李應(yīng)宇，　呂永坤，　周景文，　堵國(guó)成，　陳　堅(jiān)*

（1.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122；2.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫214122）

釀酒酵母SPS途徑調(diào)控因子Stp1的泛素化過(guò)程

李應(yīng)宇1，2，呂永坤1，2，周景文1，2，堵國(guó)成1，2，陳堅(jiān)*1，2

（1.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122；2.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫214122）

研究釀酒酵母SPS途徑關(guān)鍵調(diào)控因子Stp1p泛素化調(diào)控機(jī)制。通過(guò)構(gòu)建基于雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)的泛素化檢測(cè)載體、泛素化位點(diǎn)定點(diǎn)突變及突變體氨基酸利用這三個(gè)層面來(lái)研究Stp1p的泛素化過(guò)程。通過(guò)對(duì)Stp1p的潛在的4個(gè)泛素化位點(diǎn)突變結(jié)果表明，與Stp1p相比，各突變體的熒光強(qiáng)度均有一定程度的減弱，其中三重突變體Stp1K49，129，113R熒光強(qiáng)度明顯弱化。表明潛在的泛素化位點(diǎn)突變后，Stp1p的泛素化過(guò)程受到阻遏。進(jìn)一步的氨基酸利用實(shí)驗(yàn)表明，泛素化位點(diǎn)突變對(duì)于調(diào)控菌體氮源利用具有重要的作用。上述結(jié)果說(shuō)明，泛素化位點(diǎn)突變可以調(diào)控Stp1p的泛素化過(guò)程，進(jìn)而影響菌體氮源的利用。

SPS途徑；雙分子熒光互補(bǔ)；氮代謝阻遏；尿素，氨基酸

釀酒酵母細(xì)胞內(nèi)有著精確的代謝調(diào)控途徑，以保證其可以對(duì)外界環(huán)境的變化做出準(zhǔn)確的應(yīng)答，維持細(xì)胞的正常生長(zhǎng)［1］。當(dāng)培養(yǎng)基中存在偏好型氮源（如谷氨酰胺、天冬酰胺、銨鹽等）時(shí)，會(huì)抑制非偏好型氮源（如精氨酸、尿素、脯氨酸等）的利用。而當(dāng)這些偏好型氮源耗盡后，細(xì)胞才開始利用非偏好型氮源。這種優(yōu)勢(shì)氮源的存在抑制貧乏氮源利用的現(xiàn)象稱為氮代謝阻遏 （Nitrogen Catabolite Repression，NCR）［2］。除了NCR調(diào)控途徑，還有SPS信號(hào)途徑及泛素-蛋白酶解途徑。胞外的氨基酸信號(hào)可以通過(guò)SPS信號(hào)傳導(dǎo)至細(xì)胞核內(nèi)，從而激活相關(guān)透性酶（AAP）基因的表達(dá)［3］。SPS信號(hào)途徑主要由細(xì)胞膜上的Ssy1-Ptr3-Ssy5復(fù)合體、轉(zhuǎn)錄激活因子Stp1組成［4］。研究表明，調(diào)控因子Stp1同時(shí)也受到TOR途徑中的磷酸激酶復(fù)合體TORC1的調(diào)控［5］。胞外氮源的氮代謝調(diào)節(jié)分為兩個(gè)層面，一方面是基因轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)或抑制［6］，另一方面是細(xì)胞膜上氨基酸透性酶的穩(wěn)定與降解［7］。而且，細(xì)胞膜上的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的降解主要是通過(guò)泛素-蛋白酶解途徑被轉(zhuǎn)運(yùn)到液泡內(nèi)得以降解［8］。當(dāng)培養(yǎng)基中存在過(guò)量的甲硫氨酸時(shí)，會(huì)同時(shí)激活SPS信號(hào)途徑及甲硫氨酸代謝途徑［9］。甲硫氨酸代謝途徑中兩個(gè)關(guān)鍵的透性酶Mup1p和Mup3p能夠特異性轉(zhuǎn)運(yùn)甲硫氨酸，而SPS途徑下游的透性酶一般均為非特異性透性酶［10］。當(dāng)細(xì)胞中的甲硫氨酸足以維持生長(zhǎng)時(shí)，透性酶Mup1p和Mup3p會(huì)被轉(zhuǎn)運(yùn)至液泡內(nèi)降解［11］，見圖1。

圖1　SPS途徑中關(guān)鍵因子Stp1p的調(diào)控機(jī)理Fig.1　Regulation mechanism of key regulator Stp1p of SPS pathway

作者采用雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)檢測(cè)泛素化，基于雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)構(gòu)建了一個(gè)泛素化檢測(cè)載體，將待研究蛋白質(zhì)的編碼序列（去除終止密碼子）插入到檢測(cè)載體的多克隆位點(diǎn)，表達(dá)的蛋白質(zhì)末端帶有熒光分子的羧基端，表達(dá)的泛素分子末端帶有熒光分子的氨基端。如果待研究蛋白質(zhì)受到泛素化調(diào)控，則該蛋白質(zhì)與泛素分子的結(jié)合將使熒光分子的羧基端、氨基端重新結(jié)合成一個(gè)完整的熒光分子，因而在熒光顯微鏡下可以觀察到熒光。作者主要研究轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Stp1p的泛素化調(diào)控機(jī)制。根據(jù)泛素化位點(diǎn)在線軟件UbPred［12］預(yù)測(cè)Stp1p可能的泛素化位點(diǎn)，該軟件預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率達(dá)到72%。對(duì)于含有特定結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，其準(zhǔn)確率可高達(dá)85%［13］。通過(guò)定點(diǎn)突變的方法，研究泛素化位點(diǎn)突變對(duì)Stp1p泛素化的影響以及細(xì)胞對(duì)氨基酸利用的影響，在泛素化過(guò)程層面為深入研究釀酒酵母氮源代謝調(diào)控提供可靠的理論基礎(chǔ)及依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株與質(zhì)粒釀酒酵母 Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1D-Δubi4（MATαura3-52；trp1-289；leu2-3，112；his3Δ1；MAL2-8C；SUC2）和泛素化檢測(cè)載體pUbDetec16：作者所在研究室構(gòu)建［14］。大腸桿菌E.coli JM109用于質(zhì)粒載體構(gòu)建。

1.1.2培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件YNB液體培養(yǎng)基：1.74 g/L酵母基礎(chǔ)氮源（不含氨基酸，不含硫酸氨），20 g/LD-glucose，5 g/L硫氨酸。亮氨酸、尿嘧啶雙缺陷型培養(yǎng)基 （DM-leu-，ura-）：YNB培養(yǎng)基中添加50 μg/mL組氨酸、50μg/mL色氨酸。YNB完全培養(yǎng)基：YNB培養(yǎng)基中添加50μg/mL組氨酸、50μg/mL色氨酸、50μg/mL亮氨酸、50μg/mL尿嘧啶。YPD培養(yǎng)基：20 g葡萄糖，20 g蛋白胨，10 g酵母粉，定容至1 L。LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母粉5 g，氯化鈉10 g，調(diào)節(jié)pH至7.0，定容至1 L。固體培養(yǎng)基為相應(yīng)的液體培養(yǎng)基中加入20 g/L瓊脂粉。

E.coli JM109培養(yǎng)條件：從LB平板上挑取E.coli JM109單菌落至加有20 mL LB的250 mL的搖瓶中，置于37℃轉(zhuǎn)速為200 r/min的搖床上培養(yǎng)。S.cerevisiae CEN.PK2-1D-Δubi4培養(yǎng)條件：1）化學(xué)法轉(zhuǎn)化培養(yǎng)條件：挑取S.cerevisiae CEN.PK2-1D-Δubi4單菌落至含有20 mL YPD的250 mL的搖瓶，置于30℃轉(zhuǎn)速為200 r/min的搖床上培養(yǎng)12～16 h，離心收集細(xì)胞制備感受態(tài)。2）生理實(shí)驗(yàn)養(yǎng)條件：從斜面中接種一環(huán)S.cerevisiae CEN.PK2-1D-Δubi4細(xì)胞于20 mL加有色氨酸和組氨酸的YNB培養(yǎng)基中，置于30℃轉(zhuǎn)速為200 r/min的搖床上。生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)中期，以5%的轉(zhuǎn)接體積分?jǐn)?shù)轉(zhuǎn)接入含有20mL的YNB的培養(yǎng)基（加入了生長(zhǎng)所必需的氨基酸）中，于30℃轉(zhuǎn)速為200 r/min的搖床上生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)期離心收集細(xì)胞。用無(wú)菌水洗滌2次后，在磷酸鹽緩沖液中（與所取菌液等體積）重懸后制作玻片觀察熒光。

1.1.3主要試劑與儀器S.cerevisiae總DNA的提取、感受態(tài)的制備以及質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化：醋酸鋰轉(zhuǎn)化法［15］；E.coli JM109感受態(tài)的制備：使用上海生工有限公司一步法制備大腸桿菌感受態(tài)試劑盒；大腸桿菌質(zhì)粒的提?。荷虾Ｉび邢薰举|(zhì)粒提取試劑盒；DNA的片段回收和純化：Fermentas公司相關(guān)的試劑盒；限制性內(nèi)切酶、連接酶和DNA聚合酶等：大連寶生物有限公司。

1.2方法

1.2.1pUbDetec16系列表達(dá)載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)化

根據(jù)NCBI上發(fā)布的S.cerevisiae S228C的STP1基因（GenBank accession number：NC_001136）序列設(shè)計(jì)引物，用于從S.cerevisiae基因組中擴(kuò)增基因和重組質(zhì)粒的鑒定，見表1。引物兩端分別加有限制性內(nèi)切酶EcoR I和Sma I。用限制性內(nèi)切酶分別酶切載體pUbDetec16和PCR反應(yīng)的產(chǎn)物，把經(jīng)過(guò)純化的線性化的質(zhì)粒和目標(biāo)DNA片段以1∶4的比例混合，16℃連接過(guò)夜。將連接混合液轉(zhuǎn)化E.coli JM109涂布在含有100μg/mL氨芐青霉素的LB平板上，12 h后隨機(jī)挑選克隆子進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證。挑選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子送上海生工測(cè)序。挑選測(cè)序正確的重組質(zhì)粒利用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化S.cerevisiae CEN.PK2-1DΔubi4，涂布DM-leu-，ura-平板。于30℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)3～4 d，挑選單菌落進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證后接種相應(yīng)的液體培養(yǎng)基，待生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期轉(zhuǎn)接以便于后續(xù)試驗(yàn)。

表1　STP1定點(diǎn)突變所用引物Table 1　Primers used for the site directed mutagenesis of STP1

1.2.2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子熒光檢測(cè)待研究蛋白編碼基因（不含終止密碼子）插入至pUbDetec16多克隆位點(diǎn)處，使用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化 S.cerevisiae CEN.PK2-1D-Δubi4。涂布DM-leu-，ura-平板，3～4 d后挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證。將陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子接DM-leu-，ura-液體培養(yǎng)基，待生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)中期時(shí)，于8 000 r/min離心5min去上清液。用無(wú)菌水洗滌細(xì)胞，重新在添加有相應(yīng)氨基酸的YNB培養(yǎng)基中重懸菌體，30℃、200 r/min繼續(xù)培養(yǎng)90 min。使用分光光度計(jì)測(cè)定OD600，并取200 uL于96孔全黑酶標(biāo)板，在發(fā)射光/激發(fā)光為485/524條件下檢測(cè)熒光強(qiáng)度。檢測(cè)熒光前需對(duì)菌懸液進(jìn)行預(yù)處理。取適量菌懸液，離心去上清液。再用磷酸鹽PBS洗滌細(xì)胞，再次離心去上清液，最后再用等體積PBS重懸菌體，取200 uL于全黑的熒光酶標(biāo)板上檢測(cè)，分別計(jì)算其置信度。

1.2.3泛素化位點(diǎn)定點(diǎn)突變通過(guò)泛素化檢測(cè)表明調(diào)控因子Stp1p受到泛素化調(diào)控。使用在線泛素化位點(diǎn)預(yù)測(cè)軟件UbPred對(duì)Stp1p的泛素化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，其中潛在的泛素化位點(diǎn)有第49、60、113、129位賴氨酸。分別對(duì)這4個(gè)賴氨酸位點(diǎn)進(jìn)行突變，得到7個(gè)突變體組合：Stp1pK49R，Stp1pK60R，Stp1pK113R，Stp1pK129R，Stp1pK49，129R，Stp1pK49，129，113R，Stp1pK49，60，113，129R。分別計(jì)算各突變體的熒光強(qiáng)度變化率（CR）。

其中，F(xiàn)陽(yáng)為陽(yáng)性對(duì)照的單位熒光強(qiáng)度；F突變體為突變體的單位熒光強(qiáng)度；F陰為陰性對(duì)照的單位熒光強(qiáng)度。

1.2.4系列突變體對(duì)釀酒酵母氮源利用的影響將 活 化 的 pUbDetec16、Stp1p及 系 列 突 變 株Stp1pK49，129R、Stp1pK49，113，129R、Stp1pK49，60，113，129R接種 YNB液體培養(yǎng)基（不添加硫酸銨），并添加以下10種氨基酸Asn、Gln、Phe、Met、Trp、Leu、Arg、Pro、Ala，各種氨基酸的終濃度均為5 mmol/L，置于30℃，200 r/min搖床培養(yǎng)48 h。分別在接種前及培養(yǎng)完成后取樣，通過(guò)各種氨基酸的利用率來(lái)研究突變質(zhì)粒對(duì)于菌體氮源利用的影響。

2　結(jié)果與討論

2.1重組質(zhì)粒的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化

以S.cerevisiae CEN.PK2-1D全基因組為模板，PCR擴(kuò)增出STP1的基因片段。將PCR擴(kuò)增所得的基因片段連接到pMD-T Simple Vector上測(cè)序驗(yàn)證，測(cè)序結(jié)果與NCBI的序列一致。隨后將STP1插入質(zhì)粒pUbDetec16，獲得重組質(zhì)粒pUbDetec16-STP1。把重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化S.cerevisiae CEN.PK2-1DΔubi4，隨后挑取轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證。可以擴(kuò)增到目的條帶，表明重組菌構(gòu)建成功。

2.2調(diào)控因子Stp1p熒光檢測(cè)

將Stp1p系列突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)化S.cerevisiae CEN. PK2-1D-Δubi4，于YNB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。由于酪蛋白水解物中含有豐富的氨基酸，通過(guò)在培養(yǎng)基中添加0.25%的酪蛋白水解物能夠誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的泛素化，從而能夠增強(qiáng)陰性對(duì)照及陽(yáng)性對(duì)照間的差異。將活化的菌體接種DM-leu-和ura-，于30℃、200 r/min搖床培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。添加0.25%酪蛋白水解物后繼續(xù)培養(yǎng)90min，制作玻片觀察熒光。以空載體pUbDtect16為陰性對(duì)照；Gap1p受到泛素化調(diào)控，故以其陽(yáng)性對(duì)照。在熒光顯微鏡下，陰性對(duì)照檢測(cè)不到熒光；陽(yáng)性對(duì)照有較強(qiáng)的熒光信號(hào)，見圖2。熒光檢測(cè)及泛素化置信度比較結(jié)果表明調(diào)控因子Stp1p受到泛素化過(guò)程調(diào)控。

圖2　Stp1p及對(duì)照熒光圖片F(xiàn)ig.2　Fluorescence of Stp1p and the control

2.3泛素化位點(diǎn)定點(diǎn)突變及其對(duì)Stp1p泛素化的影響

圖3結(jié)果表明，分別將調(diào)控因子Stp1p的第49、60、113、129位賴氨酸突變?yōu)榫彼岷?，各突變體熒光強(qiáng)度均有一定程度的減弱。單點(diǎn)突變體中，第49、60、129位賴氨酸位點(diǎn)突變后，其熒光強(qiáng)度均有一定程度的減弱。而第113位賴氨酸位點(diǎn)突變?yōu)榫彼岷?，熒光?qiáng)度減弱明顯，表明113位的賴氨酸位點(diǎn)是其潛在的泛素化位點(diǎn)。進(jìn)一步復(fù)合突變后發(fā)現(xiàn)，三重突變體Stp1pK49，113，129R的熒光強(qiáng)度進(jìn)一步減弱。與三重突變相比，四重突變Stp1pK49，60，113，129R的熒光強(qiáng)度則沒(méi)有明顯的變化。結(jié)合單點(diǎn)突變的結(jié)果，表明第60位的賴氨酸可能并不是其泛素化位點(diǎn)。另一方面表明賴氨酸位點(diǎn)突變能夠影響Stp1p的泛素化調(diào)控過(guò)程。

圖3　調(diào)控因子Stp1p突變體熒光強(qiáng)度的變化Fig.3　Change fold of fluorescence of Stp1p mutant strains

2.4Stp1p泛素化對(duì)氨基酸利用的影響

Stp1p是SPS途徑中關(guān)鍵的調(diào)控因子，胞外的氨基酸信號(hào)通過(guò)細(xì)胞膜上的Ssy1-Ptr3-Ssy5復(fù)合體傳至調(diào)控因子Stp1p，再由Stp1p進(jìn)入核內(nèi)調(diào)控相關(guān)透性酶基因的表達(dá)。由于Stp1p能夠調(diào)控的許多透性酶基因的表達(dá)，因此過(guò)量表達(dá)Stp1p將會(huì)影響酵母胞外氨基酸的吸收利用。如表2所示，相比于對(duì)照組，Stp1p及突變體在天冬酰胺、谷氨酰胺、甲硫氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸這6種氨基酸利用水平有較為顯著的提升。而在Stp1p及系列突變體的比較中顯示，三重突變體與四重突變體的氨基酸利用水平變化不太顯著。分析其原因可能是由于泛素化預(yù)測(cè)軟件的準(zhǔn)確還有待提高，即第60位的賴氨酸位點(diǎn)并不是其泛素化位點(diǎn)。結(jié)合突變體熒光強(qiáng)度試驗(yàn)的結(jié)果，第60位的賴氨酸單點(diǎn)突變的熒光強(qiáng)度較弱，并且三重突變體和四重突變體的熒光強(qiáng)度幾乎一致。

此外，酵母菌這9種氨基酸利用水平的差異還可能與相關(guān)透性酶的表達(dá)量及菌體對(duì)氨基酸的偏好性吸收有關(guān)。如甲硫氨酸為多肽合成的起始氨基酸；亮氨酸是一種主要的支鏈氨基酸，能夠加速菌體新陳代謝，因而在菌體代謝旺盛過(guò)程中需要大量的吸收利用；天冬酰胺、谷氨酰胺等為偏好型氮源，酵母菌的氮源利用由于NCR效應(yīng)而選擇性的利用優(yōu)勢(shì)氮源，從而抑制非偏好型氮源（如精氨酸、脯氨酸）的利用。氨基酸利用水平幾乎沒(méi)有變化的可能與其他代謝途徑如TOR途徑等代謝調(diào)控途徑有關(guān)。

表2　突變體對(duì)氨基酸利用的影響Table 2　Effect ofmutants on am ino acid utilization

3　結(jié)語(yǔ)

通過(guò)構(gòu)建S.cerevisiae細(xì)胞中SPS途徑調(diào)控因子Stp1p的泛素化檢測(cè)重組質(zhì)粒。針對(duì)調(diào)控因子Stp1p，作者通過(guò)構(gòu)建泛素化檢測(cè)重組質(zhì)粒、泛素化位點(diǎn)定點(diǎn)突變、氨基酸檢測(cè)實(shí)驗(yàn)來(lái)研究其泛素化調(diào)控過(guò)程對(duì)于菌體氮源利用的影響。通過(guò)熒光強(qiáng)度檢測(cè)表明調(diào)控因子Stp1p能夠受到泛素化調(diào)控。為了研究其泛素化位點(diǎn)對(duì)其調(diào)控功能的影響，通過(guò)泛素化位點(diǎn)定點(diǎn)突變及系列突變體氨基酸利用水平來(lái)研究其泛素化調(diào)控。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同突變體的熒光強(qiáng)度都有所不同，其中三重突變體的熒光強(qiáng)度變化最為明顯，而四重突變體與三重突變體相比幾乎沒(méi)有變化，表明第60為賴氨酸位點(diǎn)可能并不是其主要的泛素化位點(diǎn)。其次可以發(fā)現(xiàn)Stp1p的第113位賴氨酸位點(diǎn)突變能夠明顯影響其泛素化過(guò)程，其余位點(diǎn)的突變熒光強(qiáng)度變化則相對(duì)小，表明第113位的賴氨酸是其主要的泛素化位點(diǎn)之一。進(jìn)一步通過(guò)檢測(cè)突變體的氨基酸利用效率來(lái)研究其泛素化過(guò)程對(duì)于氮源利用的影響。結(jié)果表明，泛素化位點(diǎn)突變能夠影響菌體的氨基酸利用效率。本研究中所采用的方法對(duì)于構(gòu)建蛋白質(zhì)泛素化文庫(kù)具有重要意義，為未知蛋白的泛素化調(diào)控研究提供了新思路，能夠更深入的了解釀酒酵母氮代謝中的泛素化調(diào)控機(jī)理，對(duì)于工業(yè)化過(guò)程提高氮源利用率具有重要意義。

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Ubiquitination Process on Regulator of SPSPathway in Saccharomyces cerevisiae

LIYingyu1，2，LU Yongkun1，2，ZHOU Jingwen1，2，DU Guocheng1，2，CHEN Jian*1，2
（1.Key Laboratory of Industrial Biotechnology，M inistry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

The ubiquitinationmechanism of key regulator Stp1p was investigated in Saccharomyces cerevisiae.The ubiquitination detection vector was constructed based on the BiFC（Bimolecular fluorescence complementation）technology to assay the ubiquitination process of Stp1p.The site-directedmutagenesis on the potential ubiquitination siteswere performed to verify the effecton its ubiquitination regulation and the nitrogen utilization.The fluorescence levels ofmutant strains were down-regulated compared to the w ild type strain.Furthermore，the triplemutant Stp1K49，129，113Rachieved the lowest level among the all of the strains.The results indicated that the process of ubiquitination was significantly repressed by removing the potential ubiquitination residues.In addition，the am ino acid utilization assay implied the ubiquitination sites played a vital role on its ubiquitination process.The results presented here demonstrated that the ubiquitination processwas invovled in the regulation of Stp1p by site-directedmutagenesis of potentialubiquitination sites and thus impact thenitrogen utilization process.

SPSpathway，bimolecular fluorescence complementation，nitrogen catabolite repression，urea，am ino acid

Q 93

A

1673—1689（2016）09—0907—06

2014-09-23

國(guó)家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目（31130043）；國(guó)家973計(jì)劃項(xiàng)目（2012CB720802）。

陳堅(jiān)（1962—），男，江蘇揚(yáng)州人，工學(xué)博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事食品生物技術(shù)和生化工程方面的研究。E-mail：jchen@jiangnan.edu.cn