李 楠，趙思俊，王 娟，趙建梅，李玉清，黃秀梅，王君瑋，丁宜寶，劉煥奇*，曲志娜,*

（1.中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東 青島 266032；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東 青島 266109；3.中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081）

肉雞生產(chǎn)鏈中腸炎沙門氏菌耐藥性分析及ERIC-PCR分型

李 楠1,2，趙思俊1，王 娟1，趙建梅1，李玉清1，黃秀梅1，王君瑋1，丁宜寶3，劉煥奇2,*，曲志娜1,*

（1.中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東 青島 266032；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東 青島 266109；3.中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081）

目的：了解肉雞生產(chǎn)鏈中腸炎沙門氏菌耐藥性情況以及各生產(chǎn)環(huán)節(jié)菌株間親緣關(guān)系，為臨床用藥及菌株追蹤溯源提供依據(jù)。方法：采用微量肉湯稀釋法對(duì)171 株腸炎沙門氏菌進(jìn)行13 種抗菌藥物藥敏實(shí)驗(yàn)；采用腸桿菌基因間重復(fù)共有序列-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（enterobacterial repetitive intergenic consensus-polymerase chain reaction，ERIC-PCR）法對(duì)33 株不同生產(chǎn)環(huán)節(jié)耐藥菌株進(jìn)行分子分型；采用SPSS 20.0軟件、Gel-Pro Analyer 4.0和NTSYS pc 2.1軟件進(jìn)行分析。結(jié)果：171 株腸炎沙門氏菌對(duì)13 種藥物耐藥情況不同，其中對(duì)氨芐西林耐藥情況最嚴(yán)重，耐藥率高達(dá)90.06%，對(duì)恩諾沙星、氧氟沙星最為敏感，耐藥率均僅為5.26%；不同環(huán)節(jié)間耐藥性差異極顯著（P＜0.01）；多重耐藥率高達(dá)95.32%，共有26 種耐藥譜型。不同環(huán)節(jié)的33 株腸炎沙門氏菌分為4 種（Ⅰ～Ⅳ）基因型，遺傳相似性在66%～100%，Ⅰ型為優(yōu)勢(shì)基因型；基因型相同的菌株耐藥譜不一定相同，反之，耐藥譜相同的菌株基因型不一定相同。結(jié)論：肉雞生產(chǎn)鏈條中沙門氏菌對(duì)多種抗菌藥物產(chǎn)生耐藥性，且耐藥譜種類繁多；沙門氏菌能夠沿著生產(chǎn)鏈進(jìn)行水平傳播，肉雞場(chǎng)環(huán)節(jié)菌株基因型相對(duì)復(fù)雜，菌株基因型與耐藥表型之間無明顯相關(guān)性。

腸炎沙門氏菌；肉雞；耐藥性；腸桿菌基因間重復(fù)共有序列-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

沙門氏菌是重要的人畜共患病的病原體，是引起細(xì)菌性食物中毒的主要食源性病原菌[1]。目前，沙門氏菌病的預(yù)防和治療主要依靠于抗生素類藥物，但由于抗生素的廣泛使用和濫用，沙門氏菌的耐藥性和耐藥譜不斷變化，并且在長(zhǎng)期進(jìn)化過程中出現(xiàn)了多重耐藥現(xiàn)象，使其耐藥性問題成為世界性的公共衛(wèi)生問題[2-3]。沙門氏菌血清型眾多，其中腸炎沙門氏菌能夠在禽類及其產(chǎn)品中穩(wěn)定傳播，而禽類產(chǎn)品為人類日常生活中最常見的肉類食品類型，相關(guān)報(bào)道表明[4-7]，近年來腸炎沙門氏菌引起的食物中毒病例不斷上升，不僅影響?zhàn)B殖業(yè)的發(fā)展，還威脅人類健康。腸桿菌基因間重復(fù)共有序列-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（enterobacterial repetitive intergenic consensus-polymerase chain reaction，ERIC-PCR）分子分型方法操作簡(jiǎn)單，穩(wěn)定性高，重復(fù)性好，被廣泛應(yīng)用于菌株的基因分型和溯源等領(lǐng)域[8-10]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)山東省某地區(qū)肉雞生產(chǎn)鏈條包括種雞場(chǎng)、孵化場(chǎng)、肉雞場(chǎng)、屠宰場(chǎng)以及市場(chǎng)的腸炎沙門氏菌進(jìn)行了藥物敏感性實(shí)驗(yàn)，以了解該地區(qū)耐藥性情況以及各生產(chǎn)環(huán)節(jié)間耐藥性差異，通過ERIC-PCR分型技術(shù)對(duì)菌株進(jìn)行分子分型，以期為臨床用藥及追蹤溯源提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株

2014年分離自泰安的171 株腸炎沙門氏菌（種雞場(chǎng)31 株、孵化場(chǎng)47 株、肉雞場(chǎng)43 株、屠宰場(chǎng)36株、市場(chǎng)14 株，菌株來自同一批次肉雞的不同生產(chǎn)環(huán)節(jié)）和大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC 25922），由中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心動(dòng)物產(chǎn)品安全監(jiān)測(cè)室提供。

1.2 試劑與儀器

胰蛋白胨大豆肉湯、MH（Mueller-Hinton）肉湯、細(xì)菌瓊脂粉 北京陸橋生物技術(shù)有限公司；GoTaq?Green Master Mix酶、DNA Marker DL2000 日本TaKaRa公司；分光光度計(jì) 上海精科有限責(zé)任公司；比濁儀 英國(guó)Oxoid公司；PCR儀、Gel Doc XR凝膠成像分析儀 美國(guó)Bio-Rad公司；電泳儀 北京六一儀器廠。

1.3 96 孔藥敏板（抗生素）

含有青霉素類（氨芐西林（ampicillin，AM）、奧格門?。╝moxicillin/clavulanic acid，A/C））、頭孢類（頭孢噻呋（ceftiofur，CEF））、氨基糖苷類（慶大霉素（gentamicin，GM）、大觀霉素（spectinomycin，SPT））、四環(huán)素類（四環(huán)素（tetracycline，TE）、多西環(huán)素（doxycycline，DOX））、氯霉素類（氟苯尼考（florfenicol，F(xiàn)FC））、磺胺類（磺胺異噁唑（sulfisoxazole，SF）、新諾明（sulfamethoxazole，SXT））、喹諾酮類（恩諾沙星（enrofloxacin，ENR）、氧氟沙星（ofloxacin，OFL））、粘桿菌素（polymyxin E，CLE）等13 種藥物 天津市金章科技發(fā)展有限公司。

1.4 引物

E R I C-P C R擴(kuò)增引物為E R I C[11]：5’-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3’，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.5 方法

1.5.1 藥物敏感性實(shí)驗(yàn)

按照國(guó)際通用標(biāo)準(zhǔn)方法——微量肉湯稀釋法（minimal inhibitory concentration，MIC）測(cè)定171 株腸炎沙門氏菌對(duì)8 類13 種抗菌藥的最小抑菌濃度。首先從12 mL MH肉湯中吸取100 μL加入藥敏板的空白對(duì)照孔中，再挑取新鮮菌落制備0.5 麥?zhǔn)蠞岫鹊木?，吸?0 μL菌液加入12 mL MH肉湯中混勻，依次加入藥敏板中，每孔100 μL，以大腸桿菌作為質(zhì)控菌株，于37 ℃溫箱中培養(yǎng)16～20 h。在質(zhì)控菌株的最低抑菌濃度符合規(guī)定的前提下進(jìn)行結(jié)果判定，凡細(xì)菌生長(zhǎng)的孔內(nèi)，呈彌散狀混濁或底部有沉淀，無細(xì)菌生長(zhǎng)的孔內(nèi)所含最低抑菌藥物濃度即為最低抑菌濃度。

1.5.2 ERIC-PCR分子分型

不同環(huán)節(jié)耐藥菌株（種雞場(chǎng)Z1～Z7、孵化場(chǎng)F1～F5、肉雞場(chǎng)R1～R8、屠宰場(chǎng)T1～T8、市場(chǎng)S1～S5）共33 株進(jìn)行ERIC-PCR反應(yīng)。DNA模板的制備按煮沸法進(jìn)行，PCR反應(yīng)體系為25 μL，反應(yīng)組分：Go Taq?Green Master Mix 12.5 μL；ERIC引物1 μL；模板DNA 2 μL；無核酸水 9.5 μL。PCR反應(yīng)程序[12]：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，52 ℃退火1 min，72 ℃延伸3 min，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。將擴(kuò)增產(chǎn)物于1.3%的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，電壓100 V電泳30 min，結(jié)束后用凝膠成像系統(tǒng)處理圖像。

1.6 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用SPSS 20.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；采用Gel-Pro Analyzer4.0和NTSYS pc 2.1軟件對(duì)ERIC-PCR結(jié)果進(jìn)行聚類分析[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 藥物敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 耐藥結(jié)果

171 株腸炎沙門氏菌對(duì)13 種藥物耐藥情況不同，其中90.06%的菌株對(duì)AM產(chǎn)生耐藥性，為13 種抗菌藥物中最強(qiáng)。耐SPT的菌株比例為78.95%、SXT為50.88%、CLE為42.69%、CEF為37.43%、SF為35.67%、DOX為33.92%、TE為26.32%、A/C為23.98%、GM為11.70%、FFC為10.53%，對(duì)OFL和ENR比較敏感，耐藥率均為5.26%。

不同生產(chǎn)環(huán)節(jié)菌株對(duì)13 種藥物耐藥情況差異極顯著（P＜0.01），如對(duì)OFL，來自種雞場(chǎng)、孵化場(chǎng)和市場(chǎng)的菌株表現(xiàn)為全敏感，只有肉雞場(chǎng)和屠宰場(chǎng)的菌株對(duì)13 種藥物均產(chǎn)生耐藥性。結(jié)果見表1。

表1 腸炎沙門氏菌耐藥率與比較分析Table1 Resistance rates of Salmonella enteritidis and comparative analysis

2.1.2 多重耐藥結(jié)果

171 株腸炎沙門氏菌中多重耐藥（≥2 種）菌株高達(dá)95.32%（163/171），未出現(xiàn)全耐菌株，6 株菌對(duì)13 種藥物表現(xiàn)為敏感。以2 耐、3 耐、4 耐為主，分別以SPT-AM、 SPT-SXT-AM、CL-SPT-SXT-AM為主導(dǎo)譜型，共有26 種耐藥譜。

不同生產(chǎn)環(huán)節(jié)菌株多重耐藥表現(xiàn)不同，種雞場(chǎng)和孵化場(chǎng)出現(xiàn)了0 耐藥菌株，2 株1 耐菌來自孵化場(chǎng)，而3 株12 耐菌來自肉雞場(chǎng)和屠宰場(chǎng)；來自市場(chǎng)的菌株表現(xiàn)為2 耐、3 耐、4 耐；7 耐以上菌株主要來自種雞場(chǎng)、肉雞場(chǎng)、屠宰場(chǎng)。各生產(chǎn)環(huán)節(jié)分別有11、9、9、13、3 種耐藥譜，各環(huán)節(jié)主導(dǎo)耐藥譜不同，種雞場(chǎng)和屠宰場(chǎng)為SPT-AM，孵化場(chǎng)為CL-SPT-SXT-AM，肉雞場(chǎng)為TE-SPT-DOX-CEF-SF-SXT-AM-A/C，市場(chǎng)為SF-AM。結(jié)果見表2。

表2 不同生產(chǎn)環(huán)節(jié)耐藥譜統(tǒng)計(jì)Table2 Antibiograms of different production chains

2.2 ERIC-PCR分子分型結(jié)果

如圖1所示，來自不同生產(chǎn)環(huán)節(jié)的33 株沙門氏菌分為4 種（Ⅰ～Ⅳ）基因型，遺傳相似性在66%～100%。Ⅰ型為優(yōu)勢(shì)基因型，共有23 株，包括種雞場(chǎng)（Z1、Z2、Z3、Z6、Z7）5 株、孵化場(chǎng)（F1、F2、F4、F5）4 株、肉雞場(chǎng)（R1、R4、R5）3 株、屠宰場(chǎng)（T3、T4、T5、T6、T7、T8）6 株以及市場(chǎng)（S1、S2、S3、S4、S5）5 株。Ⅳ型中只有2 株菌，且均來自肉雞場(chǎng)。

基因型相同的菌株耐藥譜不一定相同，如Ⅰ型中包含了2～11 種藥物的耐藥譜；耐藥譜相同的菌株基因型不一定相同，如F2、F3、F5耐藥譜均為CLE-SPT-SXT-AM-A/C，但F2、F5屬于Ⅰ型，F(xiàn)3屬于Ⅲ型。只有Ⅳ型的兩株菌基因型相同，耐藥譜也相同。

圖1 不同生產(chǎn)環(huán)節(jié)腸炎沙門氏菌遺傳關(guān)系聚類樹狀圖Fig.1 Phylogenetic tree of Salmonella enteritidis in different production chains

3 討 論

腸炎沙門氏菌作為一種食源性病原菌，通過食物鏈直接或間接感染人類，而抗生素藥物在畜牧生產(chǎn)中作為預(yù)防、治療首選藥物而被廣泛使用，耐藥性的出現(xiàn)使其治療和預(yù)防成為獸醫(yī)臨床、人醫(yī)臨床的難點(diǎn)[14-15]。本實(shí)驗(yàn)中各生產(chǎn)環(huán)節(jié)菌株對(duì)氨芐西林的耐藥情況都比較嚴(yán)重，而關(guān)文英等[16]對(duì)河北省食品中沙門氏菌進(jìn)行耐藥性分析，81 株菌對(duì)氨芐西林的耐藥率為16%，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果差異極顯著（P＜0.01），張秀英等[17]對(duì)江西、遼寧、廣東三省養(yǎng)殖場(chǎng)的沙門氏菌進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)氨芐西林總體耐藥率為55.6%，而三省間耐藥率不同，廣東省耐藥最嚴(yán)重，遼寧省表現(xiàn)全敏感，朱冬梅等[18]對(duì)四川屠宰場(chǎng)沙門氏菌的耐藥性研究發(fā)現(xiàn)，分離株對(duì)氨芐西林的耐藥率高達(dá)85.90%，以上研究可以看出沙門氏菌對(duì)某一抗菌藥物的耐藥情況與地域和菌株來源有一定的關(guān)系。從各生產(chǎn)環(huán)節(jié)耐藥率來看，不同生產(chǎn)環(huán)節(jié)的菌株耐藥情況存在差異，肉雞場(chǎng)和屠宰場(chǎng)的菌株耐藥情況比較嚴(yán)重，孵化場(chǎng)和市場(chǎng)的菌株耐藥情況相對(duì)較輕，謝懋英等[19]對(duì)肉雞生產(chǎn)鏈中沙門氏菌的耐藥性研究也發(fā)現(xiàn)了不同環(huán)節(jié)采集樣品分離菌株的耐藥情況表現(xiàn)出差異性。本實(shí)驗(yàn)多重耐藥率高達(dá)95.32%，7 耐以上菌株主要出現(xiàn)在種雞場(chǎng)、肉雞場(chǎng)和屠宰場(chǎng)，不同生產(chǎn)環(huán)節(jié)的主導(dǎo)耐藥譜型也不相同，說明養(yǎng)殖過程抗菌藥物使用所造成的選擇壓力對(duì)耐藥性的產(chǎn)生具有很大的影響；本實(shí)驗(yàn)對(duì)13 種藥物共產(chǎn)生了26 種耐藥譜型，吳云鳳等[20]對(duì)分離自肉雞胴體的沙門氏菌進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)，對(duì)16 種抗菌藥物產(chǎn)生了26 種耐藥譜，郭云昌等[21]對(duì)分離自市場(chǎng)雞肉的沙門氏菌進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)，對(duì)30 種藥物產(chǎn)生了29 種耐藥譜，說明目前沙門氏菌能夠?qū)Χ喾N抗菌藥產(chǎn)生耐藥性，且耐藥譜種類繁多，在生產(chǎn)過程中通過食物鏈的傳遞，可能最終影響人類對(duì)抗生素的敏感性。

本實(shí)驗(yàn)將33 株耐藥性相關(guān)的菌株分為四大類（Ⅰ～Ⅳ），其中Ⅰ型包含了種雞場(chǎng)、孵化場(chǎng)、肉雞場(chǎng)、屠宰場(chǎng)和市場(chǎng)的菌株，說明生產(chǎn)鏈條中相同克隆株能夠沿生產(chǎn)鏈水平傳播，而Ⅱ型包括種雞場(chǎng)、屠宰場(chǎng)，Ⅲ型包括種雞場(chǎng)、孵化場(chǎng)、肉雞場(chǎng)，與Ⅰ類基因型稍微不同，Ⅳ型中菌株均來自肉雞場(chǎng)，而且與其他基因型差異較大，說明生產(chǎn)鏈條中克隆株的來源不同，侯小剛[22]對(duì)四川主要肉品生產(chǎn)鏈中沙門氏菌脈沖場(chǎng)凝膠電泳（pulsed field gel electrophoresis，PFGE）分型，在豬肉和鴨肉生產(chǎn)鏈中也發(fā)現(xiàn)了克隆株水平傳播的現(xiàn)象，而雞肉生產(chǎn)鏈中，譜型差異較大，說明克隆株的來源較為廣泛。陳玲等[23]對(duì)南方地區(qū)食品中沙門氏菌進(jìn)行了血清學(xué)鑒定和ERIC-PCR分子分型，發(fā)現(xiàn)14 株德爾卑沙門氏菌可分為5 種基因型別，均在E9簇之中，而13 株鼠傷寒沙門氏菌可分為5 種基因型別，卻分布在E1、E3、E4、E8之中，同一血清型的菌株基因型可能相同也可能不同，本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)同一血清型可以被分為不同基因型，而Imen等[24]利用ERIC-PCR方法對(duì)45 株沙門氏菌進(jìn)行分型，腸炎沙門氏菌被分為2 種基因型，肯塔基沙門氏菌被分為4 種基因型，而基因型相同的菌株血清型也相同，所以血清型不同基因型是否一定不同有待進(jìn)一步探索。在耐藥表型方面，具有相同基因型的菌株耐藥譜不一定相同，具有相同耐藥譜的菌株基因型也不一定相同，只有Ⅳ型的兩株菌基因型相同，耐藥譜也相同，說明耐藥表型與基因型沒有明顯的相關(guān)性，Marjo Cado等[25]對(duì)分離采自巴西37 個(gè)農(nóng)場(chǎng)的66 株豬源鼠傷寒沙門氏菌進(jìn)行PFGE分型，鑒定出12 個(gè)譜型，其中具有不同的耐藥表型39 株菌株分屬于同一PFGE譜型，雖然分型方法不同，但分型結(jié)果也表明基因型與耐藥表型之間沒有直接的相關(guān)性。

綜上所述，腸炎沙門氏菌在肉雞生產(chǎn)鏈中能夠水平傳播且耐藥性問題嚴(yán)重，但各生產(chǎn)環(huán)節(jié)間耐藥程度不同，參考環(huán)節(jié)間差異可以指導(dǎo)臨床治療、預(yù)防用藥。通過ERIC-PCR分子分型可以對(duì)腸炎沙門氏菌進(jìn)行追蹤溯源，且具有簡(jiǎn)便、高效低成本的優(yōu)點(diǎn)，在流行病學(xué)調(diào)查方面具有重要價(jià)值。

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Resistance and ERIC-PCR Genotyping of Salmonella enteritidis in Broiler Production Chain

LI Nan1,2, ZHAO Sijun1, WANG Juan1, ZHAO Jianmei1, LI Yuqing1, HUANG Xiumei1, WANG Junwei1, DING Yibao3, LIU Huanqi2,*, QU Zhina1,*
(1. China Animal Health and Epidemiology Center, Qingdao 266032, China; 2. School of Animal Science and Technology, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, China; 3. China Institute of Veterinary Drug Control, Beijing 100081, China)

Objective: To investigate the antimicrobial resistance and genetic relationship of Salmonella enteritidis in the production chain of broiler, and to provide the basis for clinical treatment and strain traceability. Methods: The susceptibility of 171 Salmonella enteritidis to 13 antimicrobial agents was analyzed by micro-dilution method. The molecular types of 33 strains from different production links associated with resistance were analyzed by ERIC-PCR. The data were analyzed by SPSS 20.0 software, Gel-Pro analyzer 4.0 and NTSYS pc 2.1 software. Results: The resistance degrees of 171 Salmonella enteritidis to 13 antimicrobial agents were different. The resistance rate of these strains to ampicillin was the highest and up to 90.06%, and the resistance rate to ofloxacin was the most sensitive and only 5.26%. The resistance rates of different links were significantly different (P < 0.01). The multidrug resistance rate was 95.32%, and there were 26 kinds of anti-biograms. Totally 33 Salmonella enteritidis were divided into 4 (I–IV) different genotypes, and the genetic similarity was 66%–100%, and type I was the dominant genotype. Anti-biograms between the same genotype were also different; conversely, the genotypes between the same antibiogram were different. Conclusion: The Salmonella enteritidis in broiler production chain could generate resistance to many antimicrobial agents, generating many kinds of antibiograms. The Salmonella enteritidis could be spread horizontally along the production chain. The genotypes of broiler farm were relatively complex. There was no significant correlation between genotype and resistant phenotype.

Salmonella enteritidis; broiler; antimicrobial resistance; enterobacterial repetitive intergenic consensuspolymerase chain reaction

10.7506/spkx1002-6630-201603023

S859.7

A

1002-6630（2016）03-0120-05

李楠, 趙思俊, 王娟, 等. 肉雞生產(chǎn)鏈中腸炎沙門氏菌耐藥性分析及ERIC-PCR分型[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(3): 120-124. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201603023. http://www.spkx.net.cn

LI Nan, ZHAO Sijun, WANG Juan, et al. Resistance and ERIC-PCR genotyping of Salmonella enteritidis in broiler production chain[J]. Food Science, 2016, 37(3): 120-124. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201603023. http://www.spkx.net.cn

2015-03-16

“十二五”科技基礎(chǔ)性工作專項(xiàng)（2012FY111000）；農(nóng)業(yè)部“引進(jìn)國(guó)際先進(jìn)科學(xué)技術(shù)”重點(diǎn)項(xiàng)目“獸藥監(jiān)管技術(shù)引進(jìn)項(xiàng)目”（2011-G14）

李楠（1988—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)楂F醫(yī)臨床。E-mail：linan5m@126.com

*通信作者：劉煥奇（1970—），男，教授，博士，研究方向?yàn)楂F醫(yī)臨床。E-mail：huanqiliu@126.com曲志娜（1970—），女，研究員，碩士，研究方向?yàn)閯?dòng)物源性食品安全監(jiān)測(cè)與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。E-mail：641117207@qq.com