馬丹，孫瑞，權偉，王瑩瑩

（南開大學環(huán)境科學與工程學院，環(huán)境污染過程與基準教育部重點實驗室，天津市城市生態(tài)環(huán)境修復與污染防治重點實驗室，天津300071）

典型超微細菌降解鄰苯二甲酸二丁酯的途徑及水合酶的表達純化研究

馬丹，孫瑞，權偉，王瑩瑩*

（南開大學環(huán)境科學與工程學院，環(huán)境污染過程與基準教育部重點實驗室，天津市城市生態(tài)環(huán)境修復與污染防治重點實驗室，天津300071）

典型超微細菌菌株PAE-UM屬于β-變形菌門叢毛單胞菌屬（Curvibacter sp.），是革蘭氏陰性菌株，可利用DBP作為唯一碳源。利用流式細胞儀檢測細菌生長情況，并采用高效液相色譜測定DBP的濃度，結果顯示該菌對DBP的降解率為94%，菌株最大生長速率為0.237 2 h-1。已經完成了該菌株的全基因組測序，GenBank登錄號為LKCX00000000。通過全基因組數據分析及文獻對比發(fā)現該菌在降解鄰苯二甲酸二丁酯的途徑中，4-oxalomesaconate水合酶（OMH）是原兒茶酸間位裂解代謝途徑中的關鍵酶，具有催化4-oxalomesaconate（OMA）降解為4-carboxy-4-hydroxy-2-oxoadipate（CHA）的能力，該酶是降解鄰苯二甲酸酯過程中的關鍵酶之一，也是芳香化合物降解過程中的重要降解酶。利用蛋白結晶技術及分子生物學手段，對關鍵酶（OMH）進行分子構建，表達、純化、結晶的篩選，應用X-ray衍射技術對關鍵酶的晶體進行衍射，獲得晶體的衍射數據，進行關鍵酶的三維結構解析。Curvibacter sp.PAE-UM菌株中的OMH蛋白在大腸桿菌中得到表達，經多種方法純化后篩選獲得了純度大于95%的蛋白，并經試劑盒篩選獲得高質量的蛋白質晶體。在上海光源同步輻射（SSRF）BL-19U線站收集數據，通過X射線衍射實驗收集到分辨率達到2.00 ?的衍射數據，并使用軟件HKL2000進行了數據處理與修正，該OMH的結構解析為2.00 ?。后續(xù)將通過該關鍵酶的三維結構的解析進一步闡明該菌降解PAEs的分子機理。

超微細菌；鄰苯二甲酸酯；水合酶；X射線衍射；蛋白表達純化

鄰苯二甲酸酯PAEs是一種重要的內分泌干擾素水體環(huán)境污染物［1］。廣泛用于塑料、化妝品、農藥、橡膠制造、噴漆當中的添加劑，該類物質是難于降解的有機物［2-3］。超過60種鄰苯二甲酸酯類化合物被生產和使用。美國環(huán)境保護署（United States Environmental Protection Agency），歐盟和中國國家環(huán)境監(jiān)測中心（The European Union and China National Environmental Monitoring Center）均將其列為首要污染物［4］。鄰苯二甲酸酯類（PAEs）對我國水體污染較嚴重［5-6］，微生物降解是自然環(huán)境中PAEs完全礦化的主要過程，也是修復PAEs污染水體的重要方法［7］。革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌對其降解途徑不同，一般來講開環(huán)酶4，5-雙加氧酶一般存在于革蘭氏陰性菌中，而開環(huán)酶3，4-加氧酶大多數存在于革蘭氏陽性菌中［8-9］。在PAEs的微生物好氧降解過程中，酯鍵的水解是一個共同的起始步驟，PAEs在微生物酯酶作用下水解形成鄰苯二甲酸單酯，進而生成鄰苯二甲酸。研究顯示，革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌通常通過兩條不同途徑降解鄰苯二甲酸，但最終都形成原兒茶酚［10-11］。原兒茶酚是許多芳香族化合物代謝途徑中的重要中間代謝物，經間位或鄰位開環(huán)后形成相應的有機酸。4-oxalomesaconate水合酶（OMH）是原兒茶酸間位裂解途徑中的關鍵酶之一，以4-oxalomesaconate（OMA）為底物，催化其降解為4-carboxy-4-hydroxy-2-oxoadipate（CHA）。2000年Hara等人在Sphingomonaspaucimobilis SYK-6菌株中純化出OMH，由于OMA通常是4-羥基-3-甲氧基苯酸酯和丁香酸的中間代謝產物，在以上兩個代謝途徑中OMH也起到了重要作用，在其研究中并對OMH進行酶活及代謝途徑分析的研究［10］。2007年Li等人從Pseudomonas ochraceae NGJ1菌株中克隆并純化了OMH蛋白，研究了半胱氨酸殘基在該酶催化中的作用，利用了定點突變的方法，將8個單獨的半胱氨酸殘基突變?yōu)榻z氨酸殘基［12］。經過一系列的降解反應形成CHA后，進而轉化成丙酮酸、琥珀酸、草酰乙酸等進入三羧酸循環(huán)，最終轉化為CO2和H2O，完成污染物的降解過程。

雖然PAEs的微生物降解受到了人們的廣泛關注，但在寡營養(yǎng)條件下利用微生物尤其是超微細菌降解PAEs的機理研究還尚無報道。目前，有關超微細菌的研究多數局限于菌株的分離與培養(yǎng)方法。研究者對于這類細菌在污染環(huán)境中的作用還很不了解。超微細菌對污染環(huán)境修復機理的研究還基本處于空白階段。為此，本文針對實驗室前期分離的一株典型超微細菌菌株Curvibacter sp.strain PAE-UM［13］展開其降解鄰苯二甲酸二甲酯途徑，進行關鍵性降解酶的表達純化的初步研究，以期通過蛋白三維結構的研究，揭示超微細菌降解PAEs的分子機理，為利用超微細菌修復鄰苯二甲酸酯污染水體提供實驗依據、奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

鄰苯二甲酸二丁酯（DBP），購自梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司，純度≥98.0%。AKTA純化儀均購買自GE公司；蛋白結晶條件試劑盒購買自Hampton公司；限制性內切酶和T4連接酶購買自Thermo公司；大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)購買自北京全式金生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株生長及DBP檢測

寡營養(yǎng)培養(yǎng)基由依云水過膜（0.22 μm）后巴氏消毒，DBP為唯一碳源，降解初始濃度為4 mg·L-1，接菌量為1×103cells·mL-1。30℃下?lián)u床培養(yǎng)。用流式細胞儀（CyFlow Space）檢測細菌生長情況，每次取樣1 mL，加入10 μL SYBR Green I染料進行染色，振蕩混勻后黑暗染色15 min。檢測時綠色熒光在520（±20）nm處收集；紅色熒光（FL3）在630（±20）nm處收集。所有數據都采用Flowmax軟件進行分析。

采用高效液相色譜（Waters）測定DBP的濃度，色譜柱采用Agilent Eclipse XDB-C8（5 μm×4.6 mm×250 mm），柱溫30℃，流動相配比為乙腈∶水=0.8∶0.2，流速為1.0 mL·min-1，檢測波長為226 nm。利用氣相色譜檢測降解中間產物，樣品經固相萃取后，采用安捷倫Thermo DSQⅡ氣相色譜-質譜聯(lián)用儀。氣相色譜條

件：色譜柱為HP-5（30 m×0.32 mm×0.25 μm）。升溫程序：100℃，保持1 min，以8℃·min-1升至300℃，保持3 min，進樣口溫度：250℃，進樣量：1 μL。

1.2.2 OMH的克隆和表達

使用限制性內切酶EcoRI和XhoI將OMH全長基因從質粒模板上切下，將基因片段通過T4連接酶連入表達載體pET-28a中，將質粒轉化到質粒擴增型的感受態(tài)細胞（trans5）中，進行質粒擴增，然后提取質粒（AXYGEN Plasmid Miniprep Kit質粒提取試劑盒）送公司測序，經測序正確后將質粒轉化到表達型的感受態(tài)細胞BL21（DE3）中，進行蛋白的外源表達。于LB固體培養(yǎng)基（1.5%瓊脂）平板上，挑取單克隆菌落，至5 mL LB液體培養(yǎng)基（卡那霉素濃度為100 mg·L-1），37℃、200 r·min-1，培養(yǎng)10 h。將長勢良好的大腸桿菌轉入1 L含100 mg·L-1卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200 r·min-1，培養(yǎng)至OD 600值達到0.6至0.8。低溫冷卻，加入誘導劑異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）至終濃度為0.5 mmol·L-1。在16℃誘導培養(yǎng)16～18 h，將菌液5 000 r·min-1離心15 min，收集菌體沉淀。

1.2.3 OMH的純化

用Mcac0緩沖液（20 mmol·L-1Tris，0.5 mmol·L-1NaCl，100 mL·L-1甘油，pH 8.5）垂懸收集的菌體后進行超聲破碎裂解細胞，裂解后的菌液在低溫4℃進行高速離心，18 000 r·min-1離心40 min，上清液中包含有目的蛋白。取上清上樣于Mcac0緩沖液預平衡好的Ni-NTA親和層析柱上，掛柱洗脫掉非特異結合的雜蛋白后，將目的蛋白用Elution buffer（20 mmol·L-1Tris，0.5 mmol·L-1NaCl，100 mL·L-1甘油，300 mmol· L-1咪唑，pH 8.5）洗脫。使用低鹽緩沖液A（50 mmol· L-1Tris，pH 8.0）及高鹽緩沖液B（50 mmol·L-1Tris，pH 8.0），配制緩沖液C（20 mmol·L-1Tris，150 mmol·L-1NaCl，pH 8.0），因該蛋白在低鹽緩沖液A條件下產生沉淀，故在親和層析后只過分子篩。將目的蛋白用緩沖液C完全稀釋并濃縮至500 μL以下，在緩沖液C（20 mmol·L-1Tris，150 mmol·L-1NaCl，pH 8.0）的環(huán)境中注入分子篩Supdex200 10/300GL，根據分子大小的不同將目的蛋白與雜質蛋白分離開。根據A280紫外吸收監(jiān)測來收集蛋白樣品，使用SDS-PAGE檢測目的蛋白純度。

1.2.4 OMH晶體的篩選和優(yōu)化

將純化后的目的蛋白濃縮至8 mg·mL-1和15 mg· mL-1，采用坐滴氣相擴散法在20℃恒溫室進行晶體生長條件初篩，嘗試了所有本研究組常用的晶體生長試劑盒（Hampton Research公司的Crystal Screen Kit、Crystal Screen KitⅡ、Index、Salt Rx、PEG/ion1-2和E-merald生物系統(tǒng)公司的WizardⅠ-Ⅳ）。定期用顯微鏡進行觀察，約10 d后發(fā)現晶體，通過優(yōu)化蛋白濃度、晶體生長條件和添加劑等方法，獲得衍射能力好的蛋白質晶體，用于X射線衍射實驗。

1.2.5 OMH蛋白晶體X射線衍射數據的收集和處理

將晶體保存在低溫液氮罐中，送至上海光源同步輻射（SSRF）BL-19U線站收集數據。收集的數據使用HKL2000軟件［14］進行數據的處理。數據處理流程一般為指標化（Index）、積分（Integrate）和歸一化（Scale）。

2 結果與討論

圖1 DBP濃度為4 mg·L-1時菌株的生長及DBP降解情況Figure 1 Bacterial growth curve and DBP degradation

2.1 PAE-UM菌株降解DBP效率及途徑

微生物降解是DBP降解的主要途徑［7］，已有多種可降解鄰苯二甲酸酯的菌株被報道［8，13，15-16］。菌株Curvibacter sp.strain PAE-UM可利用DBP為唯一碳源，對DBP的降解率為94%（圖1）。菌株最大生長速率為0.237 2 h-1。已經完成了該菌株的全基因組測序，GenBank登錄號為LKCX00000000［17］，該菌為β-變形菌門叢毛單胞菌屬（Curvibacter sp.），是革蘭氏陰性菌株，在降解鄰苯二甲酸酯過程中通過鄰苯二甲酸4，5

雙加氧酶的作用氧化鄰苯二甲酸生成順式-4，5-二羥基-4，5-二氫鄰苯二甲酸，然后脫氫生成4，5-二羥基鄰苯二甲酸，后者再通過脫羧生成原兒茶酚。

已經分析出基因組中DBP降解的相關降解酶，并結合文獻［3-4，7］分析出該菌降解DBP的具體途徑（圖2）。在Curvibacter sp.strain PAE-UM菌降解DBP過程中，原兒茶酸間位裂解，經原兒茶酸4，5-雙加氧酶，4-羧基-2-羥粘康酸-6-半醛脫氫酶（CHMS脫氫酶），2-吡喃酮-4，6-二羧酸酯水解酶（PDC水解酶）生成OMA，最終進入TCA循環(huán)，轉化為CO2和H2O。由ligJ基因編碼的OMH具有催化OMA降解為4-carboxy-4-hydroxy-2-oxoadipate（CHA）的能力［18-20］，該酶是降解鄰苯二甲酸酯過程中的關鍵酶之一，也是芳香化合物降解過程中的重要降解酶［21］。本研究針對OMH進行了進一步的晶體學研究。

2.2 OMH的純化

OMH經過Ni-NTA親和層析和凝膠過濾層析后，發(fā)現該蛋白在低鹽緩沖液A條件下產生沉淀，說明該蛋白不耐受低鹽條件，故在親和層析后只過分子篩。經分子篩Superdex200 10/300 GL進行進一步純化，圖3為分子篩純化的A280吸收監(jiān)測，顯示為單一的洗脫峰，說明目的蛋白OMH在溶液狀態(tài)下分子大小均一。用13%SDS-PAGE蛋白膠檢測目的蛋白，得到純度大于95%的OMH蛋白如圖4。

2.3 OMH的晶體X射線衍射和數據處理

經過結晶條件的篩選和優(yōu)化，在0.2 mol·L-1磷酸氫二銨，20%（m/V）聚乙二醇3350的條件下獲得了衍射能力好的蛋白質晶體，如圖5所示。

OMH晶體的X射線衍射實驗在上海光源同步輻射（SSRF）BL-19U的同步輻射光源進行，選擇0.5°的回擺角和1 s的曝光時間進行數據收集，共收集360張衍射圖，如圖6，收集的衍射數據使用HKL2000軟件進行處理，結果如表1所示。

圖2 DBP降解途徑及基因組中對應的降解酶Figure 2 Degradation pathway of DBP and key enzymes involved

在蛋白質結構數據庫（Protein data bank，PDB）中，OMH的蛋白結構以Rhodopseudomonas palustris中N端結構基因目的蛋白Rpr66（PDB ID:2GWG）作為分子置換模型，該模型與OMH氨基酸序列同源率達到80%，后續(xù)將使用PHENIX修正解析OMH的晶體結

構。目前利用結構生物學手段解析PAEs關鍵降解酶的研究并不多，在蛋白結構數據庫（http://www.rcsb. org/pdb）中發(fā)表的OMH的結構解析只有兩個，分別是編號為3IJ6和2GWG蛋白結構，其中3IJ6的結構經X-ray衍射，結構解析為2.00 ?，該水合酶片段來自Lactobacillus acidophilus；2GWG的結構經X-ray衍射，結構解析為1.80 ?，該水合酶片段來自Rhodopseudomonas palustris。本文中超微細菌PAEUM菌株中的OMH的蛋白晶體經X-ray衍射，分辨率為2.00 ?。該分辨率較高，從目前解析的OMH的數量來看，足以見得該酶在結構生物學的解析方面的研究還有待加強。

圖3 OMH經分子篩Superdex200 10/300 GL純化的A280吸收峰Figure 3 A280absorption of gel filtration Superdex200 10/300 GL purification of OMA hydratase

圖4 用13%SDS-PAGE蛋白膠檢測目的蛋白Figure 4 13%SDS-PAGE using to detect the target protein

圖5 OMH的晶體Figure 5 Crystals of native OMH

圖6 OMH晶體衍射圖Figure 6 Crystal diffraction pattern of native OMH

表1 OMH衍射數據統(tǒng)計結果參數Table 1 Diffraction data statistics for native OMH

在寡營養(yǎng)條件下，利用微生物尤其是超微細菌降解PAEs的機理研究還鮮有報道。因此本研究對課題組分離出的PAE-UM菌株進行全基因組測序［17］，通過全基因組數據及文獻分析對比發(fā)現該菌降解PAEs的降解途徑，并對其中關鍵酶利用蛋白結晶技術及分子生物學手段，解析能夠降解污染物菌株中關鍵酶的三維結構，進一步闡明其降解DBP的分子機理及其代

謝途徑，為利用超微細菌修復鄰苯二甲酸酯污染水體提供重要實驗依據，奠定了理論基礎。隨著更多的對野生型和突變體的結構和生化研究，更多的降解酶結構被解析，將會有助于提高降解菌降解污染物的能力。

3 結論

（1）菌株Curvibacter sp.strain PAE-UM可利用DBP為唯一碳源，DBP降解率為94%。

（2）經過全基因組分析，在Curvibacter sp.strain PAE-UM降解DBP過程中OMH催化OMA降解為4-carboxy-4-hydroxy-2-oxoadipate，該酶是DBP降解的關鍵酶之一。

（3）通過結構生物學手段，在大腸桿菌中表達得到OMH蛋白，經多種方法純化后篩選獲得了高質量蛋白質晶體。

（4）OMH的晶體經X-ray衍射、數據收集分析，得到了分辨率為2.00 ?的數據，為進一步解析其結構、闡明其作用機理奠定了基礎。

致謝：

感謝Mark Bartlam教授在晶體衍射數據分析方面的指導。參考文獻：

［1］Teil M J，Tlili K，Blanchard M，et al.Polychlorinated biphenyls，polybrominated diphenyl ethers，and phthalates in roach from the Seine River basin（France）:Impact of densely urbanized areas［J］.Archives of Environmental Contamination and Toxicology，2014，66（1）:41-57.

［2］Magdouli S，Daghrir R，Brar S K，et al.Di 2-ethylhexylphtalate in the aquatic and terrestrial environment，a critical review［J］.Journal of Environmental Management，2013，127（9）:36-49.

［3］Wang J L，Chen L J，Shi H C，et al.Microbial degradation of phthalic acid esters under anaerobic digestion of sludge［J］.Chemosphere，2000，41（8）:1245-1248.

［4］Fang C R，Yao J，Zheng Y G，et al.Dibutyl phthalate degradation by Enterobacter.sp.T5 isolated from municipal solid waste in landfill bioreactor［J］.International Biodeterioration&Biodegradation，2010，64（6）: 442-446.

［5］Zhang J，Liu L，Wang X，et al.Low-Level environmental phthalate exposure associates with urine metabolome alteration in a Chinese male cohort［J］.Environmental Science&Technology，2016，50（11）:5953-5960.

［6］李彬，吳山，梁金明，等.珠江三角洲典型區(qū)域農產品中鄰苯二甲酸酯（PAEs）污染分布特征［J］.環(huán)境科學，2016，37（1）:317-324.

LI Bin，WU Shan，LIANG Jin-ming，et al.Distribution characteristics and risk assessment of phthalic acid esters in agricultural products around the Pearl River Delta，South China［J］.Chinese Journal of Environmental Science，2016，37（1）:317-324.

［7］Net S，Sempéré R，Delmont A，et al.Occurrence，fate，behavior and ecotoxicological state of phthalates in different environmental matrices［J］. Environmental Science&Technology，2015，49（7）:4019-4035.

［8］Chang H K，Mohseni P，Zylstra G J.Characterization and regulation of the genes for a novel anthranilate 1，2-Dioxygenase from Burkholderiacepacia DBO1［J］.Journal of Bacteriology，2003，185（19）:5871-5881.

［9］Eaton R W.Plasmid-encoded phthalate catabolic pathway in Arthrobacterkeyseri12B［J］.Journal of Bacteriology，2001，183（12）:3689-3703.

［10］Hara H，Masai E，Katayama Y，et al.The 4-oxalomesaconate hydratase gene，involved in the protocatechuate 4，5-cleavage pathway，is essential to vanillate and syringate degradation in Sphingomonas paucimobilis SYK-6［J］.Journal of Bacteriology，2000，182（24）:6950-2657.

［11］Keyser P，Pujar B G，Eaton R W.Biodegradation of the phthalates and their esters by bacteria［J］.Environmental Health Perspectives，1976，18（12）:159-166.

［12］Li S，Kimura M，Takashima T，et al.Role of cysteine residues in 4-oxalomesaconate hydratase from Pseudomonas ochraceae NGJ1［J］.Bioscience Biotechnology and Biochemistry，2007，71（2）:449-457.

［13］孫瑞，韓東東，馬丹，等.寡營養(yǎng)條件下超微細菌對鄰苯二甲酸酯的生物降解［J］.安全與環(huán)境學報，2015，15（6）：260-264.

SUN Rui，HAN Dong-dong，MA Dan，et al.Biodegradation of phthalate esters by the ultramicro-bacterial consortium under the oligotrophic condition［J］.Journal of Safety and Environment，2015，15（6）:260-264.

［14］Otwinowski Z，Minor W.Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode［J］.Methods in Enzymology，1997，276:307-326.

［15］段星春，易筱筠，楊曉為，等.兩株鄰苯二甲酸二丁酯降解菌的分離鑒定及降解特性的研究［J］.農業(yè)環(huán)境科學學報，2007，26（5）：1937-194.

DUAN Xing-chun，YI Xiao-yun，YANG Xiao-wei，et al.Isolation and characterization of two Di-n-butyl phthalate degrading bacteria［J］. Journal of Agro-Environment Science，2007，26（5）:1937-194.

［16］劉華，沈新天，孫麗娜，等.普通小球藻對鄰苯二甲酸二丁酯的富集與降解研究［J］.農業(yè)環(huán)境科學學報，2008，27（6）：2391-2395.

LIU Hua，SHEN Xin-tian，SUN Li-na，et al.Accumulation and biodegradation of dibutyl phthalate in chlorella vulgaris［J］.Journal of Agro-Environment Science，2008，27（6）:2391-2395.

［17］Ma D，Hao Z，Sun R，et al.Genome sequence of a typical ultramicrobacterium，Curvibacter sp.Strain PAE-UM，capable of phthalate ester degradation［J］.Genome announcements，2016，4（1）:1-2.

［18］Zhang S，Ma G，Liu Y，et al.Theoretical study of the hydrolysis mechanism of 2-pyrone-4，6-dicarboxylate（PDC）catalyzed by LigI［J］.Journal of Molecular Graphics&Modelling，2015，61（9）:21-29.

［19］Badger J.Structural analysis of a set of proteins resulting from a bacterial genomics project［J］.Proteins，2005，60（4）:787-796.

［20］Johnston J M，Arcus V L，Morton C J，et al.Crystal structure of a putative methyltransferase from Mycobacterium tuberculosis，misannotation of a genome clarified by protein structural analysis［J］.Journal of Bacteriology，2003，185（14）:4057-4065.

［21］Ni B，Zhang Y，Chen D W，et al.Assimilation of aromatic compounds by Comamonas testosteroni:Characterization and spreadability of protocatechuate 4，5-cleavage pathway in bacteria［J］.Applied Microbiology and Biotechnology，2013，97（13）:6031-6041.

Microbial degradation Pathway of dibutylPhthalate by a tyPical ultramicrobacterium and the exPression and Purification of 4-oxalomesaconate hydratase

MA Dan，SUN Rui，QUAN Wei，WANG Ying-ying*
（College of Environmental Science and Engineering，Nankai University，Key Laboratory of Pollution Processes and Environmental Criteria（Ministry of Education），Tianjin Key Laboratory of Environmental Remediation and Pollution Control，Tianjin 300071，China）

A typical ultramicrobacterium，Curvibacter sp.strain PAE-UM，capable of degrading dibutyl phthalate was isolated.It is a Gram negative strain.Flow cytometer was used to detect the bacterial growth and the HPLC-MS was applied to analyze the concentration of DBP. The result showed that this strain can degrade DBP with a degradation rate of 94%and the maximum growth rate of strain was 0.237 2 h-1. Its draft genome has been sequenced in our previous study.The complete genome sequence has been deposited in GenBank under the accession number LKCX00000000.In this study，we proposed the degradation pathway of dibutyl phthalate and the key enzymes involved based on the genome analysis.The results showed that 4-oxalomesaconate hydratase（OMH）was the key enzyme in the meta-cleavage of protocatechuic acid in PAEs degradation pathway.It is also the key enzyme in the aromatic compounds degradation pathway.It has the ability to catalyze the 4-oxalomesaconate to 4-carboxy-4-hydroxy-2-oxoadipate.The gene encoding OMH was expressed in E.coli.The protein was then purified by a variety of methods.Protein crystals with high resolution were obtained.The crystal data was then collected by X-ray diffraction experiment in Shanghai Synchrotron Radiation Facility.The data was processed by the HKL2000 software and the resolution was 2.0 ?.These results could make an important contribution to the study of OMH functional mechanism.Furthermore，the results could further clarify the molecular mechanism of the PAEs degradation by ultramicrobacteria.

ultramicrobacterium；phthalate esters；4-oxalomesaconate hydratase（OMH）；X-ray；protein expression and purification

X171.5

A

1672-2043（2016）10-1992-06

10.11654/jaes.2016-1010

馬丹，孫瑞，權偉，等.典型超微細菌降解鄰苯二甲酸二丁酯的途徑及水合酶的表達純化研究［J］.農業(yè)環(huán)境科學學報，2016，35（10）：1992-1997.

MA Dan，SUN Rui，QUAN Wei，et al.Microbial degradation pathway of dibutylphthalate by a typical ultramicrobacterium and the expression and purification of 4-oxalomesaconate hydratase［J］.Journal of Agro-Environment Science，2016，35（10）:1992-1997.

2016-08-06

國家自然科學基金項目（31322012）

馬丹（1985—），女，天津人，博士研究生。研究方向為微生物生態(tài)。E-mail:biologicals@163.com

*通信作者：王瑩瑩E-mail:wangyy@nankai.edu.cn