石文波　彭曉朋　冉瑞智　張芳　幸茂輝

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血清INTS6P1作為肝細胞癌疾病篩查新型標志物的可行性研究

石文波彭曉朋冉瑞智張芳幸茂輝

目的探討血清中整合因子復(fù)合體亞基6假基因1(INTS6P1)作為肝細胞癌患者疾病篩查新型標志物的可行性。方法采用Northern雜交方法檢測33例肝細胞癌患者腫瘤組織及臨近肺腫瘤組織中INTS6P1的表達情況，通過細胞試驗檢測INTS6P1在細胞培養(yǎng)上清和胞內(nèi)表達情況，最后檢測INTS6P1在100例患者體內(nèi)的表達情況。結(jié)果與臨床非腫瘤組織相比，33例肝細胞癌患者腫瘤組織中的INTS6P1表達量顯著降低(P=0.0066)。血清檢測結(jié)果表明，肝細胞癌患者血清中INTS6P1表達水平顯著低于非肝細胞癌患者(P<0.01)。此外，曲線下面積-ROC曲線分析表明，血清-AFP含量低于20 ng/ml時INTS6P1可以作為肝細胞癌患者疾病篩查的診斷標志物(P<0.05)。結(jié)論血清INTS6P1可以作為肝細胞癌疾病篩查新型標志物，將該標志物納入檢測能提高肝細胞癌臨床診斷的準確率。

假基因;整合因子復(fù)合體亞基6假基因1;肝細胞癌;血清標志物

肝細胞癌(HCC)是全球第5大常見癌癥，其特點為高遷移率和高復(fù)發(fā)率，且患者往往預(yù)后不良[1,2]。肝切除術(shù)是該疾病臨床首選治療方法[3]。由于HCC患者的早期診斷和篩查缺乏，患者往往錯失最佳的手術(shù)治療時機，導(dǎo)致臨床療效不甚理想[4]。國內(nèi)慢性肝炎和HBV感染引起的肝硬化是引發(fā)HCC的主要原因。有報道表明，慢性HBV感染引發(fā)的HCC占總數(shù)的10%～25%[5-7]。由HBV感染導(dǎo)致的HCC患者能夠通過早期診斷進而改善臨床治療效果。血清標志物檢測(AFP，AFP-L3，AFU和GPC3)和影像學(xué)檢查(超聲，CT和MRI)常用于HCC高危人群的疾病檢查[8，9]。血清AFP含量是目前HCC患者疾病診斷的最常用標志物，其缺點在于靈敏性(36%～64%)和特異性(79%～91%)均較低[10]。AFP在非HCC患者體內(nèi)也會出現(xiàn)升高，例如慢性肝炎、肝硬化、妊娠12周孕婦和生殖系統(tǒng)腫瘤等[11]。由于經(jīng)濟實惠、操作簡單，影像學(xué)檢查是HCC患者疾病早期診斷的理想選擇，然而，上述方法對病灶直徑小于3 cm的腫瘤檢出能力有限[12]。CT和MRI的檢測靈敏性和特異性較高，且目前是HCC患者臨床檢查的常規(guī)方法[13]。但是該方法的缺點在于價格較為昂貴，并不能成為所有患者臨床篩查和治療的常規(guī)手段。上述因素的綜合作用導(dǎo)致HCC的臨床早期篩查結(jié)果不理想。需要尋找一種HCC特異性和準確性均較高的生物標志物以改善當前早期HCC檢測所遇瓶頸。本研究探討血清中INTS6P1作為肝細胞癌患者疾病篩查新型標志物的可行性。

1　材料與方法

1.1臨床組織與血液樣品本研究的臨床樣品均采集自湖北省恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院和中國人民解放軍第302醫(yī)院2013至2015年治療的肝細胞癌患者。該研究獲得醫(yī)院倫理委員會審批，且患者均知情。肝細胞癌組織樣品和相應(yīng)的臨床肺腫瘤組織采集自芯片檢測lncRNA 陽性的肝細胞患者。血液樣品100例，HCC患者50例，慢性HBV感染患者20例，健康人群30例。血清樣品采集時間為HCC患者手術(shù)治療前7 d。新鮮組織樣品在術(shù)后30 min內(nèi)-80℃冷凍，直至本研究檢測。所有患者為新發(fā)HCC，且未接受任何干預(yù)治療?；颊叩拇_診和腫瘤分期均由病理學(xué)專家完成。

1.2細胞系HCC細胞系(Hep3B，HepG2，Huh7，MHCC97L和MHCC97H)及正常人肝臟細胞系HL-7702均購自美國菌種保藏中心，培養(yǎng)方法為含10% FBS(Gibco，Invitrogen，USA)、100 U/ml青霉素和DMEM培養(yǎng)基(Gibco，Invitrogen，USA)，5% CO2，37℃培養(yǎng)。

1.3樣品處理及血清總RNA提取采用EDTA血液采集管采集患者全血，4℃，1 200 g離心15 min，去除細胞。收集上清于微量離心管內(nèi)，4℃，12 000 g離心15 min，完全去除細胞碎片。血清置于-80℃保持備用。采用LS TRIzol(Invitrogen，USA)試劑盒根據(jù)說明書提取血清RNA，HCC樣品的細胞系總RNA采用TRIzol試劑(Invitrogen，USA)提取。

1.4Northern blot采用TRIzol試劑提取HCC細胞系(Hep3B，HepG2，Hun7，MHCC97L和MHCC97H)和正常人源肝細胞HL-7702，向凝膠中加入20 μg RNA樣品。Northern blot檢測時，lncRNA(INTS6P1)探針序列為5’-ATATGAATTCGAGGAGACAGGTATATGCT-3’，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH，內(nèi)參)探針序列為5’-CTGATGCCCCCATGTTCGT CATGGGTGTGA-3’。

1.5HCC組織和血液樣本INTS6P1含量qRT-PCR檢測采用Prime Script反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara，大連)對每個樣品的RNA進行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。定量PCR總體積15 μl，包括3 μl cDNA模板，以GAPDH為內(nèi)參。采用Light Cycler 480 SYBR Green I Master(羅氏)試劑進行定量擴增。采用羅氏公司的LC480型定量PCR儀進行擴增。通過2-ΔΔct計算INTS6P1的相對表達水平。

1.6統(tǒng)計學(xué)分析應(yīng)用SPSS 14.0統(tǒng)計軟件，組織、細胞和血清間的lncRNA表達水平采用雙尾t檢驗、Wilcoxon分析和Kruskal-Wallis檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。通過ROC曲線制圖檢測腫瘤患者血液樣品與健康血液樣品間INTS6P1表達水平的差異。

2　結(jié)果

2.1HCC組織與臨近非腫瘤組織lncRNAs芯片檢測結(jié)果為驗證lncRNAs在HCC組織中表達失調(diào)，本研究采用芯片方法檢測HCC腫瘤組織和臨床非腫瘤組織中l(wèi)ncRNAs表達情況。臨床非腫瘤組織INTS6P1水平為(2.65±1.32)，HCC患者腫瘤中INTS6P1表達水平為(1.68±1.05)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.015)。

2.2INTS6P1在HCC組織及正常肝臟組織中表達情況為進一步驗證芯片檢測結(jié)果，本研究采用定量PCR方法檢測33例HCC患者腫瘤組織和33例正常肝臟組織樣品中INTS6P1表達情況，與正常組比較，HCC組織中INTS6P1表達下調(diào)比例為78.8%(26/33)。33對樣本檢測結(jié)果表明，INTS6P1表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.0066)。見圖1。

圖1　33對腫瘤-正常肝細胞INTS6P1定量檢測結(jié)果

2.3HCC細胞及HL-7702細胞培養(yǎng)基中INTS6P1表達檢測為檢測INTS6P1的來源，本研究檢測了lncRNA-INTS6P1是否存在于細胞培養(yǎng)上清中。我們選擇6株肝細胞系，包括正常肝細胞(HL-7702)和5株人HCC細胞系(HepG2，Hep3B，Huh7，MHCC97L和MHCC97H)。收集細胞傳代后第1、2、3天的細胞培養(yǎng)上清。取上清的總RNA。收集上清后，采用qRT-PCR和northern blot檢測6株細胞中INTS6P1表達情況。均檢測到INTS6P1表達，且其表達量隨時間延長而增加。正常肝臟細胞中INTS6P1表達情況與HCC細胞系不同。見圖2～5。

2.4肝切除術(shù)前后患者血清中INTS6P1表達情況比較為進一步探究導(dǎo)致HCC患者INTS6P1表達下降的原因，采集8例肝臟切除術(shù)治療的HCC患者術(shù)前和術(shù)后1個月血液?；颊咝g(shù)后血液中INTS6P1表達量顯著高于術(shù)前(P=0.022)。患者接受肝臟切除術(shù)治療后血清中仍能檢測到AFP?；颊咝g(shù)后AFP與術(shù)前相比顯著下降(P=0.0078)。見圖6、7。

圖2　細胞培養(yǎng)上清中LncRNA-INTS6P1表達情況

圖3　northern blot方法檢測不同細胞系中INTS6P1表達情況

圖4　northern blot灰度掃描和量化結(jié)果

圖5　qRT-PCR方法檢測不同肝細胞系中INTS6P1表達情況

圖6肝臟切除術(shù)治療前后患者血漿中INTS6P1表達量比較(Wilcoxon檢驗)

圖7肝臟切除術(shù)治療前后患者血漿中AFP表達量比較(Wilcoxon檢驗)

2.5血清INTS6P1表達作為疾病篩查研究為驗證采用外周血中INTS6P1檢測作為HCC患者疾病篩查的新型標志物的可行性。我們采用qRT-PCR方法檢測50例HBsAg陽性HCC患者的血清樣品，20例HBV感染患者血清樣品和30例健康人群血清樣品(AFP<10 ng/ml，HBsAg陰性)。HCC患者的臨床病理學(xué)特征。與健康人群(P=0.04)和非HCC患者(P=0.03)相比，HCC患者的INTS6P1表達顯著下降。此外，也比較了INTS6P1在慢性HBV感染和健康人群中的表達情況，前者顯著低于后者(P=0.0458)。見表1，圖8。

2.6血清AFP和INTS6P1的診斷價值為檢測INTS6P1對疾病診斷的價值，本研究采用AUC-ROC分析血清AFP和血清INTS6P1。二者的診斷價值。結(jié)果表明，在血清AFP含量低于20 ng/ml時，INTS6P1(AUC-ROC，0.867，P<0.05)的臨床診斷價值高于AFP(AUC-ROC，0.855，P<0.05)。見表2,圖9。

表1　HCC患者的臨床病理學(xué)特征　例

圖8　3組INTS6P1表達情況比較

3　討論

近年來，高度穩(wěn)定的游離DNA(cfCNA)，包括RNA和DNA，均在人類的血液、血清和尿液中檢測到。研究表明，cfCNA與多種疾病相關(guān)，特別是腫瘤性疾病[14]。隨著基因測序和表觀遺傳學(xué)的不斷發(fā)展，已經(jīng)衍生出關(guān)于研究非編碼RNAs(ncRNAs)的學(xué)科。長非編碼RNAs(lncRNAs)已經(jīng)被廣泛發(fā)現(xiàn)和報道，其長度一般在200～10 000 nt[15]，參與多種腫瘤細胞生物學(xué)功能的調(diào)節(jié)途徑[16]。假基因是IncRNAs的一種。其結(jié)構(gòu)與親本蛋白編碼基因相似。HULC，是首個在HCC中發(fā)現(xiàn)的lncRNA，在Hep3B細胞中通過調(diào)節(jié)CREB轉(zhuǎn)錄因子，導(dǎo)致HULC表達顯著上調(diào)[17,18]，在HCC組織中HULC的表達水平與HBx陽性密切相關(guān)。此外，越來越多的報道表明，HCC組織中l(wèi)ncRNAs表達失調(diào)[19,20]，這一現(xiàn)象與腫瘤轉(zhuǎn)移、篩查、診斷或腫瘤的預(yù)后密切相關(guān)[21]。有研究表明，整合因子復(fù)合體亞基6假基因1(INTS6P1)是一種HCC腫瘤抑制基因，其通過競爭性內(nèi)源RNA(ceRNA)上調(diào)相應(yīng)的腫瘤抑制同源基因INTS6，進而抑制HCC生長[22]。因此，INTS6P1具有作為HCC患者臨床疾病診斷標志物的潛力。

表2　血清AFP和INTS6P1診斷價值

圖9血清AFP含量低于20 ng/ml時AFP和INTS6P1用于疾病診斷比較

cfCNA是腫瘤診斷和篩查的潛在生物標志物。盡管報道表明許多與mRNA和microRNA類似的cfCNA是許多腫瘤檢測的標志物[14,23]，關(guān)于假基因的報道很少。Peng等[22]研究表明，INTS6P1能抑制HCC細胞生長和遷移，并能促進其凋亡。其機制是INTS6P1 競爭性結(jié)合HCC癌基因miR-17-5p轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)INTS6表達。本研究進一步探討INTS6P1在HCC患者臨床中的應(yīng)用。

芯片檢測結(jié)果表明，我們在HCC組織中檢測到大量的假基因INTS6P1。本研究進一步比較HCC與正常肝臟組織中INTS6P1 表達水平，表明HCC中表達顯著下調(diào)78.8%。細胞和血清檢測結(jié)果表明，INTS6P1在患者的組織和血清中均有表達。與非HCC患者相比，HCC患者血清中INTS6P1表達水平顯著下降，表明INTS6P1在正常人體內(nèi)表達水平更高更穩(wěn)定。

部分研究表明，腫瘤細胞能分泌miniRNA到細胞外，并進入循環(huán)系統(tǒng)[24]。HCC細胞實驗表明，與正常肝臟細胞相比，不僅胞內(nèi)INTS6P1表達下調(diào)，細胞培養(yǎng)上清中的INTS6P1表達也相應(yīng)下降。此外，HCC患者肝臟切除術(shù)治療前后的血清INTS6P1表達情況檢測結(jié)果表明，術(shù)后INTS6P1表達量較術(shù)前有顯著升高。綜合組織和細胞培養(yǎng)試驗結(jié)果，我們認為腫瘤細胞能抑制INTS6P1表達。表明與正常肝臟細胞相比HCC細胞分泌INTS6P1 假基因到細胞外顯著降低。鑒于HCC患者與非HCC患者血清中INTS6P1表達量的不同，可以采用INTS6P1作為該疾病診斷的標志物。

lncRNA 的表達水平與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[25]。檢測血清中l(wèi)ncRNA表達水平作為疾病診斷手段，其結(jié)果準確、可靠。本研究中報道了假基因INTS6P1，證實其在HCC中表達被抑制，其通過競爭性內(nèi)源RNA(ceRNA)上調(diào)相應(yīng)的腫瘤抑制同源基因INTS6，進而抑制HCC生長。AUC-ROC 分析結(jié)果表明，在血清AFP含量低于20 ng/ml時，INTS6P1(AUC-ROC，0.867，P<0.05)的臨床診斷價值高于AFP(AUC-ROC，0.855，P<0.05)。臨床上HCC患者聯(lián)合采用AFP和INTS6P1進行檢測能提高診斷的靈敏性，從而能顯著改善HCC患者篩查的結(jié)果。本研究還發(fā)現(xiàn)慢性HBV感染患者的INTS6P1表達量高于HCC患者，同時又低于正常人群。根據(jù)這個結(jié)果，我們認為可以通過INTS6P1表達檢測進行HBV感染患者轉(zhuǎn)為HCC的早期篩查。可以通過該標志物的檢測為HBV患者疾病的治療方案的制定提供重要依據(jù)。

目前，尚沒有一種生物標志物能替代AFP作為HCC的臨床診斷。然而由于AFP檢測存在高靈敏性和低特異性的問題，開發(fā)一種輔助檢測方法十分必要。本研究結(jié)果表明，血清INTS6P1假基因可以作為HCC患者早期篩查的新型非侵襲性生物標志物。

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The feasibility study on serum INTS6P1 as an novel marker for screening hepatocellular carcinoma

SHIWenbo*,PENGXiaopeng,RANRuizhi*,etal.

*DepartmentofOncology,EnshiCentralHospital,EnshiTujianationalityandMiaonationalityAutonomousPrefecture,Hubei,Enshi445000,China

ObjectiveTo investigate the feasibility of pseudogene integrator complex subunit 6 pseudogene 1 (INTS6P1) in serum as an novel marker to screen hepatocellular carcinoma (HCC). MethodsThe expression levels of INTS6P1 were detected by Northern hybridization method in 33 cases of hepatocellular carcinoma tissues and adjacent normal liver tissues.Moreover the expressions of INTS6P1 in supernatant of cell culture were measured by means of cell culture in vitro, besides, the expression levels of INTS6P1 were detected in 100 patients with HCC in vivo.ResultsAs compared with those in adjacent normal liver tissues,the expression levels of INTS6P1 in 33 cases of hepatocellular carcinoma tissues were significantly decreased (P<0.01). The expression levels of INTS6P1 in serum of patients with HCC were significantly lower than those of patients with non-HCC (P<0.01). In addition, the AUC-ROC curve analysis showed that when the serum levels of AFP were lower than 20ng/ml, INTS6P1 could be regarded as a diagnostic marker for screening hepatocellular carcinoma (P<0.05).ConclusionThe serum INTS6P1 can be regarded as an novel marker for screening hepatocellular carcinoma,moreover,the detection of serum INTS6P1 can increase the accuracy of clinical diagnosis of HCC.

pseudogene;INTS6P1;hepatocellular carcinoma;serum markers

10.3969/j.issn.1002-7386.2016.21.002

445000湖北省恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院腫瘤Ⅱ科(石文波、冉瑞智、張芳、幸茂輝)；中國人民解放軍第302醫(yī)院肝癌病區(qū)組腫瘤科(彭曉朋)

R 735.7

A

1002-7386(2016)21-3209-05

2016-04-05)