阿布都艾尼·熱吾提，繆曉剛，王利，瓦熱斯江·尼亞孜，孫俊剛，袁宏

(新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院骨科中心關(guān)節(jié)外科，新疆 烏魯木齊　830001)

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實驗研究

微小RNA-136在骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展中的作用及分子機制探究

阿布都艾尼·熱吾提，繆曉剛，王利，瓦熱斯江·尼亞孜，孫俊剛，袁宏*

(新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院骨科中心關(guān)節(jié)外科，新疆 烏魯木齊830001)

目的檢測微小RNA-136(miR-136)在骨關(guān)節(jié)炎軟骨中的表達，探究其對關(guān)節(jié)軟骨細胞的作用并闡明其分子機制。方法收集36 例原發(fā)性膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎軟骨組織及36 例外傷性截肢后的膝關(guān)節(jié)軟骨組織，采用熒光定量PCR檢測軟骨組織中miR-136的表達情況。瞬時轉(zhuǎn)染miR-136模擬物至軟骨細胞，并觀察其對軟骨細胞增殖及凋亡能力的影響。采用生物信息學預測miR-136靶基因，并通過雙熒光素酶試驗予以驗證。結(jié)果miR-136在骨關(guān)節(jié)炎軟骨組織的表達量明顯低于正常軟骨組織(P=0.02)。過表達miR-136可顯著抑制軟骨細胞的增殖能力，增加半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(cysteinyl aspartate specific proteinase，CASP3)及Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associatal x protein，BAX)的表達，并降低B細胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell CLL/Lymphone-2，BCL-2)蛋白的表達。BCL-2是miR-136的靶基因，miR-136可與BCL-2mRNA的3′-非編碼區(qū)結(jié)合并抑制其翻譯。結(jié)論miR-136在骨關(guān)節(jié)炎軟骨組織中呈現(xiàn)低表達，過表達miR-136可顯著抑制軟骨細胞的增殖并增加其凋亡；BCL-2是miR-136的下游直接靶基因，miR-136可能通過調(diào)控BCL-2參與骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展過程。

miR-136；骨關(guān)節(jié)炎；軟骨細胞；增殖；凋亡；BCL-2

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是最常見的一種退行性關(guān)節(jié)疾病，又稱骨關(guān)節(jié)病、退行性關(guān)節(jié)炎[1]。骨關(guān)節(jié)炎病情進展與年齡相關(guān)，對中老年人群的日常工作和生活質(zhì)量產(chǎn)生嚴重的影響，是老年人致畸致殘的重要原因。微小RNA分子(microRNAs或miRNAs)是一類長度約為21-25核苷酸的小型非編碼RNA分子[2-3]。miRNAs通過堿基互補配對方式與靶基因的3′非翻譯區(qū)(3′-ntranslated region，3′-UTR)結(jié)合，進而調(diào)控編碼基因的表達[3-4]。大量研究表明，miRNAs可廣泛參與腫瘤形成、免疫性疾病及內(nèi)分泌疾病等幾乎所有疾病的病理過程[5-6]。最近研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs與OA的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，miRNAs可能成為OA新的診斷標志物和分子治療靶點[7]。

miR-136屬于miRNA家族的成員之一。研究發(fā)現(xiàn)，miR-136在非小細胞癌高表達，并與腫瘤的惡性程度及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[8]。miR-136通過下調(diào)通道蛋白Smad2和Smad3抑制肺腺癌細胞的轉(zhuǎn)移與侵襲[9]。miR-136通過下調(diào)星形膠質(zhì)細胞、上調(diào)基因-1抑制膠質(zhì)瘤細胞的凋亡[10]。目前關(guān)于miR-136在OA的研究尚未見相關(guān)文獻報道，本研究旨在分析miR-136在OA中的表達及功能，并初步探究其分子生物學機制，為OA的預防與治療提供新的思路。

1　資料與方法

1.1實驗儀器和試劑普通PCR儀購自美國BIO-RAD公司，LightCycler480熒光定量PCR儀購自瑞士Roche公司。總RNA提取試劑Trizol及SYBR premix Ex TaqTM Ⅱ PCR Kit購自日本Takara公司，蛋白裂解液RIPA及l(fā)ipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Life technology公司，雙熒光素酶檢測試劑盒購自美國Promega公司。miR-136模擬物(mimics)(5′-UGAUGGAUUCUUAUGCUCCAUCA-3′)及陰性對照(mimics control)(5′-GUCCCACUUCGACCGUGCUUCCA-3′)購自蘇州吉馬公司，DMEM培養(yǎng)基+胎牛血清+Opti-MEM均購自美國Gibco公司，兔抗人BCL-2單抗(ab32124)，BAX單抗(ab32503)，CASP3單抗(ab32351)及內(nèi)參GAPDH抗體(ab181602)均購自美國Abcam公司。

1.2臨床資料本實驗所用36 例人原發(fā)性膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎軟骨組織及36 例外傷性截肢后的膝關(guān)節(jié)軟骨組織為2009年1月至2014年6月于新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院骨科中心收集，所用標本均經(jīng)過新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，并獲得全部患者知情同意。36 例原發(fā)性膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎患者其中男22 例，女14 例，平均年齡52 歲(38～73 歲)；36 例外傷性截肢患者其中男26 例，女10 例，平均年齡43 歲(25～57 歲)。

1.3總RNA提取及熒光定量PCR試驗按照Trizol說明書提取各樣本總RNA，并進行逆轉(zhuǎn)錄試驗合成cDNA。熒光定量PCR反應按照SYBR premix Ex TaqTM Ⅱ PCR Kit試劑盒說明書，以合成的cDNA作為模版在Roche LightCycler 480Ⅱ熒光定量PCR儀上進行。反應總體系為：模版cDNA 1μL，miR-136特異性引物0.4μL，2×SYBR premix Ex TaqTM Ⅱ PCR 8μL，10×miScript Universal Primer 1μL，miR-136上游引物序列為5′-AGGTAGTAGTTTTGTTTACCTCA-3′，下游引物序列為通用引物；以U6為作為內(nèi)參，U6上游引物序列為5′-CCATGCTCTTCTACTCCT-3′，下游引物序列為5′-CACTGATGTCGGTTAGTT-3′，最后加RNase-free water補充反應總體積為20μL。熒光定量PCR反應條件為：95℃ 20 min，隨后95℃ 10 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共45個循環(huán)。以實驗所用內(nèi)參U6作為標準化對照，采用ΔΔCT分析方法分析熒光定量PCR儀所得數(shù)據(jù)[11]。

1.4細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染實驗所用軟骨細胞購自中科院上海細胞庫。采用DMEM培養(yǎng)基+10% FBS進行培養(yǎng)，細胞培養(yǎng)條件為37℃，5% CO2。采用Lipofetamine 2000轉(zhuǎn)染試劑進行細胞轉(zhuǎn)染。實驗均分為2組，其中試驗組轉(zhuǎn)染miR-136 mimics，陰性對照組轉(zhuǎn)染mimics control。

1.5細胞增殖試驗將培養(yǎng)好的對數(shù)期生長的軟骨細胞使用96孔板進行細胞鋪板，每孔細胞數(shù)約為4 500個，采用lipofectamine 2000按上述分組進行細胞轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染細胞每孔連續(xù)4 d每天加入16 μL MTT(5 g/L，Sigma-Aldrich)并室溫孵育4 h后去上清，之后每孔加入130 μL二甲亞砜孵育15 min予以充分溶解。測定各孔450 nm波長時的吸光度，并繪制生長曲線。

1.6蛋白質(zhì)印跡將收集好的軟骨細胞按照蛋白裂解液RIPA試劑說明書提取總蛋白，105℃加熱15 min充分變性，常規(guī)制備12% SDS聚丙烯酰胺凝膠，每孔上樣量15 μL，按照電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，加入抗BCL-2單抗(1︰1 000稀釋)，抗CASP3單抗(1︰2 000稀釋)，抗BAX單抗(1︰1 000稀釋)及內(nèi)參GAPDH抗體(1︰10 000稀釋)，4℃孵育過夜，第2天使用抗兔二抗(1︰10 000稀釋)室溫孵育1 h，TBST洗滌3次，每次5 min。ECL發(fā)光液處理后暗室內(nèi)曝光膠片，于常溫下自然風干，掃描結(jié)果保存。

1.7miR-136靶基因生物信息學預測通過miRanda[12]生物信息學數(shù)據(jù)庫預測并分析miR-136的下游靶基因。

1.8雙熒光素酶報告基因試驗委托蘇州吉馬公司構(gòu)建BCL-2的雙熒光素酶報告

基因載體：以psiCHECK2為基礎載體，psiCHECK2-BCL-2-WT為野生型報告載體，psiCHECK2-BCL-2-MUT為突變型報告載體。將培養(yǎng)好的對數(shù)期生長的軟骨細胞使用24孔板進行鋪板，每孔細胞數(shù)達4×105個，共同轉(zhuǎn)染miR-136 mimics或mimics control與野生型及突變型報告載體至軟骨細胞。24 h后，按照Dual-Luciferase ○R Reporter Assay System試劑盒說明處理，驗證靶基因BCL-2與miR-136結(jié)合位點。

2　結(jié)　　果

2.1miR-136在骨關(guān)節(jié)炎軟骨及正常軟骨組織的表達情況采用熒光定量PCR分析miR-136在原發(fā)性膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎軟骨組織及外傷性截肢后的膝關(guān)節(jié)軟骨組織的表達特征。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以外傷截肢后的膝關(guān)節(jié)軟骨組織中miR-136的表達水平為1，原發(fā)性膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎軟骨組織中miR-136的表達水平為(0.24±0.08)，兩組差異有統(tǒng)計學意義(P=0.02)。

2.2miR-136轉(zhuǎn)染效率檢測按上述實驗分組采用Lipofetamine 2000轉(zhuǎn)染試劑進行細胞轉(zhuǎn)染。48 h后，采用熒光定量PCR比較兩組軟骨細胞中miR-136的表達情況。以mimics control組軟骨細胞中miR-136表達量為1，miR-136 mimics組相對表達量為(128.22±12.45)，兩組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。

2.3miR-136對軟骨細胞增殖能力的影響采用MTT實驗檢測軟骨細胞增殖。結(jié)果如圖1所示：miR-136 mimics組軟骨細胞增殖速度較mimics control組明顯降低(P<0.05)。轉(zhuǎn)染后1、2、3 d細胞生長抑制率[1-(miR-136 mimics/mimics control)×100%]分別為5.24%、7.63%和13.11%(見圖1)。

注：*代表P<0.05

2.4miR-136對軟骨細胞凋亡的影響將培養(yǎng)好的軟骨細

胞使用6孔細胞培養(yǎng)板進行鋪板，并轉(zhuǎn)染miR-136 mimics和mimics control，48 h后抽提蛋白，使用Western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(cystenyl aspartate specific proteinose，CASP3)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associatal x protein，BAX)、B細胞淋巴瘤/白血病-2(B-cal CLL/Lymphone-2，BCL-2)蛋白的表達情況。結(jié)果如圖2所示，過表達miR-136可明顯增加軟骨細胞中CASP3與BAX蛋白的表達，并抑制BCL-2蛋白表達(P<0.05，見圖2)。

圖2　miR-136對軟骨細胞凋亡的影響

2.5miR-136靶基因生物信息學預測利用miRanda數(shù)據(jù)庫分析miR-136的靶標基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BCL-2可能是其靶基因。miR-136與BCL-2 mRNA 3′-UTR結(jié)合區(qū)域預測結(jié)果見圖3。

圖3　miR-136與BCL-2 mRNA 3′-UTR結(jié)合區(qū)域預測結(jié)果

2.6miR-136靶基因BCL-2雙熒光素酶實驗驗證按照lipofectamine2000說明書，共同轉(zhuǎn)染miR-136 mimics或mimics control與野生型及突變型報告基因載體至軟骨細胞。24 h后利用Promega雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒進行檢測。結(jié)果見圖4，miR-136可與BCL-2 mRNA 3′-UTR預測位點結(jié)合，并降低相對熒光比值；當結(jié)合位點突變后，miR-136結(jié)合能力消失，相對熒光比值恢復正常(見圖4)。

3　討　　論

OA的病因十分復雜，主要由遺傳因素、機體免疫調(diào)控失衡和局部物理因素等長期作用所致，但其確切的發(fā)病機制仍不明確[13]。OA好發(fā)于活動較頻繁或負重關(guān)節(jié)的關(guān)節(jié)，如膝、手部、顳下頜關(guān)節(jié)、髖、踝等，其主要臨床病理特征為受損關(guān)節(jié)的軟骨細胞數(shù)量減少，關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)破壞，關(guān)節(jié)滑膜炎癥反應等，病變涉及軟骨細胞、軟骨下骨以及周圍肌肉韌帶等組織，最終導致關(guān)節(jié)變形及功能障礙[13]。miRNAs是一類非編碼的微小RNA分子，近些年有研究提示miRNAs在基因調(diào)控中的獨特作用，可能成為治療OA新的分子靶點[14]。Araldi等[15]研究發(fā)現(xiàn)miR-140是關(guān)節(jié)軟骨發(fā)育過程中的重要分子，其可通過靶向調(diào)控人血小板反應蛋白解整合素金屬肽酶5(ADAMTS-5)而降低骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病風險。Akhtar等[16]研究證實miR-27b通過抑制基質(zhì)金屬蛋白酶13(MMP-13)的表達進而減緩骨關(guān)節(jié)炎的進程。Yamasaki等[17]報道m(xù)iR-146a在骨關(guān)節(jié)炎軟骨中高表達，干擾miR-146a可明顯抑制軟骨細胞的增殖能力。

注：*代表P<0.05

miR-136定位于人14q 32.2號染色體上，目前已有文獻報道m(xù)iR-136在肺癌、膠質(zhì)瘤、卵巢癌及甲狀腺癌等多種疾病中起到了重要作用[8，18-20]，但在骨關(guān)節(jié)炎中的作用及分子機制仍不明確。本研究發(fā)現(xiàn)miR-136在骨關(guān)節(jié)炎軟骨組織的表達量明顯低于正常軟骨組織。體外細胞增殖和凋亡實驗顯示，過表達miR-136可顯著抑制軟骨細胞的增殖并誘導其凋亡。通過生物信息學分析，我們發(fā)現(xiàn)BCL-2 mRNA 3′-UTR存在miR-136的保守結(jié)合位點。因此，我們推測BCL-2可能為miR-136的靶基因之一。

細胞凋亡(apoptosis)又稱為程序性細胞死亡，是由基因調(diào)控的細胞自主的消亡，該過程涉及一系列基因的激活、失活以及調(diào)控等的作用[21]。越來越多的研究表明，凋亡過程持續(xù)存在于骨關(guān)節(jié)炎病理過程中，軟骨細胞的增殖與凋亡涉及多條信號通路，在骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展中起著十分關(guān)鍵作用[22]。BCL-2是細胞凋亡過程重要的調(diào)控因子[23]。為了進一步驗證BCL-2為miR-136的靶基因，我們構(gòu)建了BCL-2野生型及突變型報告基因載體與miR-136 mimics共轉(zhuǎn)染到軟骨細胞，探討miR-136與BCL-2 mRNA 3′-UTR的靶向結(jié)合作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染miR-136 mimics可導致野生型組相對熒光比值下降，而對突變型組相對熒光比值無影響，提示miR-136可與BCL-2 mRNA 3′-UTR結(jié)合，進而抑制其翻譯。

綜上所述，本研究觀察到miR-136低表達于骨關(guān)節(jié)炎軟骨組織，并初步揭示了miR-136可通過下調(diào)BCL-2抑制軟骨細胞的增殖并誘導凋亡，miR-136有望成為OA診斷新的分子標志物及和治療靶點。

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The Function and Molecular Mechanism of miR-136 in Osteoarthritis

Abuduaini·Rewuti，Miu Xiaogang，Wang Li，etal

(Department of Orthopaedics，People′s Hospital of Xinjiang Uygur Autonomous Region，Urumqi 830001，China)

ObjectiveTo detect the expression of miR-136 in cartilage of osteoarthritis，and investigate the function and molecular mechanism of miR-136 in chondrocyte.Methods36 paired cartilage tissues and matched normal cartilage tissues from traumatic amputees were obtained from knee osteoarthritic of patients.Quantitative RT-PCR was applied to detect the expression level of miR-136 in cartilage tissues.miR-136 mimics was transient transfected in order to explore proliferation and apoptosis of chondrocyte.Bioinformatic analysis and dual luciferase reporter assay were used to predict and verify the target gene of miR-136 in chondrocyte.ResultsThe expression level of miR-136 was significantly lower expressed in cartilage of osteoarthritis compared with normal cartilage tissues(P=0.02).Exogenous over-expression of miR-136 could significantly inhibit chondrocyte proliferation and increased CASP3 and BAX expression，but decreased BCL-2 expression.BCL-2 was the target gene of miR-136 in chondrocyte.miR-136 could repress BCL-2 expression via binding to complimentary sequences in its mRNA 3′-untranslated regions(UTRs).ConclusionmiR-136 is significantly down-regulated in cartilage of osteoarthritis，over-expression of miR-136 can significantly inhibit chondrocyte proliferation and induced apoptosis.BCL-2 is a directly target gene of miR-136 in chondrocyte，miR-136 might involve in the occurrence of osteoarthritis by suppressing BCL-2.

miR-136；osteoarthritis；chondrocyte；proliferation and apoptosis；BCL-2

1008-5572(2016)10-0906-05

R684.3

A

2016-05-31

阿布都艾尼·熱吾提(1982- )，男，主治醫(yī)師，新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院骨科中心關(guān)節(jié)外科，830001。

*本文通訊作者：袁宏