-淀粉酶在低于55 ℃時(shí)，酶活力隨著溫度升高而升高，到55 ℃時(shí)酶活力達(dá)到最大值；高于55 ℃后酶活力則隨著溫度升高而下降，70 ℃時(shí)酶活力僅為最高酶活力的30%左右。可見，重組酶的最適反應(yīng)溫度為55 ℃，在50～60 ℃間皆具有較高的酶活力。

圖4 重組β-淀粉酶的最適ppHH值Fig.4 Optimal pH of recombinant β-amylase

2.3.2 最適作用pH值由圖4可知，重組β-淀粉酶在pH 5.0條件下表現(xiàn)出最高酶活力，在pH 4.5～5.5之間具有很好的酶活力，pH 6.0之后則酶活力下降明顯。

2.3.3 熱穩(wěn)定性

圖5 重組β-淀粉酶的熱穩(wěn)定性Fig.5 Thermostability of recombinant β-amylase

為進(jìn)一步測定重組酵母分泌表達(dá)的β-淀粉酶的熱穩(wěn)定性，將重組酶酶液分別在50、55、60、65、70 ℃條件下保溫1 h，每隔15 min取樣，在冰上放置10 min后測定酶活力，以未進(jìn)行熱處理的酶液酶活力為100%，計(jì)算相對酶活力，結(jié)果見圖5。重組β-淀粉酶在50 ℃和55 ℃保溫1 h后酶活力仍保存80%左右，而65 ℃和70 ℃保溫1 h后酶活力分別僅殘留30%和20%左右。

2.3.4 pH值穩(wěn)定性

圖6 重組β-淀粉酶的pH值穩(wěn)定性Fig.6 pH stability of recombinant β-amylase

重組畢赤酵母分泌表達(dá)的β-淀粉酶的pH值穩(wěn)定性結(jié)果如圖6所示，在pH 3.0～10.0緩沖液處理1 h后酶活力仍能保持85%以上，pH 10.0以后酶活力迅速降低?？梢姡亟Mβ-淀粉酶具有良好的pH值穩(wěn)定性。

2.3.5 金屬離子對β-淀粉酶酶活力的影響

表1 金屬離子對β-淀粉酶酶活力的影響Table1 Effect of metal ions on the activity of recombinant β-amyyllaassee

由表1可知，與對照組相比，Ca2＋、Mg2＋、Co2＋、Fe2＋、Fe3＋添加濃度為1 mmol/L時(shí)會(huì)使β-淀粉酶酶活力有所升高，其余金屬離子添加濃度為1 mmol/L時(shí)會(huì)降低其酶活力，而Cu2＋對β-淀粉酶有強(qiáng)烈抑制作用。而當(dāng)金屬離子的添加濃度為5 mmol/L時(shí)，除Ca2＋、Mg2＋會(huì)使β-淀粉酶酶活力有所升高外其余金屬離子都會(huì)使β-淀粉酶酶活力降低。

2.4 淀粉水解實(shí)驗(yàn)及其產(chǎn)物分析

在含量20 g/100 mL的反應(yīng)體系中分別考察單獨(dú)使用重組β-淀粉酶和組合使用重組β-淀粉酶與普魯蘭酶進(jìn)行糖化實(shí)驗(yàn)，同時(shí)采用商品酶β-淀粉酶及真菌淀粉酶作為對照。糖液中麥芽糖含量采用外標(biāo)法用高效液相色譜分析進(jìn)行定量檢測，結(jié)果見圖7。重組β-淀粉酶水解生成麥芽糖的能力與從植物提取的β-淀粉酶相似而明顯優(yōu)于真菌淀粉酶的作用，普魯蘭酶添加則同樣有助于高含量麥芽糖的生成。在相同條件下，重組β-淀粉酶可以最高58.53%的轉(zhuǎn)化率轉(zhuǎn)化底物形成麥芽糖，真菌淀粉酶則僅以最高42.36%的轉(zhuǎn)化率轉(zhuǎn)化底物形成麥芽糖；在普魯蘭酶的協(xié)助下，重組β-淀粉酶可以最高78.28%的轉(zhuǎn)化率轉(zhuǎn)化底物形成麥芽糖。可見，此重組β-淀粉酶完全可以替代植物來源的β-淀粉酶及真菌淀粉酶，用于高麥芽糖漿的生產(chǎn)。

圖7 酶促轉(zhuǎn)化生成麥芽糖的過程Fig.7 Maltose formation from maltodextrin by enzymatic hydrolysis

3 討 論

大麥來源的β-淀粉酶的生產(chǎn)方式包括：1）以大麥或大麥麩皮為原料，經(jīng)過水浸泡后，再進(jìn)行分離、濃縮等工序制得。產(chǎn)品酶活力單一性好，轉(zhuǎn)化淀粉為麥芽糖的轉(zhuǎn)化率高，葡萄糖含量低；但提取效率低、廢水量大、產(chǎn)品成本高。2）從大麥麥芽提取獲得。產(chǎn)品收得率高，但酶系復(fù)雜，包含液化酶（α-淀粉酶）、糖化酶等酶活力，轉(zhuǎn)化淀粉為麥芽糖時(shí)，會(huì)附帶產(chǎn)生一定量的葡萄糖。除了β-淀粉酶外，可以滿足麥芽糖漿生產(chǎn)的另外一種酶為糖化型真菌α-淀粉酶（真菌淀粉酶），糖化速率快是其最大的優(yōu)點(diǎn)，但反應(yīng)中葡萄糖生產(chǎn)量也較高，不利于高純度麥芽糖的制備。本研究報(bào)道了重組大麥β-淀粉酶的制備及其應(yīng)用屬性，研究結(jié)果顯示其具有良好的麥芽糖制造應(yīng)用屬性，可為通過發(fā)酵途徑獲得大麥β-淀粉酶提供理論支撐與技術(shù)支持。

Pichia表達(dá)系統(tǒng)已經(jīng)成功應(yīng)用于多種重要酶 制劑的工業(yè)化生產(chǎn)，其外源蛋白表達(dá)水平最高可達(dá)10 g/L[17]。但其與其他酵母系統(tǒng)相似，在表達(dá)淀粉水解酶系時(shí)表達(dá)水平皆不高甚至不被表達(dá)[18]，機(jī)理尚不清楚。同樣，大麥β-淀粉酶基因的異源高表達(dá)一直以來是困難的。日本學(xué)者曾報(bào)道將大麥β-淀粉酶基因在大腸桿菌中進(jìn)行了異源表達(dá)，研究顯示植物來源的大麥β-淀粉酶可在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)活性表達(dá)[19]；但同時(shí)發(fā)現(xiàn)，所表達(dá)的β-淀粉酶很容易被降解而失去活力（作者未發(fā)表數(shù)據(jù)）。另有報(bào)道，通過定點(diǎn)突變或化學(xué)修飾等，可以將大麥β-淀粉酶的耐熱性與熱穩(wěn)定性提升[20-23]。本研究將密碼子優(yōu)化的大麥β-淀粉酶基因在Pichia系統(tǒng)中成功實(shí)現(xiàn)了表達(dá)，表達(dá)水平已經(jīng)具備一定的工業(yè)化應(yīng)用前景。但與Pichia系統(tǒng)表達(dá)植酸酶、木聚糖酶等酶制劑的表達(dá)水平相比，產(chǎn)酶水平明顯偏低。進(jìn)一步提高其表達(dá)水平，可在如下三方面深入研究：1）通過定點(diǎn)突變，改變大麥β-淀粉酶的氨基酸序列中相關(guān)糖基化位點(diǎn)，降低糖基化負(fù)荷；2）通過分子進(jìn)化獲得高酶比活的β-淀粉酶突變體；3）研究并優(yōu)化α-因子信號肽與β-淀粉酶成熟肽之間的適配性。

此外，近期的研究還顯示，β-淀粉酶還可以經(jīng)過一定的工藝條件應(yīng)用于人造多分支淀粉（糊精）等新型食品添加劑的研制與生產(chǎn)[24-25]，本研究β-淀粉酶是否具有這方面的作用尚不清楚，將在后續(xù)的研究中進(jìn)一步完善。

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Expression and Enzymatic Properties of β-Amylase

ZHANG Xiaoxiao1, NIU Dandan1,2,*, SHEN Wei3, LI Yu1, LU Fuping1
(1. College of Biotechnology, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China; 2. College of Biological Science and Engineering, Fuzhou University, Fuzhou 350108, China; 3. School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214036, China)

In this research, a recombinant Pichia pastoris strain GS-BBA overexpressing barley β-amylase was developed using the recombinant expression plasmid pPIC-BBA. Strain GS-BBA could produce approximately 180 U/mL β-amylase in shaking flask culture. The biochemical properties of the recombinant β-amylase were examined. The maximum activity was achieved under the conditions of pH 5.0 and 55 ℃. Meanwhile, its excellent thermostability and pH stability was observed at a temperature not exceeding 55 ℃ and in the pH range of 3.0–10.0. The recombinant enzyme could hydrolyze starch to form maltose as the major product. With the aid of pullulanase, it hydrolyzed starch to form maltose with a conversion efficiency up to 78.28%.

β-amylase; expression; enzymatic properties; maltose

10.7506/spkx1002-6630-201603030

Q814

A

1002-6630（2016）03-0164-06

張蕭蕭, 牛丹丹, 沈微, 等. β-淀粉酶的表達(dá)與酶學(xué)性質(zhì)[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(3): 164-169. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201603030. http://www.spkx.net.cn

ZHANG Xiaoxiao, NIU Dandan, SHEN Wei, et al. Expression and enzymatic properties of β-amylase[J]. Food Science, 2016, 37(3): 164-169. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201603030. http://www.spkx.net.cn

2015-03-11

天津市應(yīng)用基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計(jì)劃（青年基金）項(xiàng)目（14JCQNJC09200）；國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863計(jì)劃）項(xiàng)目（2013AA102101）

張蕭蕭（1989—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)檩p工技術(shù)與工程。E-mail：1058216362@qq.com

*通信作者：牛丹丹（1980—），女，助理研究員，博士，研究方向?yàn)楣I(yè)菌種選育，酶制劑開發(fā)與應(yīng)用。E-mail：ndd2002@126.com