何　浪　魏　娜　郭　政　王　丹

(電子科技大學生命科學與技術(shù)學院,成都610054)

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良惡性乳腺腫瘤外周血基因差異表達研究①

何浪魏娜②郭政③王丹③

(電子科技大學生命科學與技術(shù)學院,成都610054)

目的：利用基因表達譜數(shù)據(jù)，探討良惡性乳腺腫瘤患者外周血基因表達變化。方法：從GEO 數(shù)據(jù)庫中獲取良性和惡性乳腺腫瘤患者外周血單個核細胞(PBMCs)表達譜。GEO2R 在線工具篩選差異表達基因， DAVID 工具富集基因功能和通路。STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建差異表達基因蛋白產(chǎn)物相互作用的網(wǎng)絡(luò)，篩選核心基因。結(jié)果：良惡性乳腺腫瘤分別篩選到563和237個差異基因，乳腺癌差異基因涉及白細胞激活、血管生成等生物學過程以及白細胞跨內(nèi)皮遷移信號通路。IL8、RHOB、ITGB1等為關(guān)鍵基因。結(jié)論：良惡性乳腺腫瘤患者外周血基因表達模式存在明顯差異，為將外周血作為替代材料應用于乳腺腫瘤的診斷及監(jiān)測研究開辟了新思路。

乳腺腫瘤；外周血單個核細胞；差異表達基因；通路富集分析

乳腺癌是常見的女性惡性腫瘤，已排在肺癌之后，成為女性第二位常見惡性腫瘤[1]。外周血被認為是無創(chuàng)性分子診斷的理想材料。外周血單個核細胞(Peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)由眾多免疫細胞組成，是機體免疫防御體系的基本要素，監(jiān)控機體生理狀態(tài)，其基因表達模式的改變是機體對病理刺激做出的及時反應[2]，相比于手術(shù)中一次取樣的腫瘤組織，外周血更具有動態(tài)性。基因芯片的廣泛應用，為疾病診斷、疾病發(fā)展機制研究提供了大量高通量的基因表達數(shù)據(jù)，對這些數(shù)據(jù)的再分析可以為新的研究提供有價值的線索[3,4]。本研究比較了健康人群，良性、惡性乳腺腫瘤的外周血單個核細胞(PBMCs)mRNA基因表達譜，篩選分別與良惡性乳腺腫瘤表型相關(guān)的差異表達基因，并分析其涉及的關(guān)鍵通路，為尋找更為準確、簡便、實用的生物標記，鑒別診斷和指導個體化治療提供新思路。

1　材料與方法

1.1材料基因表達譜數(shù)據(jù)來源于基因表達綜合數(shù)據(jù)庫(GEO，Gene Expression Omnibus， http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)[5]，材料為外周血，分離單個核細胞。采用Affymetrix公司出品的Affymet-rix Human Genome U133 Plus 2.0 Array生物芯片。GEO登陸號為GSE27562[6]，由LaBreche HG等提交，包括57例乳腺癌患者，37例良性乳腺腫瘤和31例乳腺X線攝影診斷為陰性的健康人外周血標本。

1.2方法

1.2.1差異表達基因分析采用GEO 數(shù)據(jù)庫的GEO2R在線分析工具進行差異表達基因分析(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/)。該工具基于R程序語言，利用R語言中GEOquery和limma程序包，應用t檢驗篩選差異表達基因[7]?；虮磉_譜數(shù)據(jù)具有高維度(檢測的基因數(shù)非常多，通常幾千甚至上萬)和小樣本量的特點,需要多重假設(shè)檢驗(Multiple test)控制，本研究中多重假設(shè)檢驗控制采用Benjamini 和 Hochberg提出的假陽性率控制法[8]。差異基因篩選標準：P<0.05，校正P值(adjustedP-value) <0.05，基因表達值倍數(shù)變化(Fold change,FC)≥1.5。

1.2.2差異表達基因功能注釋和通路分析采用注釋及可視化整合分析數(shù)據(jù)庫( The Database for Annotation,Visualization and Integrated Discovery,DAVID)平臺，對差異表達的基因在基因本體(GO，Gene Ontology)中注釋其參與的生物學過程[9]，并進行京都基因與基因組百科全書 (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路分析[10]。采用改良Fisher精確檢驗的統(tǒng)計學方法，分析差異表達基因是否在某個功能節(jié)點上出現(xiàn)過，得出有顯著關(guān)聯(lián)的基因功能類或通路，按其P值排序后輸出功能類表格，對這些基因進行生物學解釋。P<0.05 ，多重檢驗校正P值<0.05，富集到的基因數(shù)count>2為具有統(tǒng)計學意義。

1.2.3差異表達基因核心蛋白篩選利用互作基因檢索工具(the Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes，STRING,http://string-db.org/)蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)庫[11]，分析乳腺癌外周血差異表達基因所編碼蛋白的相互作用關(guān)系，構(gòu)建蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)(Protein protein interaction，PPI)，互作評分combination score>0.4為存在互作的閾值條件。將STRING中所得蛋白互作網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)導入Cytoscape軟件[12]，運用其網(wǎng)絡(luò)分析(Network Analyzer) 插件計算節(jié)點的邊(Degree，即互作連線的數(shù)量)篩選網(wǎng)絡(luò)中心節(jié)點(Hub)。中心節(jié)點對應的蛋白質(zhì)為具有重要生理調(diào)節(jié)功能的核心蛋白質(zhì) (基因)。

2　結(jié)果

2.1差異表達基因良性和惡性乳腺腫瘤差異表達基因中上調(diào)、下調(diào)及其共同差異的基因的數(shù)目見圖1。二者共同的差異基因僅17個，均為表達上調(diào)基因。

2.2差異表達基因生物學功能注釋及信號通路分析GO功能注釋顯示，惡性乳腺腫瘤PBMCs差異表達上調(diào)的基因共富集到生物學過程(Biological process，BP)39條，其中免疫相關(guān)的功能22條，按P值排序，見表1。主要涉及細胞信號轉(zhuǎn)導、白細胞激活、細胞遷移、創(chuàng)傷應答、血管發(fā)育、細胞因子刺激反應、造血細胞分化等免疫相關(guān)的生物學過程。良性乳腺腫瘤PBMCs差異表達上調(diào)的基因共富集到4條，涉及淋巴造血器官發(fā)育。兩種表型的乳腺腫瘤PBMCs差異表達下調(diào)的基因均未富集到符合閾值條件的BP功能類。

表1良性和惡性乳腺腫瘤分別相對于健康對照的差異表達基因功能注釋

Tab.1Gene Ontology categories enriched by differentially expressed genes among benign,malignant breast tumor and healthy control (HC)

AnnotationIDBiologicalprocessestermBreastcancerGO:0006928cellmotionGO:0007242intracellularsignalingcascadeGO:0045321leukocyteactivationGO:0001944vasculaturedevelopmentGO:0042127regulationofcellproliferationGO:0016477cellmigrationGO:0009611responsetowoundingGO:0001568bloodvesseldevelopmentGO:0048514bloodvesselmorphogenesisGO:0051674localizationofcellGO:0048870cellmotilityGO:0009991responsetoextracellularstimulusGO:0008285negativeregulationofcellproliferationGO:0032496responsetolipopolysaccharideGO:0034097responsetocytokinestimulusGO:0001525angiogenesisGO:0007243proteinkinasecascadeGO:0002237responsetomoleculeofbacterialoriginGO:0007167enzymelinkedreceptorproteinsignalingpathwayGO:0006916anti-apoptosisGO:0042981regulationofapoptosisGO:0045637regulationofmyeloidcelldifferentiationBenignbreasttumorGO:0020027hemoglobinmetabolicprocessGO:0030097hemopoiesisGO:0048534hemopoieticorlymphoidorgandevelopment

表2良性和惡性乳腺腫瘤分別相對于健康對照的差異表達基因KEGG通路分布(P<0.05)

Tab.2KEGG pathways enriched by differentially expressed genes among among benign,malignant breast tumor and healthy control (HC) (P<0.05)

PhenotypeKEGGIDTermGenesymbolBreastcancerhsa05120EpithelialcellsignalinginHelicobacterpyloriinfectionADAM10,IL8,MAPK14,JUN,HBEGF,PTPN11hsa05130PathogenicEscherichiacoliinfectionACTB,YWHAZ,FYN,TLR4,ITGB1hsa04722NeurotrophinsignalingpathwayYWHAZ,MAP3K1,MAPK14,JUN,BAX,YWHAE,PTPN11hsa04310WntsignalingpathwayCSNK1A1,TBL1XR1,CTBP1,JUN,PPP3R1,PPP2R5E,TCF7L2hsa04670LeukocytetransendothelialmigrationACTB,CYBB,CXCR4,MAPK14,ITGB1,PTPN11Benignbreasttumorhsa04722NeurotrophinsignalingpathwayRPS6KA6,BCL2,YWHAB,YWHAQ,ARHGDIA,ARHGDIB,PTPN1

圖1　良性和惡性乳腺腫瘤患者PBMCs較健康人群的差異表達基因Fig.1　Number of differentially expressed genes among benign,malignant breast tumor and healthy control (HC)Note: Significant differential expression is represented by an absolute FC ≥1.5,P<0.05,adjusted P<0.05.

表3乳腺癌外周血差異表達上調(diào)核心蛋白

Tab.3Hub genes selected based on up-regulated DEGs

GenesymbolDegreeJUN44MAPK1439FOS36EGR127IL822RHOB19ACTB18YWHAZ17ITGB113

Note：Node degree is topological parameter used for gene prioritization in the network.

良惡性乳腺腫瘤PBMCs差異表達下調(diào)的基因均沒有富集到符合顯著性閾值的通路。乳腺癌PBMCs差異表達上調(diào)的基因擾動的通路集中在致病菌感染、神經(jīng)營養(yǎng)因子信號、幽門螺桿菌感染上皮細胞信號、Wnt信號及白細胞跨內(nèi)皮遷移。良性乳腺腫瘤PBMCs差異表達上調(diào)的基因僅富集到1條KEGG通路，神經(jīng)營養(yǎng)因子信號，涉及的基因與上述乳腺癌PBMCs涉及該通路的差異基因無交疊。通路按P值排序，見表2。

2.3乳腺癌外周血差異表達關(guān)鍵基因篩選以乳腺癌外周血PBMCs差異表達上調(diào)的203個基因構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，除去孤立無互作的蛋白節(jié)點，篩選出157個上調(diào)基因編碼的蛋白質(zhì)具有相互作用關(guān)系，構(gòu)成了包含有552個互作邊關(guān)系的復雜網(wǎng)絡(luò)。以節(jié)點的邊Degree>10為標準篩選中心節(jié)點，獲得Hub genes 9個，見表3。

3　討論

腫瘤被認為是系統(tǒng)性疾病[13]，腫瘤組織與宿主之間的相互作用，不僅局限于腫瘤微環(huán)境中，還涉及到遠處組織器官和系統(tǒng)免疫反應。脈管系統(tǒng)作為運輸工具，因其貫穿機體所有器官而成為腫瘤系統(tǒng)效應的中樞，其中最主要的是外周血，包含了大量免疫細胞，是機體免疫系統(tǒng)的重要組成。應用生物信息學的方法，本研究分別比較了良性和惡性乳腺腫瘤患者外周血單個核細胞與健康人群的差異，評估兩種表型在外周血細胞是否存在表達模式的差異，并進一步了解乳腺癌在機體引發(fā)的系統(tǒng)效應，為腫瘤診斷、治療及預后監(jiān)測提供新策略[14-17]。

研究中發(fā)現(xiàn)，無論是良性還是惡性乳腺腫瘤，患者外周血單個核細胞中基因表達改變主要為表達上調(diào)，其中良性乳腺腫瘤PBMCs基因差異表達范圍更為廣泛，表明乳腺腫瘤組織在體內(nèi)的存在，刺激了機體產(chǎn)生應答，在外周血中表現(xiàn)明顯。差異表達基因的功能及通路分析表明，盡管良性乳腺腫瘤PBMCs差異表達基因數(shù)量較多，但其差異表達過于寬泛，缺乏針對性，涉及的功能較少，僅富集到血紅蛋白代謝相關(guān)的3條功能類，而乳腺癌PBMCs差異表達基因從功能上看更多涉及免疫反應。腫瘤細胞惡性轉(zhuǎn)化過程中產(chǎn)生腫瘤特異性抗原，能夠誘導機體產(chǎn)生抗腫瘤免疫反應，良惡性乳腺腫瘤在免疫原性上的差異，可能是外周血產(chǎn)生應答差異的主要原因。進一步地，本研究通過構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，得到乳腺癌PBMCs差異表達上調(diào)的關(guān)鍵基因9個。

關(guān)鍵基因c-jun和c-fos均屬于早期反應基因(Immediate early genes,IEGs)，針對各種刺激迅速做出反應[18]。前炎癥轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子在乳腺癌PBMCs差異表達基因中顯著上調(diào)，并處于核心位置，表明宿主免疫系統(tǒng)狀態(tài)傾向于固有免疫激活?；罨拿庖呒毎赏庵苎心贾聊[瘤局部，穿越血管內(nèi)皮進入腫瘤間質(zhì)，成為腫瘤浸潤性免疫細胞，發(fā)揮抗腫瘤效應的同時也為腫瘤細胞的生長和轉(zhuǎn)移提供了生長因子、基質(zhì)重塑因子和新生血管。免疫細胞招募及其趨化作用與乳腺癌進展和預后之間的相關(guān)性以及在治療方面的應用也日益成為研究的熱點[19,20]。

關(guān)鍵基因中IL-8、RHOB參與了血管生成(Angiogenesis)生物學過程。異常的血管增生是實體腫瘤的固有特征之一，促血管因子可來自于腫瘤細胞，也可來自于激活的免疫細胞。例如，參與固有免疫的細胞，尤其是巨噬細胞、中性粒細胞、肥大細胞以及骨髓造血祖細胞均在血管生成轉(zhuǎn)換(Angiogenic switch)中扮演重要的角色[21]。IL-8，可直接促進內(nèi)皮細胞的增殖、管腔形成及遷移，不依賴于血管內(nèi)皮生長因子途徑[22]，降低IL-8表達可削弱腫瘤性血管生長[23]。RHOB屬于GTP酶Ras超家族，可激活血管內(nèi)皮細胞Akt信號通路，促進內(nèi)皮細胞存活和生長，介導腫瘤血管生成[24]。IL-8,RHOB在乳腺癌外周血細胞差異表達基因中處于關(guān)鍵位置，可能介導了免疫細胞促血管生成作用，進而影響乳腺癌的預后。

關(guān)鍵基因中ACTB、MAPK14、ITGB1參與了白細胞跨內(nèi)皮遷移通路(hsa04670:Leukocyte transendothelial migration)。外周血管中的白細胞穿越血管內(nèi)皮細胞，向組織趨化的過程為跨內(nèi)皮遷移(Transendothelial migration，TEM)，是免疫監(jiān)視和炎癥反應中的第一步。TEM全過程依賴于白細胞與血管內(nèi)皮細胞之間的識別、黏附和細胞運動，涉及大量的分子相互作用[25,26]。ITGB1基因編碼整合素β1，是整合素家族的跨膜受體。整合素在多數(shù)白細胞表達，包括T淋巴細胞、單核細胞、粒細胞等，通過與纖連接蛋白(Fibronectin)相互作用，介導白細胞與血管內(nèi)皮細胞識別、黏附及白細胞溢出循環(huán)系統(tǒng)。Integrin α4 和β1結(jié)合形成異二聚體VLA-4(Very Late Antigen-4),介導免疫細胞向炎癥部位的趨化。最近的研究表明，骨髓來源的造血祖細胞通過VLA-4，經(jīng)外周血循環(huán)向Fibronectin較豐富的部位趨化，協(xié)助形成適于腫瘤細胞生長的前轉(zhuǎn)移微環(huán)境[27]。ITGB1在上調(diào)基因中的中心位置，表明其可能是協(xié)助乳腺癌外周血免疫細胞進入腫瘤局部微環(huán)境的主要分子，對其深入研究將有可能明確乳腺癌外周血與腫瘤組織局部免疫微環(huán)境之間的相互聯(lián)系。

綜上，本研究利用生物信息學工具，分析了良性和惡性乳腺腫瘤外周血單個核細胞的基因表達變化。結(jié)果顯示，良惡性乳腺腫瘤患者的外周血基因表達變化模式存在明顯的差異，乳腺癌患者外周血表現(xiàn)出免疫炎癥反應，外周血可能作為替代材料，用于評估乳腺癌患者的免疫狀態(tài)。篩選得到的關(guān)鍵基因，如IL-8、RHOB、ITGB1等，調(diào)節(jié)白細胞活化，血管生成及白細胞跨內(nèi)膜遷移，在乳腺癌引發(fā)的系統(tǒng)免疫效應中可能起了重要作用，其在乳腺癌外周血細胞向腫瘤局部趨化過程中的作用值得深入研究，為乳腺癌的診斷、患者個體化治療方案制定、監(jiān)測等提供新的思路。

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[收稿2016-03-02修回2016-04-13]

(編輯許四平)

Gene expression profiles analysis identifies key genes of PBMCs in patients with benign and malignant breast tumor

HE Lang,WEI Na,GUO Zheng,WANG Dan.

School of Life Science and Technology,University of Electronic Science and Technology of China,Chengdu 610054,China

Objective:To observe the changes of gene expression in peripheral blood mononuclear cells(PBMCs) of benign and malignant breast tumor based on gene expression profiling. Methods: Datasets of gene expression profiling were downloaded from the GEO database,including PBMCs profilings of benign breast tumor,breast cancer and healthy controls.GEO2R tool was used to analyze the data to identify the differentially expressed genes (DEGs).Function of DEGs were annotated by DAVID.Protein interaction analysis and hub gene select were then performed using STRING database. Results: 563 and 237 DEGs respectively were identified.DEGs in breast cancer involved in biological process of leukocyte activation,angiogenesis and leukocyte transendothelial migration.The hub genes are IL8，RHOB，ITGB1. Conclusion: The data suggests that gene expression patterns of these two profilings are different at a certain degree.PBMCs maybe a better noninvasive material for biomarker detection of benign and malignant breast tumor.

Breast tumor;PBMCs;Differentially expressed gene;Pathway enrichment analysis

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.10.004

①本文為國家自然科學基金(81201702)和四川省衛(wèi)計委科研項目(No.120491;No.130295)。

，同時就職于福建醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院，福州350108，E-mail：gz0163@yeah.net；E-mail：helle@cmc.edu.cn。

何浪(1979年-), 女,博士，副教授，主要從事腫瘤免疫，抗腫瘤藥物篩選，同時就職于成都醫(yī)學院生物醫(yī)學系，E-mail：helang79@sohu.com。

R730.3

A

1000-484X(2016)10-1424-05

②四川省腫瘤醫(yī)院，成都 610041。