劉瑞敏　晁瑋霞　王少龍　王明麗　賈彩云　白慧玲　馬遠(yuǎn)方

(河南大學(xué)細(xì)胞與分子免疫學(xué)重點實驗室抗體藥物河南省工程實驗室，開封475000)

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Foxp3對肺癌細(xì)胞增殖及成瘤的影響①

劉瑞敏晁瑋霞王少龍王明麗賈彩云白慧玲馬遠(yuǎn)方

(河南大學(xué)細(xì)胞與分子免疫學(xué)重點實驗室抗體藥物河南省工程實驗室，開封475000)

目的：研究轉(zhuǎn)錄因子Foxp3在肺癌細(xì)胞中的高表達(dá)對肺癌細(xì)胞增殖及成瘤的影響。方法：利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法建立穩(wěn)定高表達(dá)Foxp3的NCIH-hFoxp3肺癌細(xì)胞株。MTT法觀測NCIH-hFoxp3及對照細(xì)胞的增殖。ELISA法檢測NCIH-hFoxp3及對照細(xì)胞IL-8、IL-10的分泌。建立移植瘤小鼠模型，觀察成瘤情況。結(jié)果：成功建立高表達(dá)Foxp3的NCIH-hFoxp3肺癌細(xì)胞株；與陰性對照相比，NCIH-hFoxp3細(xì)胞增殖減慢，但成瘤能力強。NCIH-hFoxp3細(xì)胞培養(yǎng)上清IL-8表達(dá)量減低，IL-10表達(dá)量升高。 結(jié)論：高表達(dá)Foxp3的肺癌細(xì)胞可能通過表達(dá)細(xì)胞因子改變局部生長的微環(huán)境，逃逸免疫監(jiān)視，而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的成瘤和發(fā)展。

Foxp3；高表達(dá)；增殖；成瘤

調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)在機體免疫監(jiān)視過程中發(fā)揮重要作用，轉(zhuǎn)錄因子Foxp3是Treg 的標(biāo)志性分子，在Treg細(xì)胞發(fā)育及功能維護(hù)方面起關(guān)鍵作用[1]。近些年的研究顯示，胰腺癌、黑色素瘤、肺癌等多種腫瘤組織高表達(dá)Foxp3[2,3]，并具有類似Treg的免疫抑制作用，與病人預(yù)后差有關(guān)。而Foxp3在腫瘤細(xì)胞高表達(dá)對腫瘤細(xì)胞本身的影響報道較少，本實驗要建立穩(wěn)定高表達(dá)Foxp3的肺癌細(xì)胞株，探討Foxp3的高表達(dá)對肺癌細(xì)胞增殖及成瘤能力的影響，為腫瘤治療提供指導(dǎo)策略。

1　材料與方法

1.1材料肺癌細(xì)胞NCIH-1299來自于本實驗室，pcDNA3-hFoxp3質(zhì)粒和pcDNA3對照質(zhì)粒由田文志教授饋贈。Lipofectamine 2000和cDNA第一鏈合成試劑盒購自Invitrogen，G418購自Sigma，鼠抗人Foxp3 單克隆抗體購自Abcam，人IL-8和IL-10 ELISA試劑盒購自博士德生物公司,裸鼠購自中醫(yī)醫(yī)學(xué)科學(xué)實驗動物研究所。

1.2方法

1.2.1轉(zhuǎn)染并篩選穩(wěn)定高表達(dá)Foxp3的肺癌細(xì)胞NCIH-hFoxp3將質(zhì)粒pcDNA3-hFoxp3和對照質(zhì)粒pcDNA3轉(zhuǎn)染到肺癌細(xì)胞NCIH-1299中，轉(zhuǎn)染步驟按照Invitrogen公司Lipofectamine 2000試劑盒的說明書。用G418加壓篩選轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，濃度從300 mg/L加至1 000 mg/L，采用有限稀釋法亞克隆挑選穩(wěn)定高表達(dá)Foxp3細(xì)胞株，命名為NCIH-hFoxp3。

1.2.2 RT-PCR及Western blot檢測轉(zhuǎn)染效果取NCIH-hFoxp3及對照細(xì)胞，用Trizol法提取RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明將獲得的RNA轉(zhuǎn)錄成cDNA。擴增Foxp3目的片段，上游引物5′-AGCTGCCCACACTGCCCCTA-3′ ；下游引物5′-CCGCCTGGCAGTGCTTGAGG-3′，產(chǎn)物為453 bp。β-actin為內(nèi)參：上游引物5′-CCTAGAAGCATTTGCGGTGG-3′；下游引物5′-GAGCTACGAGCTGCCTGACG-3′，產(chǎn)物為220 bp。

取NCIH-hFoxp3及對照細(xì)胞提取蛋白，做SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后將樣品轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，加鼠抗人Foxp3抗體過夜，PBST洗滌后加山羊抗鼠二抗，暗室顯影，用β-actin為內(nèi)參。

1.2.3ELISA法檢測NCIH-hFoxp3和對照細(xì)胞培養(yǎng)上清IL-8、IL-10表達(dá)差異以相同的數(shù)目把兩種細(xì)胞接種到六孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，設(shè)3個復(fù)孔。分別在培養(yǎng)24、36、48 h時收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，離心5 min。按照ELISA 試劑盒的說明書操作步驟檢測兩組細(xì)胞IL-8和 IL-10表達(dá)量的差異。

1.2.4MTT法檢測NCIH-hFoxp3和NCIH-control兩組細(xì)胞增殖以相同細(xì)胞數(shù)目把兩種細(xì)胞加入96孔培養(yǎng)板中，準(zhǔn)備7塊板，每組設(shè)6個復(fù)孔。用MTT法在此后1～7 d時檢測490nm處各孔的OD值。

1.2.5移植瘤裸鼠模型的建立NCIH-hFoxp3和NCIH-control細(xì)胞分別消化計數(shù)，每只裸鼠接種5×106個細(xì)胞。接種后每隔2 d進(jìn)行裸鼠稱重統(tǒng)計記錄，觀察每只裸鼠出瘤時間，記錄瘤體生長情況。4～6周后解剖取瘤，記錄瘤重以及瘤體積，切取邊緣組織福爾馬林固定，剩余的組織凍存留用；眼底靜脈取血，離心取上清，-80℃保存。

1.2.6Western blot檢測裸鼠腫瘤組織中Foxp3的表達(dá)對照組裸鼠腫瘤組織提取蛋白，做SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后將樣品轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，加鼠抗人Foxp3抗體過夜，加山羊抗鼠二抗，暗室顯影，用β-actin作為內(nèi)參。

1.2.7定量PCR檢測NCIH-hFoxp3和NCIH-control裸鼠腫瘤組織中IL-8和IL-10的表達(dá)Trizol法提取RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明將RNA轉(zhuǎn)錄成cDNA。擴增IL-8和IL-10目的片段，IL-8上游引物5′-GGTGCAGTTTTGCCAAGGAG-3′ ；下游引物5′-TTCCTTGGGGTCCAGACAGA-3′，產(chǎn)物為183 bp。IL-10上游引物5′-ACATCAAGGCGCATGTG-AAC-3′ ；下游引物5′-GCCACCCTGATGTCTCAGTT-3′，產(chǎn)物為241 bp。β-actin為內(nèi)參：上游引物5′-CCTAGAAGCATTTGCGGTGG-3′；下游引物5′-GAGCTACGAGCTGCCTGACG-3′，產(chǎn)物為220 bp。用熒光定量 PCR 儀所配軟件Rotor-Gene 6000 Series Software 對實驗結(jié)果進(jìn)行分析。

2　結(jié)果

2.1建立穩(wěn)定高表達(dá)Foxp3的細(xì)胞株NCIH-hFoxp3RT-PCR結(jié)果如圖1所示：選4個NCIH-hFoxp3細(xì)胞克隆進(jìn)行Foxp3基因擴增，PCR產(chǎn)物453 bp，亮度明顯高于NCIH-1299和空白質(zhì)粒對照細(xì)胞，表明Foxp3在mRNA水平高表達(dá)。Western blot結(jié)果如圖2： NCIH-hFoxp3細(xì)胞在48 kD大小的位置出現(xiàn)明顯的條帶，而NCIH-1299細(xì)胞和空白質(zhì)粒對照細(xì)胞在48 kD大小的位置沒有出現(xiàn)明顯的條帶，表明pcDNA3-hFoxp3質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染到NCIH-1299細(xì)胞中，并在蛋白水平上高表達(dá)。

2.2NCIH-hFoxp3和對照細(xì)胞培養(yǎng)上清IL-8、IL-10的表達(dá)結(jié)果如圖3和圖4所示。兩組細(xì)胞上清中IL-8的含量都隨培養(yǎng)時間的增加而增加； NCIH-hFoxp3細(xì)胞組中IL-8的含量明顯低于對照組，兩組的差異有統(tǒng)計學(xué)意義。NCIH-hFoxp3細(xì)胞組上清中IL-10的含量隨時間的增加有明顯升高，在36 h后含量高于對照組，36 h后兩組的差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖1　高表達(dá)Foxp3的細(xì)胞株NCIH-hFoxp3的PCR鑒定Fig.1　Identification of NCIH-hFoxp3 by PCR

圖2　高表達(dá)Foxp3的細(xì)胞株NCIH-hFoxp3的Western blot鑒定Fig.2　Identification of NCIH-hFoxp3 by Western blot

圖3　兩組細(xì)胞培養(yǎng)上清不同時間IL-8含量對比Fig.3　Concentration of IL-8 in tumor supernatants at different timeNote: *.P<0.01 vs the control.

圖4　兩組細(xì)胞培養(yǎng)上清不同時間IL-10含量對比Fig.4　Concentration of IL-10 in tumor supernatants at different timeNote: *.P<0.05,**.P<0.01 vs the control.

圖5　NCIH-hFoxp3和對照組細(xì)胞的增殖Fig.5　Proliferating capacity of NCIH-hFoxp3 and NCIH-control

圖6　兩組成瘤模型裸鼠腫瘤直徑的比較Fig.6　Comparison of tumor nodules between NCIH-hFoxp3 and NCIH-control

圖7　兩組裸鼠腫瘤組織中Foxp3表達(dá)的差異Fig.7　Expression of Foxp3 in NCIH-hFoxp3 and NCIH-control tumor nodules

圖8　NCIH-hFoxp3和NCIH-control裸鼠腫瘤組織中IL-8和IL-10的表達(dá) Fig.8　Comparison of IL-8 and IL-10 relative expression levels between NCIH-hFoxp3 and NCIH-control tumor nodules

2.3 Foxp3的高表達(dá)抑制了腫瘤細(xì)胞的增殖結(jié)果如圖5所示： NCIH-hFoxp3細(xì)胞的增殖比NCIH-control組減慢，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.4移植瘤裸鼠成瘤的動態(tài)變化NCIH-hFoxp3組小鼠在接種18 d時出現(xiàn)腫瘤，腫瘤生長的速度快，腫瘤組織的直徑大，NCIH-control組小鼠在接種25 d時出現(xiàn)腫瘤，腫瘤生長的速度慢，腫瘤組織的直徑小，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(圖6)。

2.5 WB方法檢測兩組小鼠腫瘤組織中Foxp3表達(dá)量的差異結(jié)果如圖7所示：NCIH-control組基本檢測不到Foxp3的表達(dá)，NCIH-hFoxp3組有明顯的Foxp3表達(dá)，而且隨著腫瘤的生長表達(dá)量增加。

2.6定量PCR檢測NCIH-hFoxp3和NCIH-control裸鼠腫瘤組織中IL-8和IL-10的表達(dá)結(jié)果如圖8所示，在腫瘤長至7 d和13 d時，NCIH-hFoxp3組織中IL-8的表達(dá)低于對照組2倍以上，IL-10的表達(dá)高于對照組2倍以上，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3　討論

調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)具有免疫抑制作用，最近的研究發(fā)現(xiàn)在腫瘤患者的癌灶局部有Treg聚集，這與腫瘤的進(jìn)展和預(yù)后相關(guān)[4]。Treg可通過直接接觸或釋放抑制性細(xì)胞因子IL-10、TGF-β等[5]而抑制效應(yīng)性T細(xì)胞的活化、增殖和功能，抑制NK細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒效應(yīng)等，從而促進(jìn)腫瘤逃逸。

人們在多種譜系腫瘤細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)了Foxp3的表達(dá)，一些表達(dá)Foxp3的腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出和CD4+CD25+Foxp3調(diào)節(jié)性T細(xì)胞相似的特性，可抑制效應(yīng)性T細(xì)胞的增殖，從而逃避效應(yīng)T細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，因此認(rèn)為Foxp3的高表達(dá)可能是這些癌細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視的一個新的機制[6，7]。

Foxp3的高表達(dá)對腫瘤細(xì)胞本身增殖及成瘤的影響，報道較少。我們建立高表達(dá)Foxp3的NCIH-hFoxp3肺癌細(xì)胞株，比較NCIH-hFoxp3和NCIH-control兩組細(xì)胞增殖情況，我們發(fā)現(xiàn)高表達(dá)Foxp3的肺癌細(xì)胞增殖減慢。移植瘤裸鼠模型建立后我們發(fā)現(xiàn)，NCIH-hFoxp3組瘤組織出現(xiàn)早、生長快，這和體外實驗相反，并且隨著移植瘤生長時間延長，瘤內(nèi)Foxp3表達(dá)增多。從這個現(xiàn)象，我們考慮和腫瘤形成的微環(huán)境有關(guān)。

本實驗檢測了肺癌細(xì)胞株培養(yǎng)上清中及轉(zhuǎn)移瘤組織中IL-8、IL-10的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)與NCIH-control組相比，NCIH-hFoxp3組細(xì)胞分泌的IL-8的含量明顯降低，IL-10的含量明顯升高，而轉(zhuǎn)移瘤組織中也得到同樣的結(jié)果。IL-10是一種重要的免疫負(fù)調(diào)控因子，能抑制T細(xì)胞向Th1細(xì)胞分化，我們推測NCIH-hFoxp3細(xì)胞通過高表達(dá)IL-10，進(jìn)而抑制了效應(yīng)T細(xì)胞的免疫功能。IL-8對特異性和非特異性的免疫細(xì)胞具有強烈的趨化作用，其中主要是對嗜中性粒細(xì)胞的趨化和激活作用，對淋巴細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞也有趨化作用，腫瘤組織內(nèi)中性粒細(xì)胞浸潤提示預(yù)后較好。所以我們推測，腫瘤局部微環(huán)境中IL-8低表達(dá)，對免疫細(xì)胞趨化作用減弱，抑制了免疫細(xì)胞的浸潤，腫瘤細(xì)胞逃逸免疫殺傷容易形成移植瘤。有研究者發(fā)現(xiàn)用Foxp3 siRNA抑制胰腺腫瘤細(xì)胞的Foxp3表達(dá)后，腫瘤細(xì)胞分泌的炎性細(xì)胞因子IL-6和IL-8增高[8]，同我們的研究結(jié)果一致。但是裸鼠胸腺發(fā)育不良，高表達(dá)Foxp3的肺癌細(xì)胞對T細(xì)胞的作用無法顯示，這是實驗待改進(jìn)的地方。

綜上所述，我們得出結(jié)論，高表達(dá)Foxp3的肺癌細(xì)胞可以通過表達(dá)細(xì)胞因子改變腫瘤局部生長的微環(huán)境，逃逸免疫監(jiān)視，而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的成瘤和發(fā)展。

[1]Chu KH,Chiang BL.Characterization and functional studies of fork head box protein 3(-) lymphocyte activation gene 3(+) CD4(+)regulatory T cells induced by mucosal B cells[J].Clin Exp Immunol,2015,180(2):316-328.

[2]張飚.轉(zhuǎn)錄因子Foxp3在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)功能的研究進(jìn)展[J].國際免疫學(xué)雜志,2014,37(1):49-51.

[3]張科，劉瑩瑩，金春暉，等.CEACAM6和FOXP3對胰腺癌腫瘤浸潤及預(yù)后的影響[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志,2015,31(8):1103-1107.

[4]Feng LL,Wang X.Targeting Foxp3+regulatory T cells-related immune suppression for cancer immunotherapy[J].Chin Med,2010,123(22):3334-3342.

[5]Wei T,Zhang J,Qin Y,etal.Increased expression of immunosuppressive molecules on intratumoral and circulating regulatory T cells in non-small-cell lung cancer patients[J].Am J Cancer Res,2015,5(7):2190-2201.

[6]Ozgur HH,Ercetin AP,Eliyatkin N,etal.Regulatory T cells and their prognostic value in hepatopancreatobiliary tumours[J].Hepatogastroenterology,2014,61(135):1847-1851.

[7]霍莉莉,李慧,魏楓，等.乳腺癌中FoxP3表達(dá)與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的相關(guān)性及其意義[J].中國腫瘤臨床,2014，41(3)：158-161.

[8]Hinz S,Pagerols-Raluy L,Oberg HH,etal.Foxp3 expression in Pancreatic carcinoma cells as a novel mechanism of immune evasion in cancer[J].Cancer Res,2007,67(17):8344-8350.

[收稿2015-12-31修回2016-01-30]

(編輯張曉舟)

Enforced expression Foxp3 enhances proliferation and tumorigeneity of lung cancer cell

LIU Rui-Min，CHAO Wei-Xia,WANG Shao-Long,WANG Ming-Li,JIA Cai-Yun,BAI Hui-Ling,MA Yuan-Fang.

Key Laboratory of Cellular and Molecular Immunology,Institute of Immunology,Henan University,Henan Engineering Laboratory of Antibody Medicine，Kaifeng 475000,China

Objective:To determine the effects of enforced expression of Foxp3 in lung cancer cell with regards to proliferation and tumorgeneity.Methods: A stable subline NCIH-hFoxp3 was established by liopfectamin-mediated pcDNA plasmid transfection carrying exogenous hFoxp3.The growth curve and secrection of IL-8 and IL-10 of NCIH-hFoxp3 were evaluated using MTT and ELISA,respectively.The in vivo tumorigeneity was assessed as well by inoculation of NCIH-hFoxp3 subcutaneously in nude mice.Results: Lung cancer cell NCIH-hFoxp3 with enforced expression of Foxp3 proliferated slowly but exihited increased in vivo tumorgeneity compared with corresponding control subline.In addition,increased expression of hFoxp3 in NCIH-hFoxp3 augmented secretion and attenuated secretion of IL-8 and IL-10,respectively.Conclusion: Increased expression of Foxp3 may promote progression of lung cancer cell by change of cellular microenvironment and evasion of immune surveillance.

Foxp3;Overexpression;Proliferation;Tumorgeneity

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.10.016

劉瑞敏(1974年-)，女，碩士，副教授，主要從事腫瘤免疫的研究。

及指導(dǎo)教師：白慧玲(1964年-)，女，碩士，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事自身免疫性疾病的研究，E-mail:445950688@qq.com。

R392.12

A

1000-484X(2016)10-1481-04

①本文為河南省衛(wèi)生廳2010醫(yī)學(xué)科技攻關(guān)計劃(2010003083)。