王發(fā)玲　秦　燁　曹春雨　李　倩　王艷林　楊建林

(三峽大學(xué)腫瘤微環(huán)境與免疫治療湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,宜昌443002)

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力達(dá)霉素誘導(dǎo)人宮頸癌Caski細(xì)胞發(fā)生免疫原性細(xì)胞凋亡①

王發(fā)玲秦?zé)畈艽河昀钯煌跗G林楊建林

(三峽大學(xué)腫瘤微環(huán)境與免疫治療湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,宜昌443002)

目的：探討抗腫瘤藥物力達(dá)霉素能否抑制人宮頸癌Caski細(xì)胞增殖并且誘導(dǎo)Caski細(xì)胞發(fā)生免疫原性細(xì)胞凋亡。方法：MTT比色法檢測(cè)Caski細(xì)胞增殖；Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Caski細(xì)胞凋亡。Western blot 分析細(xì)胞中Bax和Bcl-2的表達(dá)；免疫熒光流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡后細(xì)胞膜上鈣網(wǎng)蛋白的表達(dá)。結(jié)果：力達(dá)霉素抑制Caski細(xì)胞的增殖，具有時(shí)間和劑量依賴性；5 μg/L的力達(dá)霉素作用Caski細(xì)胞48 h后，腫瘤細(xì)胞凋亡率為11.5%；Bax表達(dá)量顯著增加，而Bcl-2含量明顯減少(P<0.05)；細(xì)胞膜表面鈣網(wǎng)蛋白表達(dá)高達(dá)67.2%,顯著高于對(duì)照組的2.31%。結(jié)論：力達(dá)霉素能夠有效抑制人宮頸癌Caski細(xì)胞增殖，其作用機(jī)制與線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡相關(guān)，同時(shí)促使鈣網(wǎng)蛋白轉(zhuǎn)移到Caski細(xì)胞膜表面表達(dá)，可能具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫原性細(xì)胞凋亡的能力。

力達(dá)霉素；Caski細(xì)胞；免疫原性細(xì)胞凋亡

腫瘤的免疫逃逸機(jī)制是惡性腫瘤患者長(zhǎng)期復(fù)發(fā)的重要機(jī)制之一。近年來研究表明，紫外線、γ-射線和蒽環(huán)類化療藥物能促使腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫原性細(xì)胞凋亡，進(jìn)而介導(dǎo)機(jī)體特異性抗腫瘤免疫應(yīng)答[1-3]的發(fā)生。而在此過程中，鈣網(wǎng)蛋白(Calreticulin,CRT)從凋亡細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞膜表面大量表達(dá)是凋亡細(xì)胞具有免疫原性的關(guān)鍵因素[4,5]。尋求更多能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫原性細(xì)胞凋亡的藥物，對(duì)提高抗腫瘤臨床治療的療效和預(yù)后將起到一定的積極作用。

力達(dá)霉素(Lidamycin,LDM,C1027)是一種新的烯二炔類抗腫瘤抗生素，它是從潛江縣的土壤里面分離出的一株鏈霉菌Streptomyces globis-porus的代謝產(chǎn)物中分離得到的，通過非共價(jià)鍵將一個(gè)酸性蛋白(含110個(gè)氨基酸)和一個(gè)烯二炔結(jié)構(gòu)結(jié)合而組成。研究表明，力達(dá)霉素對(duì)多種腫瘤細(xì)胞均具有很強(qiáng)的殺傷作用。力達(dá)霉素能夠誘導(dǎo)人結(jié)腸癌細(xì)胞發(fā)生衰老，有效地抑制卵巢癌細(xì)胞、人急性髓性白血病細(xì)胞的增殖，較強(qiáng)抑制肝轉(zhuǎn)移灶增生并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，顯著地抵抗小鼠骨髓瘤細(xì)胞在體內(nèi)和體外的生長(zhǎng)作用等[6-8]。但是力達(dá)霉素能否誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫原性細(xì)胞凋亡目前尚未有研究報(bào)道。本文以人宮頸癌Caski細(xì)胞株為研究對(duì)象，研究力達(dá)霉素對(duì)人宮頸癌Caski細(xì)胞增殖的影響以及作用機(jī)制，并進(jìn)一步探討力達(dá)霉素是否能夠介導(dǎo)凋亡的Caski細(xì)胞發(fā)生CRT的膜轉(zhuǎn)位，從而誘導(dǎo)Caski細(xì)胞發(fā)生免疫原性細(xì)胞凋亡，為力達(dá)霉素在宮頸癌的臨床應(yīng)用上提供新的思路和理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料人宮頸癌Caski細(xì)胞[中國(guó)細(xì)胞典藏中心(武漢)本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)保存]；力達(dá)霉素(北京協(xié)和醫(yī)科大學(xué)甄永蘇教授惠贈(zèng))；MTT、β-actin、Bax和Bcl-2多克隆抗體(SANTA CRUZ公司)；CRT抗體(Stressgon公司)；Annexin V/PI雙染試劑盒(Invitrogen公司)；RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基、小牛血清、胰酶和DMSO等(Gibco公司)；Rnase和蛋白質(zhì)Marker(Fermentas公司)；PVDF膜(Millipore公司)；BCA試劑盒和ECL顯色液(Thermo Scientific公司)。

1.2方法

1.2.1MTT法檢測(cè)力達(dá)霉素對(duì)Caski細(xì)胞增殖的抑制作用用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基常規(guī)方法培養(yǎng)人宮頸癌Caski細(xì)胞，收集對(duì)數(shù)期的Caski細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞濃度至 2×104個(gè)/L，取100 μl/孔接種到 96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。24 h后分別向細(xì)胞孔內(nèi)加入含有力達(dá)霉素的1640培養(yǎng)基，使其力達(dá)霉素的終濃度分別為0.625、1.25、2.5、5和10 μg/L，每個(gè)濃度孔設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，另外設(shè)不加藥對(duì)照組(正常培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞組)和空白組(無細(xì)胞培養(yǎng)的空白孔組，用以去除本底吸光度干擾)。置于細(xì)胞培養(yǎng)箱分別在繼續(xù)培養(yǎng) 24、48和72 h后，去除 96 孔板內(nèi)的培養(yǎng)液，每孔加入終濃度為0.2 g/L的MTT試劑100 μl,繼續(xù)培養(yǎng)4 h。去除培養(yǎng)上清，加入200 μl DMSO充分溶解，全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀570nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度值。藥物對(duì)細(xì)胞生存的抑制率=1-[(實(shí)驗(yàn)孔A值-空白對(duì)照孔A值)/(不加藥對(duì)照孔值-空白對(duì)照孔值)]×100%。

1.2.2AnnexinV/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)力達(dá)霉素誘導(dǎo)Caski細(xì)胞凋亡選擇對(duì)數(shù)期 Caski 細(xì)胞，分別加入含有力達(dá)霉素終濃度為10、5 和2.5 μg/L的1640培養(yǎng)液,置于37℃ 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48 h。常規(guī)胰酶消化后1 000 r/min 離心 5 min收集細(xì)胞，按照說明書步驟操作制備細(xì)胞蛋白樣本，流式細(xì)胞分析儀檢測(cè)細(xì)胞PI 及標(biāo)記在Annexin V上的FITC染色狀況，從而判定力達(dá)霉素誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡率。

1.2.4免疫熒光流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)經(jīng)力達(dá)霉素處理Caski細(xì)胞后，細(xì)胞膜表面CRT表達(dá)分別收集經(jīng)2.5 和 5 μg/L力達(dá)霉素處理48 h的Caski細(xì)胞，以1640培養(yǎng)基培養(yǎng)的Caski細(xì)胞為對(duì)照，PBS 洗滌細(xì)胞1次，1 500 r/min離心 5 min 收集細(xì)胞。 在細(xì)胞沉淀中加入兔抗人CRT多克隆抗體(用含1%牛血清白蛋白的PBS 1∶200稀釋)，室溫下充分作用1 h，PBS再次洗滌后，加入PE標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體(用含1%牛血清白蛋白的PBS 1∶200稀釋)室溫避光放置反應(yīng)30 min ，隨后在避光條件下，PBS再次洗滌，重懸后流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析。

2　結(jié)果

2.1力達(dá)霉素對(duì)Caski細(xì)胞生長(zhǎng)有顯著抑制作用低劑量力達(dá)霉素即可對(duì)Caski細(xì)胞增殖產(chǎn)生顯著的抑制作用。0.625 μg/L的藥物作用細(xì)胞72 h即可造成近24.96%的抑制率，5 μg/L的力達(dá)霉素對(duì)Caski細(xì)胞的抑制率高達(dá)43.85%，且這種抑制作用隨著藥物濃度增大或藥物處理時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)(表1)。

LDM(μg/ml)24h48h72h00±2.090±4.20±4.770.62512.55±1.801)12.27±3.161)24.96±1.832)1.2511.25±1.481)13.00±1.411)28.09±2.672)2.518.58±1.782)18.43±1.372)34.78±3.012)522.74±1.412)31.28±1.162)43.85±1.372)1034.24±1.422)53.08±1.632)57.84±0.652)

Note： 1)P<0.05，2)P<0.01,comparing with control group.

圖1　力達(dá)霉素誘導(dǎo)人宮頸癌Caski細(xì)胞凋亡Fig.1　Effect of LDM on apoptosis in Caski cell

圖2　力達(dá)霉素作用人宮頸癌Caski細(xì)胞后Bax和Bcl-2表達(dá)水平Fig.2　Effect of LDM on expression of Bax and Bcl-2 in Caski cells Note: *.P<0.01，comparing with control group.

2.2力達(dá)霉素誘導(dǎo)Caski細(xì)胞凋亡2.5和5 μg/L的力達(dá)霉素處理細(xì)胞48 h后，F(xiàn)ITC單染的細(xì)胞率分別增加至9.2%和11.5%，顯著高于對(duì)照組的3.1%，而PI/Annexin V雙染細(xì)胞數(shù)量無明顯改變。即低劑量力達(dá)霉素(2.5和5 μg/L)處理Caski細(xì)胞48 h，便可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡，且多處于凋亡早期(圖1)。

圖3　力達(dá)霉素作用人宮頸癌Caski細(xì)胞后，細(xì)胞膜表面CRT表達(dá)量增加Fig.3　Effect of LDM on cell surface of CRT protein expression in Caski cell

2.3力達(dá)霉素對(duì)Caski細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)的影響分別用2.5 和5 μg/L力達(dá)霉素處理Caski細(xì)胞48 h后，與對(duì)照組細(xì)胞相比，Bax表達(dá)含量增加，而Bcl-2含量顯著減少(P<0.01)(圖2)。

2.4力達(dá)霉素促使Caski細(xì)胞膜CRT表達(dá)增加2.5 和5 μg/L的力達(dá)霉素處理Caski細(xì)胞48 h后，細(xì)胞膜表面的CRT表達(dá)量從對(duì)照組的2.31%增加到54.0%和67.2%(P<0.01)(圖3)。

3　討論

力達(dá)霉素是一種新的烯二炔類抗腫瘤抗生素，具有高效的抗腫瘤效應(yīng)，按照半數(shù)抑制濃度IC50比較，它的細(xì)胞毒性比絲裂霉素、阿霉素高10 000倍[9]。其抗腫瘤分子機(jī)制主要包括損傷遺傳物質(zhì)DNA或RNA、阻滯細(xì)胞周期、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及細(xì)胞裂亡等相關(guān)[9]。但目前為止尚未有力達(dá)霉素對(duì)人宮頸癌Caski細(xì)胞的作用機(jī)制以及能否誘導(dǎo)發(fā)生免疫原性細(xì)胞凋亡的報(bào)道。

本研究結(jié)果顯示，力達(dá)霉素對(duì)Caski細(xì)胞具有高效的抑制作用，藥物劑量?jī)H為5 μg/L處理細(xì)胞72 h，細(xì)胞抑制率高達(dá)43%，其抑制效應(yīng)與藥物濃度和作用時(shí)間成正相關(guān)性。AnnexinV/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，5 μg/L力達(dá)霉素處理Caski細(xì)胞48 h后AnnexinV與轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜表面的磷脂酰絲氨酸相結(jié)合，使得標(biāo)記在AnnexinV上的FITC大量結(jié)合在細(xì)胞膜表面，但PI不能穿過完整的細(xì)胞膜與細(xì)胞染色體結(jié)合，因此FITC熒光強(qiáng)度從3.1%增加到11.5%而PI的熒光強(qiáng)度無顯著改變，符合細(xì)胞凋亡早期磷脂酰絲氨酸從細(xì)胞膜內(nèi)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜外，但仍維持細(xì)胞膜完整性的標(biāo)志性改變，證實(shí)力達(dá)霉素能有效誘導(dǎo)Caski細(xì)胞發(fā)生凋亡，且5 μg/L力達(dá)霉素處理Caski細(xì)胞48 h，凋亡細(xì)胞多處于早期凋亡。Western blot結(jié)果表明，力達(dá)霉素作用Caski細(xì)胞后，能上調(diào)促凋亡的Bax基因表達(dá)同時(shí)下調(diào)抑制凋亡的Bcl-2基因。Bax和Bcl-2的比例是影響細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵，Bax高表達(dá),則形成Bax-Bax同源二聚體,定位于線粒體膜,形成跨膜離子通道，導(dǎo)致線粒體跨膜電位的下降、崩潰,從而出現(xiàn)不可逆的細(xì)胞凋亡。因此推斷，力達(dá)霉素誘導(dǎo)Caski細(xì)胞發(fā)生凋亡機(jī)制與線粒體途徑相關(guān)。

腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫原性細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因素之一是在細(xì)胞凋亡的早期，CRT快速大量轉(zhuǎn)位到細(xì)胞膜表面表達(dá)[10]。本研究中5 μg/L力達(dá)霉素處理Caski細(xì)胞48 h，AnnexinV/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)可見AnnexinV 單染細(xì)胞顯著增多；免疫熒光流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)此時(shí)的腫瘤細(xì)胞膜表面CRT表達(dá)量顯著增加，從對(duì)照組的2.31%增加到54%。上述結(jié)果表明，力達(dá)霉素能有效誘導(dǎo)人宮頸癌Caski細(xì)胞發(fā)生凋亡，促使凋亡早期細(xì)胞的CRT向細(xì)胞膜表面轉(zhuǎn)移。提示力達(dá)霉素有誘導(dǎo)人宮頸癌Caski細(xì)胞發(fā)生免疫原性凋亡的可能性。

綜上所述，力達(dá)霉素能有效抑制人宮頸癌Caski細(xì)胞的增殖，其作用機(jī)制與調(diào)控Bcl-2基因家族的表達(dá)，活化線粒體途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡相關(guān)；同時(shí)，力達(dá)霉素能誘導(dǎo)CRT轉(zhuǎn)位到Caski細(xì)胞膜表面，使之成為可能具有免疫原性的凋亡細(xì)胞。提示力達(dá)霉素有誘導(dǎo)人宮頸癌Caski細(xì)胞發(fā)生免疫原性凋亡的可能。此現(xiàn)象為本實(shí)驗(yàn)室首次發(fā)現(xiàn)，為力達(dá)霉素抗腫瘤臨床治療提供了新的思路和理論依據(jù)。

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[收稿2016-01-05修回2016-02-22]

(編輯張曉舟)

Immunogenic apoptosis of human Caski cervical cancer cells induced by Lidamycin

WANG Fa-Ling,QIN YE,CAO Chun-Yu,LI Qian,WANG Yan-Lin，YANG Jian-Lin.

Hubei Key Laboratory of Tumor Microenvironment and Immunotherapy,Three Gorges University Medical College，Yichang 443002,China

Objective:To investigate effects of Lidamycin (LDM,C-1027) on the proliferation and immunogenic transform of human Caski cervical cancer cells and to provide the basic experiment data and theoretical supports for establishment of the new immunotherapy method mediated by LDM.Methods: MTT was used for the analysis of cell proliferation;apoptosis rate was analyzed by flow cytometry;Western blot was used to analyze the effect of LDM on the expression of Bax and Bcl-2 in Caski cells；the Flow cytometry was used to detect the expression of Calreticulin (CRT) on the cell surface.Results: Lidamycin inhibited proliferation of Caski cells significantly in the time- and dose-dependent manners;The apoptotic cell ratio induced by 5 μg/L Lidamycin was 11.5% ,Comparing with the control group,Lidamycin treatment increased Bax but decreased Bcl-2 contents significantly within Caski cells,it also significantly increased the expression of CRT on the cell surface of Caski cells from 2.31% to 67.2%.Conclusion: Lidamycin has pharmacological activity in inhibiting proliferation of the human cervical Caski cells and the underlying mechanism is related with inducing the intrinsic mitochondrial pathway of apoptosis.In the same time,Lidamycin can increase the expression of CRT on the cell surface,so it may have the ability to promote the immunogenic apoptosis of tumor cells.

Lidamycin;Caski cells;Immunogenic apoptosis

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.10.006

①本文為國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81372265)。

王發(fā)玲(1992年-)，女，在讀碩士，主要從事抗腫瘤分子靶點(diǎn)與免疫治療研究。

及指導(dǎo)教師：楊建林(1975年-)，女，副教授，主要從事抗腫瘤免疫與分子生物學(xué)研究，E-mail: mmgbb2002@126.com。

R73

A

1000-484X(2016)10-1437-04