米新宇, 劉雅瓊, 袁　蘭, 黃寧華, 曾　靜, 任霄劍, 王京宇

(1. 北京大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院, 北京　100191; 2. 北京大學(xué) 醫(yī)藥衛(wèi)生分析中心, 北京　100191)

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稀土元素鏑對大腸桿菌生長效應(yīng)研究

米新宇1, 劉雅瓊1, 袁蘭2, 黃寧華1, 曾靜1, 任霄劍1, 王京宇1

(1. 北京大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院, 北京100191; 2. 北京大學(xué) 醫(yī)藥衛(wèi)生分析中心, 北京100191)

采用酶標(biāo)儀監(jiān)測大腸桿菌的生長速度,研究培養(yǎng)液中稀土元素Dy3+濃度對大腸桿菌生長的影響。培養(yǎng)液中添加的Dy3+濃度系列為0～12.8 mg/L,培養(yǎng)時間為0～9 h。實驗結(jié)果顯示:培養(yǎng)時間為2～3 h,任何一個Dy3+濃度的培養(yǎng)液均對大腸桿菌呈現(xiàn)生長刺激作用；3 h后,Dy3+濃度低于6.4 mg/L的培養(yǎng)液繼續(xù)保持生長刺激作用,而高于9.6 mg/L的培養(yǎng)液則對大腸桿菌生長產(chǎn)生抑制作用；隨著培養(yǎng)時間的延長,無論是刺激還是抑制作用均呈現(xiàn)逐漸減弱的趨勢;在全濃度范圍內(nèi),大腸桿菌表現(xiàn)出一致性地隨Dy3+濃度升高生長對數(shù)期內(nèi)細(xì)胞分裂最活躍的時間點逐漸延后的現(xiàn)象。

大腸桿菌; Dy3+; 對數(shù)期

大腸桿菌數(shù)目是世界衛(wèi)生組織以及我國環(huán)境水質(zhì)監(jiān)測和食品安全中重要的微生物檢測指標(biāo)[1]。同時,大腸桿菌具有實驗技術(shù)成熟、操作簡便、穩(wěn)定性好、生長迅速適宜等優(yōu)勢,因此本實驗將大腸桿菌作為模型生物,探索稀土元素鏑對大腸桿菌生長速度的影響。早在80年代,我國學(xué)者就已開始了稀土元素生長刺激作用的研究,并將其應(yīng)用于農(nóng)業(yè)增產(chǎn)[2-4]。目前關(guān)于稀土元素對微生物作用的研究多集中在La、Y、Gd等輕稀土元素[5-6],然而從微生物化學(xué)元素豐度背景考慮,重稀土元素在微生物體內(nèi)背景值遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于輕稀土元素,對排除研究中的待測元素本底值有重要意義。因此,本實驗選取在培養(yǎng)過程中本底值接近于零的重稀土元素鏑作為刺激元素。

酶標(biāo)檢測儀是一種高級光度計式讀數(shù)儀,具有檢測方便、測量準(zhǔn)確、高性能、靈活性和穩(wěn)定性的特點[7]?；诿笜?biāo)儀的吸光度法(比濁法)是測定菌液濃度的常用方法之一,其準(zhǔn)確、便捷、穩(wěn)定的特點長期以來為研究者所認(rèn)可[8-9]。

1　實驗

1.1實驗材料與儀器

材料:硝酸(HNO3)為UP級,蘇州品瑞化學(xué)有限公司;過氧化氫(H2O2)為UP級,蘇州品瑞化學(xué)有限公司;氯化鈉為分析純,北京化工廠;超純水電阻率>18.2 MΩ;標(biāo)準(zhǔn)溶液從國家有色金屬及電子材料分析測試中心購置,質(zhì)量濃度為1 000 mg/L;菌種為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心產(chǎn)品,大腸桿菌(E.coli)1.487;牛肉粉為LP0029,OXOID;蛋白胨為LP0042,OXOID。

儀器：搖床為ZWY多幅軌道式恒溫培養(yǎng)振蕩器,上海量壹科學(xué)儀器有限公司；高壓蒸汽滅菌鍋為SX-700高壓蒸汽滅菌鍋,TOMY；酶標(biāo)儀為Model 550,BIO-RAD。

1.2實驗方法

按照實驗要求活化擴增大腸桿菌菌種。取等量(10μL)活化菌液接種至20 mL、質(zhì)量濃度為1.6、3.2、6.4、9.6、12.8 mg/L的Dy3+離子系列培養(yǎng)液(分別記為實驗組1、2、3、4、5),37 ℃搖床內(nèi)培養(yǎng)，于2～9 h內(nèi),每小時采用酶標(biāo)儀測定各組菌液的吸光度值(OD值)。波長550 nm,每孔加樣量200 μL。

2　結(jié)果與討論

2.1菌液吸光度值

根據(jù)朗伯-比爾定律,當(dāng)入射光波長和溶液厚度一定時,樣品吸光度(OD值)與溶液濃度成正比,菌液吸光度與活菌數(shù)在一定濃度范圍內(nèi)具有較好的線性關(guān)系,可以據(jù)此監(jiān)測活菌數(shù)的變化[10]。因此,本次實驗使用吸光度作為菌液活菌數(shù)的觀測指標(biāo)。

表1給出了0～12.8 mg/L的Dy3+大腸桿菌培養(yǎng)2～9 h吸光度值(表1中t為培養(yǎng)時間)。由表1可以觀察到下述現(xiàn)象:

表1　0～12.8 mg/L的Dy3+大腸桿菌菌液培養(yǎng)2～9 h吸光度值

注：實驗組1—5 分別對應(yīng)1.6、3.2、6.4、9.6、12.8 mg/L的Dy3+劑量組

(1) 培養(yǎng)2 h后,對照組大腸桿菌菌液吸光度值表現(xiàn)出持續(xù)增長的趨勢,且隨著培養(yǎng)時間的延長吸光度數(shù)值增長放緩并逐漸趨于穩(wěn)定；

(2) 培養(yǎng)時間少于2 h的各個劑量組OD值均高于對照組(無Dy3+),而培養(yǎng)3 h之后OD值變化則分化成兩類:1—3組的OD值明顯高于對照組；4—5組的OD值除初值外明顯低于對照組。4—5組OD值起初高于對照組,隨后又低于對照組的現(xiàn)象尚未見報道;

(3) 隨培養(yǎng)時間增加,較高濃度劑量組的OD值有逐漸趨近甚至超越較低濃度劑量組OD值的趨勢,后文中將對此現(xiàn)象加以討論。

2.2Dy3+含量對細(xì)菌生長速度的影響

表2為各劑量組菌液在各時間點與對照組相比的相對生長速率,相對生長速率數(shù)值大于100%表示該劑量組大腸桿菌生長速率高于對照組,Dy3+表現(xiàn)出刺激生長作用；反之,小于100%則認(rèn)為Dy3+顯示出生長抑制作用。

表2　各Dy3+劑量組大腸桿菌相對生長速率　%

注：實驗組1—5 分別對應(yīng)1.6、3.2、6.4、9.6、12.8 mg/L的Dy3+劑量組

與對照組相比,培養(yǎng)2 h各實驗組均表現(xiàn)出明顯的生長刺激作用,實驗組的大腸桿菌生長速度分別為對照組的157.1%～271.4%。這與研究中常常提及的毒物低濃度興奮效應(yīng)(hormesis)相吻合[11-13]。

培養(yǎng)3 h后,Dy3+各劑量組分別表現(xiàn)出對大腸桿菌生長的刺激或抑制作用。第1—3劑量組相對生長速率均高于對照組,其平均相對生長率分別為對照組的132.4%、135.1%和129.9%,顯示出生長刺激作用；而第4和第5劑量組相對生長速率則均低于對照組,其平均相對生長率分別為對照組的81.3%和36.4%,表現(xiàn)出生長抑制作用。統(tǒng)計學(xué)分析顯示，上述各劑量組與對照組間的差異均具有顯著性(P<0.05)。這種低濃度呈現(xiàn)刺激、高濃度呈現(xiàn)抑制的現(xiàn)象與毒物低濃度興奮效應(yīng)(hormesis)中雙相劑量-效應(yīng)關(guān)系的表述相符,即細(xì)胞/組織在暴露于低劑量毒性因素而產(chǎn)生的適應(yīng)性良性反應(yīng),而當(dāng)毒性因素為高劑量時則產(chǎn)生損害[11-14]。然而,第4和第5劑量組出現(xiàn)相對生長速率隨著培養(yǎng)時間的延長由高于100%轉(zhuǎn)向低于100%的現(xiàn)象。現(xiàn)有的資料顯示hormesis效應(yīng)的確會隨時間變化[14]。Stebbing[15]在論著中也認(rèn)為在討論hormesis效應(yīng)模型時不應(yīng)當(dāng)缺少時間的要素。

觀察各組菌液2～9 h時相對生長速率的變化趨勢可以發(fā)現(xiàn),隨培養(yǎng)時間延長,各組的生長刺激或抑制作用均逐漸減弱,實驗組相對生長率有向?qū)φ战M趨同的變化趨勢。這種刺激以及抑制作用強度趨同的現(xiàn)象可能是細(xì)菌對Dy3+離子的適應(yīng)性增強所致,也有可能與培養(yǎng)液中Dy3+被細(xì)菌富集、環(huán)境中的Dy3+濃度降低有關(guān),需要更進一步的實驗研究。

2.3比生長速率與對數(shù)增長期

比生長速率μ指單位時間、單位質(zhì)量的菌體所增加的菌體量,是描述微生物生長的常用指標(biāo),能較好地描述停滯期、對數(shù)期、穩(wěn)定期細(xì)菌生長情況[16-17]。比生長速率越高代表細(xì)胞分裂越活躍,對數(shù)期內(nèi)最大比生長速率μmax則對應(yīng)該時期內(nèi)細(xì)胞分裂最快的階段。

(1)

式中：μ為比生長速率,h-1；t為大腸桿菌生長時間,h；N為該時刻微生物細(xì)胞量。

當(dāng)積分時間為n～n+1 h時,有:Nn+1-Nn=μnNn,即

(2)

式中，Nn為第n小時初始細(xì)菌總數(shù),Nn+1為第n+1小時初始的細(xì)菌總數(shù),μn為該時細(xì)菌生長的比生長速率。

如前文所述,菌液OD值與菌液濃度呈良好的線性相關(guān),因此,大腸桿菌生長n小時的比生長速率μn為

(3)

式中,ODn為第n小時開始時菌液的OD值,ODn+1為第n+1小時開始時該菌液的OD值。

表3為不同Dy3+濃度下各時間段內(nèi)各組大腸桿菌菌液每小時比生長速率?？梢钥闯?對照組大腸桿菌在2～3 h比生長速率最大,菌數(shù)增長最快,培養(yǎng)3～4 h以后,比增長率大幅降低并趨于穩(wěn)定,保持在較低水平,細(xì)菌生長從對數(shù)期轉(zhuǎn)換到平臺期。

圖1為對照組與第1和第2劑量組大腸桿菌菌液各時段比生長速率變化曲線,3個組均呈現(xiàn)出比生長速率迅速下降,隨后保持在較低水平的趨勢。

表3　不同Dy3+劑量組大腸桿菌各時段比生長速率μn

注：實驗組1—5 分別對應(yīng)1.6、3.2、6.4、9.6、12.8 mg/L的Dy3+劑量組

對照組與第1和第2劑量組大腸桿菌在2～3 h比生長速率較高,細(xì)菌分裂速度快,可初步判斷為生長對數(shù)期；培養(yǎng)3～4 h以后,比增長率大幅降低并趨于穩(wěn)定,保持在較低水平,生長對數(shù)期結(jié)束。

圖1　對照組與第1、第2 劑量組大腸桿菌比生長速率變化

圖2為第3—第5劑量組大腸桿菌菌液各時段比生長率變化,3個劑量組均呈現(xiàn)出比生長率存在先上升后下降,而后穩(wěn)定在較低水平的趨勢。第3劑量組(6.4 mg/L)比生長率2～3 h內(nèi)上升,3～4 h達(dá)到最大,此時為對數(shù)期內(nèi)細(xì)胞分裂最活躍的階段；4～5 h下降至穩(wěn)定,生長對數(shù)期結(jié)束;第4劑量組(9.6 mg/L)比生長率2～3 h內(nèi)開始上升,3～4 h達(dá)到最大,細(xì)胞分裂最活躍；5～6 h下降穩(wěn)定至較低水平,對數(shù)期結(jié)束;第5劑量組(12.8 mg/L)菌液比生長率4～5 h內(nèi)開始上升,6～7 h達(dá)到最大,細(xì)胞分裂最活躍；7～8 h下降至較低水平,對數(shù)期結(jié)束。

圖2　第3—第5劑量組大腸桿菌比生長速率變化

觀察這3個高劑量(6.4～12.8 mg/L)組比生長速率變化可以看出,隨Dy3+濃度升高,大腸桿菌對數(shù)生長期內(nèi)細(xì)胞分裂最活躍的時間點有逐漸延后的趨勢。

比較圖1和圖2,雖然不能確定前3組(0～3.2 mg/L)最大比生長速率出現(xiàn)的時間,但可以初步判斷這個時間點并不在2～3 h以后,早于后3組。因此可以推斷:在整個0～12.8 mg/L Dy3+濃度系列所有的劑量組中,無論在表現(xiàn)出生長刺激或抑制的劑量下,大腸桿菌都表現(xiàn)出一致的、連續(xù)的隨Dy3+離子濃度提高生長對數(shù)期內(nèi)分裂最活躍的時間點(對應(yīng)μmax)逐漸延后的現(xiàn)象。這種猜想與以往的在某一時間點觀察增長速率的研究方法有所不同。

生長對數(shù)期內(nèi)分裂最活躍的時間點出現(xiàn)的時間越晚,則菌液內(nèi)在μmax之前積累的細(xì)菌總數(shù)越多,這將導(dǎo)致其在分裂最活躍時期細(xì)菌總數(shù)增長越快。另外,當(dāng)高濃度組進入分裂最活躍階段時,低濃度組與對照組菌液處于生長穩(wěn)定期,比生長速率低,分裂活躍度較低。這兩種因素都將造成表1中觀察到的高濃度組在較晚時間段相對生長速率反超低濃度組的趨勢。同時,這或許從一個側(cè)面解釋了前面提及的所有劑量組相對生長率趨同的現(xiàn)象。對此,Celabrese主張的過度補償模型認(rèn)為:hormesis是生物系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)被理化刺激物破壞后所做出的一種過度補償?shù)默F(xiàn)象,而這種過度補償?shù)木唧w表現(xiàn)就是生長刺激[18]。這種主張與本次實驗所觀察到的hormesis效應(yīng)隨時間變化的現(xiàn)象相對應(yīng)。

3　結(jié)論

(1) 通過比較各組菌液各時間點菌液吸光度及相對生長速率發(fā)現(xiàn)：細(xì)菌培養(yǎng)2～3 h,0～12.8 mg/L Dy3+各劑量組均表現(xiàn)出生長刺激作用；3 h后開始,當(dāng)濃度不高于6.4 mg/L時Dy3+刺激大腸桿菌生長；當(dāng)濃度在9.6 mg/L及以上時Dy3+抑制大腸桿菌生長,表現(xiàn)為Hormesis效應(yīng)。同時,隨培養(yǎng)時間增加,所有劑量組均表現(xiàn)出的生長刺激、抑制作用逐漸減弱,相對生長速度逐漸向?qū)φ战M接近的趨勢。

(2) 通過分析Dy3+濃度系列中各組比生長速率變化發(fā)現(xiàn),無論是刺激還是抑制的劑量組都表現(xiàn)出一個相同趨勢,即:Dy3+濃度升高、生長對數(shù)期內(nèi)分裂最活躍的時間點(μmax)逐漸延后。這或許對解釋Dy3+對大腸桿菌的生長刺激或抑制現(xiàn)象有一定的意義。

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Study of rare-earth element Dy on growth of E.coli

Mi Xinyu1, Liu Yaqiong1, Yuan Lan2,Huang Ninghua1, Zeng Jing1, Ren Xiaojian1, Wang Jingyu1

(1. School of Public Health,Peking University,Beijing 100191, China;2. Center of Medical and Health Analysis,Peking University,Beijing 100191, China)

In order to study the effect of REE(rare-earth element) Dy3+in different concentration on the growth of E.coli,the growth rate of E. coli cultured in broths is monitored by a microplate reader. There are a series of broths containing 0～12.8 mg/L Dy3+used in the 9-hours cultivation. The result shows that at the first 2-3 hours,the whole Dy3+concentration series can show a growth-stimulating effect on E.coli; with the beginning of the 3rd hour,Dy3+stimulates growth with a concentrations not higher than 6.4 mg/L,and inhibits when the concentration raises to 9.6 mg/L or above; both inhibition and stimulation show a gradual weakening trend with time. In addition,in the whole concentration range,the logarithm of the growth of E. coli consistent delaying with Dy3+concentration increases.

E.coli; Dy3+; logarithmic phase

10.16791/j.cnki.sjg.2016.10.017

2016-05-17修改日期：2016-05-30

北京市自然科學(xué)基金項目“無機指紋與常見致病菌快速檢定”(2122051)資助

米新宇(1990—)，男，北京，碩士研究生，主要從事稀土元素方面的實驗和研究E-mail：1036656180@qq.com

王京宇(1956—)，男，北京，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事生命元素組學(xué)研究.E-mail：wjy@bjmu.edu.cn，82801107

X703.1

A

1002-4956(2016)10-0064-04