張耀雷，黃立新,*，張彩虹,2，謝普軍，張 瓊，丁莎莎

（1.中國林業(yè)科學(xué)研究院林產(chǎn)化學(xué)工業(yè)研究所，生物質(zhì)化學(xué)利用國家工程實驗室，國家林業(yè)局林產(chǎn)化學(xué)工程重點開放性實驗室，江蘇省生物質(zhì)能源與材料重點實驗室，江蘇 南京 210042；2.中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)新技術(shù)研究 所，北京 100091）

壺瓶棗多糖的純化及結(jié)構(gòu)初步分析

張耀雷1，黃立新1,*，張彩虹1,2，謝普軍1，張 瓊1，丁莎莎1

（1.中國林業(yè)科學(xué)研究院林產(chǎn)化學(xué)工業(yè)研究所，生物質(zhì)化學(xué)利用國家工程實驗室，國家林業(yè)局林產(chǎn)化學(xué)工程重點開放性實驗室，江蘇省生物質(zhì)能源與材料重點實驗室，江蘇 南京 210042；2.中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)新技術(shù)研究 所，北京 100091）

采用Sepharose CL-6B凝膠柱純化壺瓶棗多糖（polysaccharides from Zizyphus jujube Mill. cv. Hupingzao，簡稱ZJP）ZJP-2和ZJP-5組分，并對純化后多糖的結(jié)構(gòu)進行分析。結(jié)果表明：經(jīng)純化后得到ZJP-2b和ZJP-5a兩種組分均一的壺瓶棗活性多糖，分子質(zhì)量分別為89.21、61.60 kD，均具備多糖的特征吸收峰，且均以β-構(gòu)型的吡喃糖為主；ZJP-2b中單糖組成主要為鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖，其物質(zhì)的量比為32.4∶9.5∶9.4∶14.7∶9.7，而ZJP-5a中單糖組成主要為鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖和半乳糖，其物質(zhì)的量比為20.2∶42.9∶2.2∶7.5∶14.5；當(dāng)質(zhì)量濃度為3.5 mg/mL時，ZJP-2b和ZJP-5a的羥自由基清除率分別為30.51%和57.22%。

壺瓶棗；活性多糖；純化；結(jié)構(gòu)

壺瓶棗（Zizyphus jujube Mill. cv. Hupingzao）是鼠李科棗屬植物棗樹的果實，為中國十大名棗之一，主要產(chǎn)自山西太谷等地，有2 000多年的栽培歷史，產(chǎn)量較高，是一種較好的提取紅棗多糖的原料[1]。多糖是紅棗中重要的生物活性物質(zhì)[2]，具有抗腫瘤、降血脂、抗衰老、抗病毒、抗?jié)兊榷喾N生理活性[3]，近年來，隨著研究的深入，研究人員發(fā)現(xiàn)紅棗多糖能顯著刺激小鼠脾臟細胞增殖[4]，增強兔腸中抗氧化酶的活性[5]，其中金絲小棗多糖可以增強小鼠胸腺和脾臟的功能指數(shù)，擁有潛在的抗補體活性[6]。隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展和生活水平的提高，人們對藥品、保健品向綠色型、環(huán)保型發(fā)展的要求越來越高，因此，紅棗多糖的提取開發(fā)具有廣闊的市場和應(yīng)用前景。然而，經(jīng)提取、分離步驟得到的壺瓶棗多糖理化性質(zhì)不同，僅存在部分活性多糖[7]，因此需將其分級純化并通過活性分析篩選出活性多糖。目前采用的分級純化方法主要是柱層析法，其中固定相包括二乙氨基乙基（diethylaminoethyl，DEAE）-纖維素、瓊脂糖凝膠、葡聚糖等[8]，經(jīng)過純化后常采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法、高壓電泳法及比旋度法等鑒定多糖純度[9]。

本實驗采用Sepharose CL-6B凝膠柱純化壺瓶棗多糖（polysaccharides from Zizyphus jujube Mill. cv. Hupingzao，簡稱ZJP）ZJP-2和ZJP-5組分，HPLC法鑒定其純度及分子質(zhì)量，并對其單糖組成與官能團結(jié)構(gòu)進行研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

壺瓶棗多糖ZJP-2和ZJP-5組分，實驗室自制[10]，經(jīng)過D900型大孔吸附樹脂層析柱和DEAE-52纖維素層析柱純化，并經(jīng)抗氧化活性篩選而得到。

MD44透析袋（Mw3 500） Biosharp生物科技有限公司；Sepharose CL-6B 瑞典Pharmacia公司；不同分子質(zhì)量葡聚糖標準品 阿拉?。ㄉ虾＃┯邢薰荆黄咸烟?、苯酚、乙酸酐、吡啶和鹽酸羥胺均為分析純 南京化學(xué)試劑廠；牛血清白蛋白、考馬斯亮藍G-250 美國Sigma公司；水楊酸 國藥集團化學(xué)試劑有限公司；VC西安沃爾森生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Wizard2.0型真空冷凍干燥機 美國VirTis公司；CPA225D型分析天平 賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；SHZ-D（III）型循環(huán)水式真空泵、RE-5299型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海東璽制冷儀器有限公司；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市榮華儀器制造有限公司；UV-2102PC型紫外-可見分光光度儀 上海尤尼科光譜設(shè)備有限公司；LC-20AB型HPLC儀、SIL-20A型自動進樣器、RID-10A型示差折光檢測器、CTO-20A型柱溫箱 日本島津公司；MAGNA-IR550型紅外光譜儀 美國Thermo Electron公司；7890A型氣相色譜儀 美國安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 蛋白質(zhì)含量的測定

以牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）為標準品，蛋白質(zhì)含量測定采用考馬斯亮藍法[11]，標準曲線方程為ρ=0.123 2A－0.006 5（R2=0.993 0）（其中ρ為溶液中蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度/（mg/mL）；A為樣品在595 nm波長處的吸光度；線性范圍為0～0.1/（mg/mL））。圖1為壺瓶棗多糖的全波長掃描圖，在280 nm波長處存在蛋白質(zhì)的特征吸收峰[12]，故在280 nm波長處測定吸光度，用以跟蹤檢測蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度。

圖1 多糖溶液的紫外-可見光吸收光譜Fig.1 Ultraviolet-visible absorption curve of the polysaccharide solution

1.3.2 多糖質(zhì)量濃度的測定

以葡萄糖為標準品，壺瓶棗多糖含量的測定及采用苯酚-硫酸法[13]，標準曲線方程為：ρ= 0.066 6A－0.000 3（R2=0.999 0）（其中ρ為溶液中多糖質(zhì)量濃度/（mg/mL）；A為樣品在490 nm波長處的吸光度；線性范圍為0～0.15 mg/mL）。

1.3.3 壺瓶棗多糖ZJP-2和ZJP-5組分的分級純化

將已經(jīng)過前期純化的壺瓶棗多糖組分（ZJP-2和ZJP-5）分別經(jīng)Sepharose CL-6B凝膠柱（15 mm×800 mm，45～165 μm）進一步純化，用去離子水和0～1.0 mol/L的NaCl溶液以0.45 mL/min的流速洗脫，每6 mL體積隔管檢測，作洗脫曲線，收集不同組分，濃縮后透析48 h。

1.3.4 壺瓶棗多糖純度及分子質(zhì)量測定

分別將分子質(zhì)量為4.32、12.60、60.60、110.00、289.00 kD的葡聚糖配制成2 mg/mL溶液，分別進樣，記錄保留時間t，并以t為橫坐標、分子質(zhì)量為縱坐標繪制標準曲線，得保留時間和分子質(zhì)量的回歸方程為Mw=454.12－45.33t（R2=0.989）。將純化后壺瓶棗多糖ZJP-2和ZJP-5組分按1.3.3節(jié)進樣洗脫，若出現(xiàn)多個峰說明純化效果較差，需進一步純化；若為單一峰則說明純化效果較好，多糖為單一組分[14]，并根據(jù)所得保留時間，通過回歸方程計算其分子質(zhì)量。

液相色譜條件[15]：色譜柱：Waters UltrahydrogelTMLinear（7.8 mm×300 mm，混合顆粒），保護柱：Waters Ultrahydrogel Guard Column（6 mm×40 mm，6 μm），進樣量為20 μL，流動相為0.1 mol/L NaNO3溶液，流速為1 mL/min，柱溫為45 ℃。

1.3.5 壺瓶棗多糖羥自由基（?OH）清除率測定

取1 mg/mL純化后多糖溶液、9 mmol/L FeSO4溶液、9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液、8.8 mmol/L H2O2溶液各1 mL，在37 ℃條件下水浴30 min，于510 nm波長處測定吸光度A1；用蒸餾水代替壺瓶棗多糖溶液在上述條件下測定吸光度A0；1 mL壺瓶棗多糖溶液與3 mL蒸餾水混合，于510 nm波長處測定吸光度A2。按下式計算壺瓶棗多糖對?OH的清除率，以VC作為對照[16]。

1.3.6 紅外光譜掃描

將純化后不同組分壺瓶棗多糖凍干后，準確稱取不同組分多糖2 mg，分別與200 mg KBr干燥粉末混勻，研磨后經(jīng)壓片機壓片，在紅外光譜儀上掃描4 000～400 cm－1之間的紅外光譜。

1.3.7 單糖組成分析

稱取凍干后壺瓶棗活性多糖5 mg分別溶于20 mL質(zhì)量分數(shù)為3%的硫酸溶液中，于100 ℃條件下酸水解4 h。冷卻后用BaCO3完全中和，離心后取上清液即為水解液。將水解液移入于圓底燒瓶中，65 ℃真空烘干，依次加入鹽酸羥胺10 mg、吡啶0.5 mL，振蕩后90 ℃水浴30 min，取出后冷卻至室溫，加入醋酸酐0.6 mL于90 ℃水浴?；?0 min，得到產(chǎn)物直接進行氣相色譜（gas chromatography，GC）分析[17]。分別稱取葡萄糖、鼠李糖、甘露糖、木糖、半乳糖和阿拉伯糖標準品3.0 mg于帶塞試管中按上述步驟酰化，得到的產(chǎn)物直接進行GC分析。

GC分析條件[18]：Agilent HP-5氣相色譜柱（30 m×320 μm，0.25 μm），氣化室溫度250 ℃，檢測器溫度280 ℃，程序升溫：180 ℃以1.5 ℃/min升溫至220 ℃，保持1 min，再以5 ℃/min升溫至 250 ℃，保持3 min，檢測器：火焰離子檢測器，N2流速為24 mL/min，H2流速為60 mL/min，空氣流速為350 mL/min，吹掃流量為3.0 mL/min，色譜柱流量為1 mL/min。

2 結(jié)果與分析

2.1 壺瓶棗多糖ZJP-2和ZJP-5組分的分級純化結(jié)果

采用Sepharose CL-6B凝膠柱對壺瓶棗多糖ZJP-2和ZJP-5組分進行分級純化，洗脫曲線如圖2所示。各個組分洗脫峰狹窄對稱，說明分離效果較好，且兩種多糖分別可以得到主要組分ZJP-2b和ZJP-5a，考馬斯亮藍法檢測結(jié)果表明無蛋白質(zhì)存在，且多糖溶液在280 nm波長處無吸收，由此可判斷壺瓶棗多糖ZJP-2和ZJP-5組分中無蛋白質(zhì)存在。

圖2 ZJP-2（A）、ZJP-5（B）的Sepharose CL-6B凝膠柱洗脫曲線Fig.2 Elution curves of ZJP-2 (A) and ZJP-5 (B) on Sepharose CL-6B column

2.2 壺瓶棗多糖ZJP-2b和ZJP-5a組分的?OH清除能力

圖3 ZJP-2b、ZJP-5a的·OH清除能力Fig.3 Hydroxyl free radical scavenging capacities of ZJP-2b and ZJP-5a

由圖3可知，壺瓶棗多糖ZJP-2b和ZJP-5a組分對?OH均具備較強的清除能力，清除能力的強弱與壺瓶棗多糖的質(zhì)量濃度成正相關(guān)，質(zhì)量濃度越高，壺瓶棗多糖ZJP-2b和ZJP-5a組分對?OH的清除能力就越強；相同質(zhì)量濃度下，壺瓶棗多糖ZJP-2b和ZJP-5a組分的?OH清除能力弱于VC，ZJP-5a的?OH清除能力強于ZJP-2b，當(dāng)ZJP-2b和ZJP-5a質(zhì)量濃度為3.5 mg/mL時，其?OH清除率分別為30.51%和57.22%。

2.3 壺瓶棗多糖ZJP-2b和ZJP-5a組分的純度及分子質(zhì)量

圖4 ZJP-2b（A）、ZJP-5a（B）的HPLC圖Fig.4 HPLC patterns of ZJP-2b (A) and ZJP-5a (B)

HPLC技術(shù)是依據(jù)分子質(zhì)量不同而對物質(zhì)進行分離，其分辨率遠高于常壓層析柱，避免了由于分辨率低而造成高純度假象[19]。如圖4所示，ZJP-2b和ZJP-5a的HPLC圖均呈現(xiàn)出單一峰，說明純化效果較好，且ZJP-2b和ZJP-5a的分子質(zhì)量分別為89.21、61.60 kD。

2.4 壺瓶棗多糖ZJP-2b和ZJP-5a組分的紅外光譜分析

圖5 ZJP-2b（A）、ZJP-5a（B）的紅外光譜Fig.5 Infrared spectra of ZJP-2b (A) and ZJP-5a (B)

對干燥后壺瓶棗多糖ZJP-2b和ZJP-5a組分進行紅外光譜分析，由圖5A可知，ZJP-2b在3 299 cm–1處有寬而強的吸收峰，這是—OH伸縮振動峰，在2 907cm–1處有較弱的吸收峰，為—CH伸縮振動吸收峰，這兩組峰為多糖的特征吸收峰[20]；在1 636cm–1處有較弱吸收峰，為多糖分子中羰基的吸收峰[21]；在1 150～1 000 cm–1范圍內(nèi)有3 個吸收峰，為吡喃糖中醚鍵C—O—C振動產(chǎn)生的吸收峰[22]，說明ZJP-2b中存在吡喃型單糖；在915 cm–1處有較弱吸收峰，說明ZJP-2b中糖苷鍵主要以β-構(gòu)型為主[23]。

由圖5B可知，ZJP-5a在3 324 cm–1處有寬而強的吸收峰，這是—OH伸縮振動峰，在2 910 cm–1處有較弱的吸收峰，為—CH伸縮振動吸收峰，這兩組峰為多糖的特征吸收峰；在1 638 cm–1處有較弱吸收峰，為少量羰基的吸收峰。在1 150～1 000 cm–1范圍內(nèi)有3 個吸收峰，為吡喃糖中醚鍵C—O—C振動產(chǎn)生的吸收峰，說明ZJP-5a中存在吡喃型單糖。在915 cm–1處有較弱吸收峰，說明ZJP-5a中糖苷鍵主要以β-構(gòu)型為主。

2.5 壺瓶棗多糖ZJP-2b和ZJP-5a組分的單糖組成分析

對鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖6 種單糖標準品及壺瓶棗多糖ZJP-2b和ZJP-5a組分進行GC分析，結(jié)果見圖6。ZJP-2b中單糖組成主要為鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖，其物質(zhì)的量比為32.4∶9.5∶9.4∶14.7∶9.7，主要成分為鼠李糖；ZJP-5a中單糖組成主要為鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖和半乳糖，其物質(zhì)的量比為20.2∶42.9∶2.2∶7.5∶14.5，主要成分為阿拉伯糖。

圖6 單糖標準品（A）、ZJP-2b（B）、ZJP-5a（C）的氣相色譜圖Fig.6 Gas chromatograms of monosaccharide standards (A), ZJP-2b (B) and ZJP-5a (C)

3 結(jié) 論

采用Sepharose CL-6B凝膠柱純化壺瓶棗多糖ZJP-2和ZJP-5組分，得到ZJP-2b和ZJP-5a兩種無蛋白質(zhì)存在的壺瓶棗多糖組分；當(dāng)質(zhì)量濃度為3.5 mg/mL時，ZJP-2b和ZJP-5a的?OH清除率分別為30.51%和57.22%，均具備較強的抗氧化活性；HPLC分析表明，ZJP-2b和ZJP-5a均為單一組分，分子質(zhì)量分別為89.21、61.60 kD。

紅外光譜分析表明，ZJP-2b和ZJP-5a均具備多糖的特征吸收峰，且均以β-構(gòu)型的吡喃糖為主；氣相色譜分析表明，ZJP-2b中單糖組成主要為鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖，其物質(zhì)的量比為32.4∶9.5∶9.4∶14.7∶9.7，而ZJP-5a中單糖組成主要為鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖和半乳糖，其物質(zhì)的量比為20.2∶42.9∶2.2∶7.5∶14.5。

壺瓶棗活性多糖ZJP-2b和ZJP-5a的分子質(zhì)量、活性及單糖組成與金絲小棗多糖[24]、陜北灘棗多糖[25]等均不同，說明品種對紅棗多糖的影響較大，有必要按照不同品種對紅棗多糖進行分類研究。

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Purification and Structural Analysis of Polysaccharides from Fruits of Zizyphus jujube Mill. cv. Hupingzao

ZHANG Yaolei1, HUANG Lixin1,*, ZHANG Caihong1,2, XIE Pujun1, ZHANG Qiong1, DING Shasha1
(1. Jiangsu Province Key Laboratory of Biomass Energy and Material, Key and Open Laboratory of Forest Chemical Engineering, State Forestry Administration, National Engineering Laboratory for Bio mass Chemical Utilization, Institute of Chemical Industry of Forest Products, Chinese Academy of Forestry, Nanjing 210042, China; 2. Research Institute of Forestry New Technology, Chinese Academy of Forestry, Beijing 100091, China)

The polysaccharides (ZJP-2 and ZJP-5) from the fruits of Zizyphus jujube Mill. cv. Hupingzao were purifi ed by Sepharose CL-6B column chromatography, and the structures of the purifi ed active polysaccharides were studied in this investigation. The purified polysaccharides (ZJP-2b and ZJP-5a) were homogeneous, and their molecular weights were 89.21 and 61.60 kD, respectively. IR spectral analysis showed that ZJP-2b and ZJP-5a had the characteristic absorption peaks of polysaccharide, and the main structure was β-pyranose for both polysaccharides. The polysaccharide ZJP-2b was composed of rhamnose, arabinose, mannose, glucose and galactose with a molar ratio of 32.4:9.5:9.4:14.7:9.7, and ZJP-5a was composed by rhamnose, arabinose, xylose, mannose and galactose with a molar ratio of 20.2:42.9:2.2:7.5:14.5. At the concentration of 3.5 mg/mL, hydroxyl radical scavenging rates of ZJP-2b and ZJP-5a were 30.51% and 57.22%, respectively. Key words: Zizyphus jujube Mill. cv. Hupingzao; active polysaccharides; purifi cation; structure

10.7506/spkx1002-6630-201603007

TQ929.2

A

1002-6630（2016）03-0033-05

張耀雷, 黃立新, 張彩虹, 等. 壺瓶棗多糖的純化及結(jié)構(gòu)初步分析[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(3): 33-37. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201603007. http://www.spkx.net.cn

ZHANG Yaolei, HUANG Lixin, ZHANG Caihong, et al. Purification and structural analysis of polysaccharides from fruits of Zizyphus jujube Mill. cv. Hupingzao[J]. Food Science, 2016, 37(3): 33-37. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201603007. http://www.spkx.net.cn

2015-04-26

國家林業(yè)局948技術(shù)引進項目（2012-4-12）；中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)新技術(shù)研究所基本科研業(yè)務(wù)費專項資金項目（CAFINT2013C04）

張耀雷（1989—），男，碩士研究生，主要從事農(nóng)林產(chǎn)品深加工研究。E-mail：yaolei_zhang@163.com

*通信作者：黃立新（1967—），男，研究員，博士，主要從事天然產(chǎn)物提取分離純化及新型干燥技術(shù)研究。

E-mail：l_x_huang@163.com