何　瑤，　殷　欣，　吳　芹，　鄔敏辰

（1.江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫 214122；2.江南大學 無錫醫(yī)學院，江蘇 無錫214122）

耐熱木聚糖酶基因xyn11EM在大腸桿菌中的表達

何瑤1，殷欣1，吳芹1，鄔敏辰*2

（1.江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫 214122；2.江南大學 無錫醫(yī)學院，江蘇 無錫214122）

將人工合成經(jīng)密碼子優(yōu)化的11家族耐熱木聚糖酶基因xyn11EM克隆至表達質(zhì)粒pET-28a（+）中，獲得重組質(zhì)粒pET-28a-xyn11EM。將其轉(zhuǎn)化Escherichia coli BL21（DE3），構(gòu)建表達耐熱木聚糖酶的重組工程菌 E.coli BL21/xyn11EM。用 IPTG誘導表達重組木聚糖酶 Xyn11EM（reXyn11EM），酶活性可達47.5 U/mL。SDS-PAGE分析顯示，reXyn11EM的表觀相對分子質(zhì)量為24 800。reXyn11EM的最適反應(yīng)溫度為70℃，在70℃以下穩(wěn)定。最適反應(yīng)pH為6.5～7.0，在pH 5.0～8.0范圍內(nèi)穩(wěn)定。大多數(shù)金屬離子和EDTA對該重組酶的活性影響不大。reXyn11EM的Km和Vmax值分別為7.2mg/mL和54.7 U/mg。結(jié)果表明xyn11EM成功在E.coli中實現(xiàn)了異源表達，其良好的熱穩(wěn)定性具有較好的工業(yè)應(yīng)用潛力。

耐熱木聚糖酶；大腸桿菌；表達；酶學性質(zhì)

內(nèi)切β-1，4-木聚糖酶（endo-β-1，4-xylanase，EC 3.2.1.8）簡稱木聚糖酶，它是一種重要的工業(yè)用酶，主要作用于木聚糖主鏈，隨機切割木聚糖內(nèi)部的β-1，4糖苷鍵，水解產(chǎn)物主要為不同聚合度的木寡糖和少量木糖，是木聚糖降解酶系中最關(guān)鍵的酶。根據(jù)酶蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)同源性比對和疏水簇分析，絕大多數(shù)木聚糖酶歸屬于糖苷水解酶（GH）10和11家族［1］。相對于其他GH家族，11家族木聚糖酶具有底物特異性高，相對分子質(zhì)量低（＜30 000），單一催化結(jié)構(gòu)域等特征，其空間結(jié)構(gòu)主要由兩個反向平行的β-折疊片層A、B和一個α-螺旋構(gòu)成，呈右手半握形狀［2］。

木聚糖酶廣泛應(yīng)用于食品、造紙、飼料、紡織、能源及功能性寡聚木糖生產(chǎn)等諸多工業(yè)領(lǐng)域［3］，而在飼料制粒、紙漿漂白等工藝中要求酶具備耐高溫的特性，因此耐熱木聚糖酶的研究引起了國內(nèi)外學者的高度重視。Bajaj等［4］從Streptomyces sp.SU9中分離到一種耐熱木聚糖酶（最適溫度80℃）。Ko等［5］將Paenibacillus campinasensis BL11耐熱木聚糖酶基因在大腸桿菌中進行了表達和性質(zhì)研究。Li等［6］將耐熱木聚糖酶基因Syxyn11P和Syxyn11E分別在畢赤酵母（Pichia pastoris）GS115和大腸桿菌（Escherichia coli）BL21（DE3）中進行了表達和性質(zhì)研究。薛業(yè)敏等［7］將Thermotogamaritima極端耐熱木聚糖酶基因在大腸桿菌中實現(xiàn)了高效表達。大腸桿菌表達系統(tǒng)具有繁殖快、易于培養(yǎng)、遺傳穩(wěn)定、操作簡單和易于工業(yè)化生產(chǎn)等特點，因此在木聚糖酶的研究中備受關(guān)注［8］。

Cheng等［9］克隆了來源于嗜熱裂孢菌（Thermobifida fusca）NTU22菌株的木聚糖酶基因xyl11（GenBank登錄號AY795559），該基因依次編碼著信號肽的42個氨基酸、催化域的189個氨基酸、連接肽的21個氨基酸以及結(jié)合域的86個氨基酸。作者將編碼該耐熱酶催化域189個氨基酸的基因根據(jù)大腸桿菌對密碼子的偏好性進行優(yōu)化，并命名為xyn11EM，采用人工方法合成xyn11EM基因。將該基因在大腸桿菌E.coli BL21（DE3）中進行異源表達，并對重組木聚糖酶的酶學性質(zhì)進行研究，為耐熱酶的工業(yè)化生產(chǎn)及應(yīng)用提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1菌株、質(zhì)粒和培養(yǎng)基

E.coli JM109、BL21（DE3）和表達質(zhì)粒pET-28a（+）：Novagen公司；克隆質(zhì)粒pUCm-T：上海Sangon公司；LB培養(yǎng)基：1 g/dL Tryptone、0.5 g/dL Yeast Extract和1 g/dLNaCl（固體培養(yǎng)基添加2 g/dL瓊脂粉）。

1.2工具酶和主要試劑

各種限制性內(nèi)切酶、rTaq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、250 bp DNA Ladder Marker和低相對分子質(zhì)量蛋白質(zhì) Marker：大連 TaKaRa公司；IPTG、Tryptone、Yeast Extract和EZ-10 Spin Column DNA Gel Extraction Kit：上海Sangon公司；考馬斯亮藍R-250、標準木糖和樺木木聚糖：Sigma公司；其他試劑均為國產(chǎn)或進口分析純。

1.3密碼子優(yōu)化及基因xyn11EM合成

不同的宿主細胞對密碼子有不同的偏愛性。依照密碼子的偏好性對編碼外源蛋白質(zhì)的基因進行密碼子優(yōu)化能夠有效地提高外源蛋白質(zhì)的表達量［10］。為高效表達木聚糖酶，參照宿主細胞E.coli的密碼子偏愛性表對源自嗜熱裂孢菌木聚糖酶催化域基因中的稀有密碼子進行替換，并在基因5'和3'端分別添加EcoR I和Not I酶切位點。將密碼子優(yōu)化后的基因命名為 xyn11EM（GenBank登錄號：KP119615），由上海Sangon公司合成并與pUCm-T連接，獲重組質(zhì)粒pUCm-T-xyn11EM。

1.4重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建

將重組質(zhì)粒pUCm-T-xyn11EM用EcoR I和Not I雙酶切，割膠回收目的基因xyn11EM，與經(jīng)同樣雙酶切處理的表達質(zhì)粒pET-28a（+）連接，轉(zhuǎn)化E.coli BL21（DE3）感受態(tài)細胞，并將空質(zhì)粒pET-28a（+）轉(zhuǎn)化E.coli BL21（DE3）作對照，經(jīng)通用引物（T7-F和T7-R）PCR篩選鑒定后，送上海Sangon公司測序，測序正確的重組表達質(zhì)粒命名為 pET-28axyn11EM，對應(yīng)的陽性轉(zhuǎn)化子命名為E.coli BL21/ xyn11EM。

1.5基因xyn11EM在E.coli BL21（DE3）中的表達及表達產(chǎn)物的純化

將E.coli BL21/xyn11EM接種于2.0 mL含卡那霉素（100μg/mL）的LB培養(yǎng)基中，于37℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)，再以體積比1∶50的比例轉(zhuǎn)接于30 mL含卡那霉素的新鮮LB培養(yǎng)基中，220 r/min離心，待OD600達0.6～0.8時，加入IPTG至終濃度為0.5 mmol/L，20℃誘導培養(yǎng)8 h。將培養(yǎng)液在4℃下于8 000 r/min離心10 min，收集部分菌體加5×SDS蛋白電泳加樣緩沖液溶解，振蕩混勻，100℃煮沸5 min后，進行SDS-PAGE電泳，分離膠和濃縮膠的質(zhì)量濃度分別為12 g/dL和5 g/dL。另將菌體沉淀，用15 mL磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液 （pH 7.0）懸浮，冰浴超聲破碎細胞，超聲條件為：超聲破碎3 s，間隔5 s，200次；然后10 000 r/min離心10min，所得上清液為粗酶液，將破碎后所得的上清和沉淀均進SDS-PAGE檢測。在4℃下，用Ni-NAT親和層析柱純化目的蛋白質(zhì)，取5 mL粗酶液，加入經(jīng)結(jié)合液預處理的Ni-NAT瓊脂糖柱上，4℃靜置2 h；流川并用結(jié)合液清洗去除雜質(zhì)和雜蛋白質(zhì)；用洗脫液（500 mmol/L NaCl；250 mmol/L咪唑；20 mmol/L Tris-HCl；pH 7.9）洗脫，收集洗脫液，經(jīng)透析后獲得純化的reXyn11EM。將純化后的reXyn11EM進行SDSPAGE電泳分析。

1.6木聚糖酶活性測定

采用改進的DNS法［11］，在2.4 mL質(zhì)量分數(shù)為0.5%木聚糖溶液 （由pH 7.0的Na2HPO4-檸檬酸緩沖液配制）中加入0.1mL適當稀釋的酶液，65℃下反應(yīng)15min，加入2.5mL DNS試劑終止反應(yīng)，沸水浴中顯色7 min，測定OD540。在測定條件下（65℃、pH 7.0），以每分鐘產(chǎn)生1μmol還原糖所需的酶量定義為1個酶活單位（U）。以牛血清蛋白作為標準蛋白，采用Brandford法測定蛋白質(zhì)濃度［12］。

1.7酶學性質(zhì)的測定

1.7.1重組木聚糖酶最適反應(yīng)溫度及溫度穩(wěn)定性

取適當稀釋的酶液于50～80℃下進行反應(yīng)，每隔5℃按常規(guī)方法測定酶活，以酶活最高者為100%，繪制溫度-相對酶活性曲線；將酶液分別置于70、75、80℃保溫10、20、30、40、50、60min，按常規(guī)方法測定殘余酶活性，以未保溫（0 min）酶液的酶活性為100%，繪制時間-殘余酶活性曲線。

1.7.2重組木聚糖酶的最適反應(yīng)pH及pH穩(wěn)定性

在65℃下分別測定reXyn11EM在不同pH值下的酶活性，以酶活力最高者為100%，繪制pH-相對酶活性曲線；將酶液置于不同pH值緩沖液中于40℃保溫1 h，再按常規(guī)方法分別測定殘余酶活性，以酶活力最高者為100%，繪制pH-相對酶活性曲線。當殘余酶活達到85%以上，即定義為穩(wěn)定。反應(yīng)所用的緩沖液為：0.2 mol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液（pH 3.5～8.0）和0.05 mol/L甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液（pH 8.0～9.0）。

1.7.3金屬離子和EDTA對酶活性的影響將酶液與不同金屬離子或EDTA（終濃度為2.0 mmol/L）混合后于40℃保溫1 h，按常規(guī)方法測定殘余酶活性，以不加金屬離子的酶活性為100%，殘余酶活與其比值為相對酶活。

1.7.4動力學參數(shù)的測定分別以不同質(zhì)量濃度（1.0～10.0mg/mL）的木聚糖溶液（pH 7.0）為底物，在酶的最適反應(yīng)溫度下測定酶活性，按Lineweaver-Burk法作圖，計算重組酶的Km和Vmax。

2　結(jié)果與討論

2.1重組表達質(zhì)粒pET-28a-xyn11EM的構(gòu)建

按照1.4中的方法，將 pUCm-T-xyn11EM用EcoR I和Not I進行雙酶切，并進行瓊脂糖凝膠電泳分析，見圖1。在2.7 kb和570 bp處均可見DNA條帶，分別為線性化的pUCm-T和目的基因xyn11EM，將570 bp的條帶割膠回收后與經(jīng)同樣雙酶切的質(zhì)粒pET-28a（+）連接過夜，轉(zhuǎn)化E.coli BL21（DE3）。經(jīng)通用引物鑒定后，篩選得到重組質(zhì)粒pET-28a-xyn11EM，測序結(jié)果與預期一致。

圖1　pUCm-T-xyn11EM的EcoR I和Not I雙酶切電泳圖Fig.1　Double digestion of pUCm-T-xyn11EMby EcoR I and Not I

2.2大腸桿菌重組子的鑒定

以E.coli BL21/xyn11EM菌液為模板，利用通用引物 （T7-F和T7-R）做菌液PCR驗證，PCR產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量分數(shù)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，見圖2。E.coli BL21/xyn11EM的PCR產(chǎn)物的大小為900 bp左右（圖2泳道2～3），而對照組E.coli BL21/pET-28a PCR產(chǎn)物大小為300 bp左右 （圖2泳道1），表明xyn11EM已整合到E.coli BL21/xyn11EM基因組內(nèi)。

圖2　大腸桿菌重組子PCR驗證Fig.2　Verification of E.coli transformants by PCR

2.3重組木聚糖酶的表達和純化

挑選E.coli BL21/xyn11EM和E.coli BL21/pET-28a菌落，用IPTG誘導表達8 h，離心收集重組大腸桿菌菌體，經(jīng)超聲破碎后，離心所得上清液為粗酶液，用改良的DNS法測定木聚糖酶活性。結(jié)果顯示，E.coli BL21/xyn11EM粗酶液活性可達47.5 U/mL，而E.coli BL21/pET-28a并沒有檢測到木聚糖酶活性。將所得粗酶液用鎳金屬螯合層析柱純化后透析獲得純化的reXyn11EM，測得比酶活為55 U/mg。SDSPAGE結(jié)果顯示，超聲破碎后離心收集的沉淀中幾乎無目的蛋白質(zhì)而上清液中目的蛋白質(zhì)條帶明顯，表明超聲破碎效果較好 （圖3泳道2～3），E.coli BL21/xyn11EM表達產(chǎn)物的表觀相對分子質(zhì)量約為24 800（圖3泳道1～2，5），而對照E.coli BL21/ pET-28a在24 800處無條帶（圖3泳道4），純化后的reXyn11EM呈單一條帶（圖3泳道5）。

2.4重組木聚糖酶酶學性質(zhì)

2.4.1酶的最適反應(yīng)溫度及熱穩(wěn)定性由圖4（a）可以看出，在65～75℃范圍內(nèi)reXyn11EM有較高的催化活性，其最適反應(yīng)溫度為70℃；由圖4（b）可知，reXyn11EM具有較好的熱穩(wěn)定性，70℃保溫60 min可保留78.2%的酶活性；在75℃的半衰期（t1/275）為54min，保溫60min仍可保留46.8%的酶活性。80℃下的半衰期（t1/280）為28 min，保溫60 min仍可保留28.6%的酶活性。Cheng等［9］將耐熱酶基因xyl11在畢赤酵母 （P.pastoris）KM71H中進行了表達，結(jié)果表明：最適反應(yīng)溫度為70℃，在70℃下保溫60 min，可保留90%以上的酶活性；保溫3 h，殘余酶活還剩70%多。前者與后者相比，最適反應(yīng)溫度相同，但熱穩(wěn)定性稍差。這可能是由于基因xyl11中包含了一段編碼C端結(jié)合域的序列，而C端結(jié)合域可能對酶的穩(wěn)定性起到了積極的作用［13-14］；也可能與xyl11在畢赤酵母KM71H表達的過程中發(fā)生了N-糖基化有關(guān)，N-糖基化對溫度穩(wěn)定性的提高起到了作用［15］。

圖3　表達產(chǎn)物SDS-PAGE分析Fig.3　SDS-PAGE analysis of expressed products

圖4　reXyn11EM最適反應(yīng)溫度及溫度穩(wěn)定性Fig.4　Optimal tem perature　and　thermostability　of reXyn11EM

2.4.2酶的最適反應(yīng)pH及pH穩(wěn)定性reXyn11EM的最適反應(yīng)pH和pH穩(wěn)定性見圖5。在pH 5.5～7.0的范圍內(nèi)，reXyn11EM的催化活性較高，最適反應(yīng)pH為6.5～7.0，與已有文獻報道一致［9］。該酶在pH 5.0～8.0的范圍內(nèi)穩(wěn)定，當pH低于5.0或高于8.0時，酶的穩(wěn)定性較差。

圖5　reXyn11EM的最適反應(yīng)pH及pH穩(wěn)定性Fig.5　Optimal pH and stability of reXyn11EM

2.4.3金屬離子對酶活性的影響如圖6所示，大多數(shù)金屬離子和EDTA對reXyn11EM的活性影響不大，說明該酶對大部分金屬離子都具有良好的抗性，在工業(yè)中具有較好的應(yīng)用價值。

圖6　金屬離子和EDTA對reXyn11EM酶活性的影響Fig.6　Effects ofmetal ions and EDTA on the activity of reXyn11EM

2.4.4動力學常數(shù)reXyn11EM對木糖的Km和Vmax值分別為7.2 mg/mL和54.7 U/mg。

3　結(jié)語

耐熱木聚糖酶有著重要的工業(yè)應(yīng)用價值，通過基因工程技術(shù)實現(xiàn)木聚糖酶的異源高效表達是降低其工業(yè)應(yīng)用成本、適應(yīng)工業(yè)應(yīng)用條件的有效手段。目前已經(jīng)有許多耐熱木聚糖酶在大腸桿菌中表達，Li等通過人工合成的方法獲得耐熱木聚糖酶基因Syxyn11E，并在E.coli中進行了表達，其酶活為17.8 U/mL［6］。本研究成功實現(xiàn)了11家族耐熱木聚糖酶基因xyn11EM在E.coli BL21（DE3）中的表達，酶活可高達47.5 U/mL。SDS-PAGE表明，reXyn11EM的表觀相對分子質(zhì)量約為24 800；酶學性質(zhì)研究表明，該酶的最適反應(yīng)溫度為70℃，并在70℃以下穩(wěn)定；最適反應(yīng)pH為7.0，在pH 5.0～8.0的范圍內(nèi)穩(wěn)定；大多數(shù)金屬離子和EDTA對該重組酶的活性影響較小，這些優(yōu)良的酶學特性表明了該酶具有廣泛的應(yīng)用潛力。

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會議信息

會議名稱（中文）：2016全國多糖研討會

所屬學科：有機化學，化學生物學，生物物理學、生物化學及分子生物學

開始日期：2016-10-20結(jié)束日期：2016-10-22

所在城市：上海市黃浦區(qū)

主辦單位：中國化學會

承辦單位：中國科學院上海藥物研究所

主題：多糖分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定，中藥多糖質(zhì)量控制，寡糖合成，多糖活性與構(gòu)效關(guān)系研究

聯(lián)系人：曲歡歡

聯(lián)系電話：021-50806600-3203

E-MAIL：quhuanhuan@simm.ac.cn

通訊地址：上海市浦東新區(qū)祖沖之路555號

郵政編碼：201203

會議網(wǎng)站：http://www.chemsoc.org.cn/Meeting/Home/info.asp？id=160

內(nèi)容及范圍：研討會宗旨是為全球糖化學與糖生物學研究工作者提供平臺進行學術(shù)交流，溝通研究信息，切磋經(jīng)驗體會，加快國內(nèi)糖科學的發(fā)展，促進糖科學的研究，加強中國與國際一流研究機構(gòu)和科學家在糖化學和糖生物學領(lǐng)域的合作。

Expression of the Thermotolerant Xylanase Gene xyn11EMin Escherichia coli

HE Yao1，YIN Xin1，WU Qin1，WU Minchen*2
（1.School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.Wuxi Medicine School，Jiangnan University，Wuxi214122，China）

A codon-optim ized gene（named xyn11EM），which encodes a thermotolerant xylanase belonging to the glycoside hydrolase fam ily 11，was synthesized，and cloned into the expression plasmid pET-28a（+）.The recombinant Escherichia coli（designated E.coli BL21/xyn11EM），expressing the thermostable xylanase，was constructed by transform ing the recombinant plasm id，pET-28a-xyn11EM，into E.coli BL21（DE3）.The recombinant E.coli BL21/xyn11EMwas induced w ith IPTG to express reXyn11EM.The reXyn11EMactivity reached 47.5 U/m L.The apparent molecular weight of reXyn11EMwas estimated to be 24 800 by SDS-PAGE analysis.Its optimal temperature and pH were 70℃ and 7.0，respectively.It was stable at a temperature of 70℃ or below，and ata pH range of 5.0～8.0.Itsactivity was notsignificantly affected bymostofmetal ions tested and EDTA.The Kmand Vmaxof reXyn11EMtoward birchwood xylan were 7.2mg/m L and 54.7 U/mg.Theexcellent thermostability of reXyn11EMmake ithasgreatpotential in industrialapplication.

thermostable xylanase，Escherichia coli，expression，enzymatic characterization

Q 786

A

1673—1689（2016）09—0935—06

2014-01-09

國家自然科學基金項目（31271811）。

鄔敏辰（1962—），男，江蘇無錫人，理學博士，教授，博士研究生導師，主要從事酶工程與基因工程方面的研究。E-mail：bioch@163.com