錢　雷　藺　昕　陳　瑋　李　明　于月紅

(濱?？h人民醫(yī)院檢驗科，鹽城224500)

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類風濕關節(jié)炎患者外周血單核細胞亞群的變化及其意義①

錢雷藺昕②陳瑋李明于月紅

(濱?？h人民醫(yī)院檢驗科，鹽城224500)

目的：本次研究通過檢測類風濕關節(jié)炎(RA)患者外周血單核細胞亞群比例及其分泌促炎細胞因子的功能，探討單核細胞亞群在RA發(fā)病過程中的作用。方法：22例RA患者(RA組)和22例健康對照者(HC組)，經(jīng)知情同意后抽取3 ml靜脈血，肝素鈉抗凝。流式細胞術(FCM)檢測單核細胞亞群比例、中間型單核細胞表面HLA-DR、Toll樣受體2(TLR2)和髓系細胞觸發(fā)受體-1(TREM-1)表達，及其細胞內(nèi)腫瘤壞死因子(TNF)-α平均熒光強度(MFI)，并分析RA患者單核細胞亞群比例與血清細胞因子的相關性。正態(tài)數(shù)據(jù)分析采用Students′t-test檢驗。結果：與HC組相比，RA組中間型單核細胞比例升高[(4.6±1.2)% vs (11.7±1.6)%]，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；HLA-DR表達(MFI)與HC組比較差異無統(tǒng)計學意義(26.8±8.6 vs 30.2±6.1，P>0.05)。RA組TLR2(750.2±110.3 vs 526.8±98.6)、TREM-1(58.4±12.1 vs 40.3±10.2)表達(MFI)高于HC組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；RA組中間型單核細胞胞內(nèi)TNF-α(46.3±6.4 vs 36.7±8.3)MFI高于HC組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。RA患者中間型單核細胞比例與DAS28評分和血清TNF-α、白細胞介素(IL)-17呈正相關，相關系數(shù)分別為0.593(P=0.003)、0.471(P=0.027) 和0.538(P=0.009)。結論：RA患者外周血單核細胞向中間型極化，并處于活化狀態(tài)，高表達TLR2和TREM-1，分泌較多的促炎細胞因子TNF-α，參與RA的疾病過程。因此，抑制單核細胞向中間型極化或阻斷表面受體表達可能是治療RA的新途徑。

類風濕關節(jié)炎；單核細胞亞群；Toll樣受體2；髓系細胞觸發(fā)受體-1

類風濕關節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA) 是一種以慢性多關節(jié)滑膜炎為主要特征的自身免疫性疾病。目前普遍認為其發(fā)病機制是具有特定遺傳背景的個體，在遭受外來病原體感染的過程中，抗原提呈細胞加工處理抗原多肽，在激活T淋巴細胞產(chǎn)生抗感染效應的同時，發(fā)生針對自身組織細胞的自身免疫應答，引起炎性介質(zhì)增多，導致血管炎、滑膜增生、軟骨及骨破壞，涉及固有免疫系統(tǒng)和適應性免疫系統(tǒng)在內(nèi)的許多不同途徑，其中包括單核細胞[1]。單核細胞通過參與病原微生物的吞噬、抗原提呈、T細胞功能調(diào)節(jié)等過程發(fā)揮重要作用。近年來，人類單核細胞分為三個亞群：經(jīng)典型(CD14highCD16-)、中間型(CD14highCD16+)和非經(jīng)典型(CD14lowCD16++)，不同的亞群具有不同的表型和功能[2]。本次研究通過檢測RA患者外周血單核細胞亞群比例及其分泌細胞因子的功能，探討單核細胞亞群在RA發(fā)病過程中的作用。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1研究對象本次研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(濱醫(yī)倫研2014-02)，參加者知情同意。選取2014年1月～2015年3月在濱?？h人民醫(yī)院診斷為RA患者22例(RA組)，均符合2009年美國風濕病協(xié)會(ACR)和歐洲抗風濕病聯(lián)盟(EULAR)修訂的RA診斷標準，用藥前采集標本，并進行DAS28評分。健康對照22例(HC組)，無自身免疫性疾病、腫瘤或近期感染史。各組間性別、年齡比較差異無統(tǒng)計學意義(P> 0.05)。肘前靜脈采集外周血3 ml，肝素鈉抗凝，在24 h內(nèi)完成檢測。臨床資料見表1。

1.1.2儀器和試劑異硫氰酸熒光素(FITC)鼠抗人-CD14、葉綠素蛋白偶聯(lián)物(PerCP-cy5.5)鼠抗人-CD16單克隆抗體及同型對照購自BD公司，藻紅蛋白(PE)-鼠抗人髓系細胞觸發(fā)受體-1(TREM-1)及同型對照購自R&D公司；PE-鼠抗人Toll樣受體(TLR)2、別藻藍蛋白(APC)-鼠抗人HLA-DR和PE-鼠抗人腫瘤壞死因子-α(TNF-α)及同型對照、Fixation/Permeabilization破膜/固定劑、莫能霉素、紅細胞裂解液、Perm/WashTM緩沖液購自BD公司；佛波酯(PMA)和離子霉素購自Sigma公司，流式細胞儀FACS Canto為BD公司產(chǎn)品。類風濕因子(RF)、C反應蛋白(CRP)采用免疫比濁法，BNProSpec特定蛋白分析儀及配套試劑檢測。液相芯片檢測儀為美國Luminex公司產(chǎn)品，血清細胞因子白細胞介素IL-6、IL-2、IL-1β、TNF-α、IL-4、IL-17檢測試劑購自Bio-Rad公司。

表1研究對象臨床資料

Tab.1Clinical characteristics of RA patients and control subjects

GroupsRApatientsHealthycontrolsPvalueAge(years)33.5±14.232.8±13.3>0.05Male/female5/175/17>0.05DAS285.7±1.80<0.05CRP(mg/L)15.78(1.2-22.6)0.26±0.12<0.05RF(U/ml)459±2410<0.05anti-CCPpositivity(%)72.7%0<0.05ESR(mm/h)35.1±12.310.1±3.3<0.05Monocytes(1×109L-1)0.39±0.140.31±0.09<0.05

1.2方法

1.2.1流式細胞術檢測外周血單核細胞亞群比例每100 μl外周血加入10 μl FITC鼠抗人-CD14、10 μl PerCP-cy5.5鼠抗人-CD16單克隆抗體、10 μl PE-鼠抗人TREM-1(或TLR2)和10 μl APC-鼠抗人HLA-DR或其同型對照，室溫避光孵育30 min，紅細胞裂解液破壞紅細胞后，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，1 500 r/min離心6 min，棄上清，400 μl PBS重懸細胞。用 FACSCanto檢測，以單核細胞設門，讀取單核細胞亞群比例、TLR2、HLA-DR和TREM-1平均熒光強度(MFI)或陽性細胞頻率。

1.2.2流式細胞術檢測單核細胞亞群胞內(nèi)TNF-α MFI取外周血100 μl，加入50 ng/ml PMA、1 μg/ml離子霉素和2.0 μmol/L莫能霉素，刺激培養(yǎng) 4 h，經(jīng)紅細胞裂解液破壞紅細胞后，PBS洗滌，1 500 r/min離心6 min棄上清，100 μl PBS重懸細胞。加入10 μl FITC鼠抗人-CD14、10 μl PerCP-cy5.5鼠抗人-CD16，室溫避光孵育30 min，PBS洗滌， 加入500 μl破膜/固定劑，室溫避光孵育20 min，經(jīng)Perm/WashTM緩沖液洗滌并重懸，100 μl細胞懸液中加入10 μl PE-鼠抗人TNF-α抗體，室溫避光孵育30 min。PBS洗滌后，400 μl PBS重懸細胞。以單核細胞設門，讀取單核細胞胞內(nèi)TNF-α MFI。

1.2.3液相芯片檢測血清細胞因子濃度外周血2 ml經(jīng)1 500 r/min離心5 min，收集血漿，立即儲存在-80℃冰箱。按試劑說明書檢測IL-6、IL-2、IL-1β、TNF-α、IL-4、IL-17濃度，Lumine×200讀取細胞因子濃度，每標本測兩次，取均值。

2　結果

2.1類風濕關節(jié)炎患者單核細胞向中間型極化外周血細胞經(jīng)流式抗體標記后，流式細胞儀采用前向散射光(FS)和側向散射光(SS)區(qū)別單核細胞(圖1A中R1)，測定單核細胞亞群比例(圖1B：R3、R4、R5分別為非經(jīng)典型、中間型和經(jīng)典型單核細胞)。結果見表2。

RA組中間型單核細胞亞群比例高于HC組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；經(jīng)典型單核細胞亞群比例低于HC組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；非經(jīng)典型單核細胞亞群比例與HC組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表2單核細胞亞群比例比較

Tab.2Percentage of monocyte subpopulation comparisons

GroupsRApatientsHealthycontrolstvaluePvalueClassicalmonocytes(%)77.4±7.585.2±5.33.9830.0003Intermediatemonocytes(%)11.7±1.64.6±1.216.6510.000Nonclassicalmonocytes(%)11.2±2.110.3±2.31.3550.182

2.2中間型單核細胞表面受體表達和HC組相比，RA患者中間型單核細胞TLR2、TREM-1陽性細胞頻率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；TLR2和TREM-1MFI升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。HLA-DR陽性細胞頻率和MFI差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結果見圖2和表3。

2.3 RA患者中間型單核細胞胞內(nèi)高表達TNF-α外周血細胞胞內(nèi)細胞因子經(jīng)標記后，流式細胞儀采用FS和SS區(qū)別單核細胞(圖3A中R1)，以中間型單核細胞設門(圖3B中R4)，測定單核細胞胞內(nèi)細胞因子TNF-α MFI(圖3C)。

與HC組相比，RA患者外周血中間型單核細胞胞內(nèi)TNF-α MFI表達明顯升高(46.3±6.4 vs 36.7±8.3)，差異有統(tǒng)計學意義(t= 4.296,P=0.000)。

表3中間型單核細胞表面受體表達比較

Tab.3Expression of surface receptor on interme-diate monocytes

GroupsRApatientsHealthycontrolstvaluePvalueTREM-1positivity(%)97.3±2.997.1±2.40.2490.804TREM-1MFI58.4±12.140.3±10.25.3640.000TLR2positivity(%)98.2±1.297.9±2.10.5810.563TLR2MFI750.2±110.3526.8±98.67.0820.000HLA-DRpositivity(%)13.2±4.612.9±3.80.2350.814HLA-DRMFI30.2±6.126.8±8.61.5120.137

圖1　單核細胞亞群檢測Fig.1　Analysis of monocytes subsetsNote: A.Monocytes were gated based on FS and SS;B.Monocyte subsets in healthy controls;C.Monocyte subsets in patients with RA.

圖2　中間型單核細胞亞群表面受體檢測Fig.2　Expression of cell surface molecules on intermedi-ate monocyteNote: A.Expression of monocytes TREM-1;B.Expression of monocytes HLA-DR;C.Expression of monocytes TLR2.

圖3　中間型單核細胞內(nèi)TNF-α表達Fig.3　Expression of TNF-α in intermediate monocyteNote: A.Monocytes were gated based on FS and SS;B.The subsets of intermediate monocytes;C.TNF-α MFI in intermediate monocytes.

圖4　RA患者中間型單核細胞亞群與臨床指標相關性分析Fig.4　Relationship of certain markers with intermediate monocyte of RA patientsNote: A.Correlation of intermediate monocyte percentage and serum TNF-α;B.Correlation of intermediate monocyte percentage and DAS28；C.Correlation of intermediate monocyte percentage and IL-17.

表4血清細胞因子濃度比較(pg/ml)

Tab.4Comparison of serum cytokine concentrations

CytokineRApatientsHealthycontrolsIL-671.5(48.3-116.4)1)10.4(9.3-18.5)IL-218.3(11.4-28.1)1)11.5(8.2-18.5)IL-1β52.1(33.1-74.2)1)24.6(23.2-28.6)TNF-α31.5(14.4-62.8)1)12.4(12.3-13.8)IL-419.2(15.1-27.3)18.9(14.6-22.4)IL-1728.3(11.5-38.7)1)17.2(6.5-29.3)

Note：The skewed date were presented as medians (M,25-75 percentile).Statistical significance was determined by the Mann-WhitneyU-test,1)P<0.05 RA group vs HC group.

2.4RA患者中間型單核細胞比例與臨床數(shù)據(jù)相關性分析液相芯片檢測血清細胞因子濃度(見表4)，免疫比濁法檢測CRP、RF(見表1)，分析中間型單核細胞比例與臨床數(shù)據(jù)相關性。

RA患者中間型單核細胞比例與DAS28評分和血清TNF-α、IL-17呈正相關，相關系數(shù)分別為0.593(P=0.003)、0.471(P=0.027) 和0.538(P=0.009)，與血清IL-6、IL-4、IL-1β、CRP、IL-2濃度不相關，相關系數(shù)分別為0.031 (P=0.235)、0.012(P=0.478)、0.029 (P=0.296)、0.019(P=0.430)、0.017(P=0.515)。見圖4。

3　討論

RA是輔助性T淋巴細胞Th1/Th17為核心介導的免疫系統(tǒng)功能紊亂性疾病，B淋巴細胞、γδT淋巴細胞、單核細胞等免疫細胞也在疾病過程中發(fā)揮重要作用。RA患者滑膜組織有大量活化的CD4+T淋巴細胞和MHCⅡ陽性的抗原提呈細胞(APC)浸潤，其中包括單核巨噬細胞。早期的研究將單核細胞分為CD14+CD16-和CD14+CD16+兩種單核細胞亞群[3]。近年來第三類在表型和功能上具有異質(zhì)性的單核細胞亞群(CD14highCD16+) 被發(fā)現(xiàn)[4]。2010年國際免疫學會命名委員會將人類循環(huán)中單核細胞分為三種類型：經(jīng)典型(CD14highCD16-)、中間型(CD14highCD16+)和非經(jīng)典型(CD14lowCD16++)[2]，分別約占外周血單核細胞的85%、5%和10%左右。

三個亞群在表型、功能及炎癥活化潛能方面存在著明顯的差異[4]。經(jīng)典型單核細胞具有很強的吞噬功能；非經(jīng)典型單核細胞高表達細胞骨架能動性相關基因，能識別炎癥信號并迅速遷移到炎癥部位，浸潤組織后分化為巨噬細胞；中間型單核細胞活化后能產(chǎn)生大量促炎細胞因子，因此具有較高的活化炎癥反應的潛能；并高表達編碼MHCⅡ類分子相關基因(如HLA-DR和CD74)，具有較強的抗原提呈和加工能力，促進T細胞活化、增殖，并促進血管生成[5]。

本次研究發(fā)現(xiàn)，與健康對照者相比，RA患者中間型單核細胞比例升高。與此研究一致的是，中間型單核細胞在子癇前期、動脈粥樣硬化、川崎病、膿毒性休克、多發(fā)性硬化癥、Ⅰ型糖尿病等多種自身免疫性和感染性疾病過程中升高，且與病情的嚴重性相關[6,7]。因此，中間型單核細胞增加可能是自身免疫性和感染性疾病的普遍現(xiàn)象，并在疾病過程中發(fā)揮重要的致病作用。

Toll 樣受體(Toll-like receptors,TLRs)是一類表達于細胞表面的模式識別受體(Pattern recognition receptor,PRR)，可識別病原相關分子模式(Pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)。RA患者關節(jié)滑液中的成纖維細胞及巨噬細胞TLR2表達升高[8]，通過活化RA患者關節(jié)滑液中成纖維細胞TLR2，可增加TNF-α、IL-1β和IL-8、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)以及其他促炎因子的表達[9]。在RA患者病變組織中含有TLR2的內(nèi)源性配體。本次實驗證實，RA患者外周血中間型單核細胞高表達TLR2，與此研究一致的是，Iwahashi[10]早期研究表明，RA患者外周血CD14+CD16+單核細胞TLR2表達明顯上升。TREM-1是一種能激發(fā)和放大炎癥反應的受體，經(jīng)配體活化后，促進單核細胞分泌促炎癥細胞因子，如TNF-α、IL-1β、IL-6、粒-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、IL-8及單核細胞趨化因子-1(MCP-1)等[11]。本次實驗證實，RA患者外周血中間型單核細胞高表達TREM-1。與此研究一致的是，RA小鼠經(jīng)編碼TREM-1細胞外結構域和IgG-Fc的融合基因的腺病毒重組體治療后，血清炎癥因子IL-17、TNF-α、IL-1β水平顯著降低，關節(jié)面炎癥細胞浸潤減少，關節(jié)病變明顯改善[12]。通過阻斷敗血癥鼠模型TREM-1的信號轉導通路，不僅能減少炎癥因子的產(chǎn)生，同時不降低機體清除病原體的能力[13]。因此，TREM-1可能是RA等疾病治療的新靶點。

本次實驗通過胞內(nèi)染色證實，RA患者中間型單核細胞高表達TNF-α。通過分析RA患者中間型單核細胞比例與外周血細胞因子TNF-α、IL-17的相關性得到了一致的結論。TNF-α可通過誘導微靜脈表達細胞間黏附分子(ICAM-1)和淋巴細胞功能相關抗原(LFA)3，促使中性粒細胞、巨噬細胞聚集，從而參與RA疾病的發(fā)生發(fā)展。RA患者血清、關節(jié)滑液中TNF-α在疾病活動期升高顯著，且與RA臨床表現(xiàn)相關[14]。IL-17是一種主要由CD4+T淋巴細胞、嗜酸性粒細胞等分泌的促炎性細胞因子，具有強大的募集中性粒細胞及促進多種炎性因子釋放的作用，在類風濕關節(jié)炎的發(fā)病機制中起重要作用[15]，針對TNF-α、IL-17的生物制劑對部分患者有肯定的療效。

本次實驗發(fā)現(xiàn)中間型單核細胞比例與RA患者DAS28評分具有相關性，說明中間型單核細胞參與RA的發(fā)生發(fā)展。目前有較多研究通過減少患者體內(nèi)中間型單核細胞治療自身免疫性和感染性疾病。用吸附法去除中間型單核細胞可明顯改善泛發(fā)性膿皰性銀屑病患者的臨床癥狀[16]。研究表明，中間型單核細胞是一類比較成熟的單核細胞，可分化為樹突狀細胞(DC)，具有較強的抗原提呈和加工能力[17]。因此，中間型單核細胞可能是部分自身免疫性和感染性疾病的治療靶點。

綜上所述，本次研究表明，RA患者外周血經(jīng)典型單核細胞比例降低，中間型單核細胞比例升高，并高表達TLR2和TREM-1，分泌較多的促炎細胞因子TNF-α，參與RA的疾病過程。但RA患者中間型單核細胞極化和活化的機制尚不完全清楚。因此，調(diào)控RA患者單核細胞極化和細胞表面受體的表達可能是治療RA的新途徑。

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[收稿2016-01-05修回2016-03-04]

(編輯倪鵬)

Abnormality and significance of monocyte subsets in peripheral blood of patients with rheumatoid arthritis

QIAN Lei,LIN Xin，CHEN Wei,LI Ming,YU Yue-Hong.

Department of Laboratory Medicine,Binhai County People′s Hospital，Yancheng 224500，China

Objective:To explore the role of peripheral blood monocyte subsets in the pathogenesis of rheumatoid arthritis (RA),we therefore decided to compare the percentage of monocyte subpopulations in peripheral blood,as well as cytokines secretion function,to that of healthy controls.Methods: 22 patients with RA and 22 cases of healthy controls (HC) were drew 3 ml fresh venous blood into a tube containing heparin.The percentage of monocyte subsets,expression of Toll-like receptor(TLR)2,HLA-DR,triggering receptor expressed on myeloid cells-1(TREM-1) on intermediate monocyte and mean fluorescence intensity(MFI) of intracellular tumor necrosis factor-α (TNF-α) were evaluated with the methods of flow cytometry ( FCM ).The correlation between percentage of monocyte subsets and serum cytokines was explored.Statistical significance between parametric data was determined by the students′t-test.Results: Compared to HC controls,the percentages of intermediate monocytes were significant higher in RA patients [(11.7±1.6)% vs (4.6±1.2)%,P<0.05],as well as the expression(MFI) of TLR2 (750.2±110.3 vs 526.8±98.6) and TREM-1 (58.4±12.1 vs 40.3±10.2) on intermediate monocytes (P<0.05).The expression of HLA-DR on intermediate monocytes of RA patients had no difference with HC controls (P>0.05),while MFI of intracellular TNF-α in intermediate monocytes of RA patients were significant higher than that of HC controls (46.3±6.4 vs 36.7±8.3,P<0.05).In addition,RA patients showed a positive correlation between the percentage of CD14highCD16+monocytes and DAS28 scores(r=0.538,P=0.009),as well as the serum levels of TNF-α,IL-17 (r=0.471,P=0.027;r=0.593,P=0.003).Conclusion: Monocyte subpopulations from RA patients are abnormally skewed toward to intermediate monocytes which has high expression of TLR2 ,TREM-1 and the function of TNF-α secretion.Therefore,intermediate monocytes may play a role in the pathophysiology of RA.By modulating polarization or blocking monocyte cell surface receptors could be a new treatment of RA.

Rheumatoid arthritis;Monocyte subsets;Toll-like receptor 2;Triggering receptor expressed on myeloid cells-1

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.10.023

，南京醫(yī)科大學附屬南京醫(yī)院檢驗科/南京市第一醫(yī)院，E-mail:x.lin007@163.com。

錢雷(1970年-)，男，碩士，主任技師，主要從事免疫學相關研究，E-mail:qianleiyou@163.com。

R392.8

A

1000-484X(2016)10-1519-06

①本文為鹽城市自身免疫性疾病診治創(chuàng)新團隊項目(YCWJ-2015012)。