閆曉娜 田 敏 王彩霞 張 瑩

(1.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)研究所，富陽(yáng) 311400； 2.國(guó)家林業(yè)局哈爾濱林業(yè)機(jī)械研究所，哈爾濱 150086； 3.浙江省林木育種技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，富陽(yáng) 311400)

野生扇脈杓蘭植株生長(zhǎng)特性及大孢子超微結(jié)構(gòu)的研究

閆曉娜1,2田 敏1,3*王彩霞1張 瑩1

(1.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)研究所，富陽(yáng) 311400；2.國(guó)家林業(yè)局哈爾濱林業(yè)機(jī)械研究所，哈爾濱 150086；3.浙江省林木育種技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，富陽(yáng) 311400)

為了解扇脈杓蘭的生長(zhǎng)特性，本研究以浙江省西天目山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)內(nèi)的兩個(gè)野生居群為試材，對(duì)其休眠芽形態(tài)結(jié)構(gòu)、植株生長(zhǎng)過程和胚珠發(fā)育等特征進(jìn)行定期觀察。結(jié)果表明：扇脈杓蘭一個(gè)生長(zhǎng)周期包括萌芽期、開花展葉期、結(jié)實(shí)期和衰亡期4個(gè)階段，歷時(shí)1年，以分株繁殖為主，有性生殖能力差。扇脈杓蘭每個(gè)基株分化一個(gè)休眠芽，當(dāng)年10月露出地面。充分發(fā)育的休眠芽產(chǎn)生花芽，第二年4月形成花結(jié)構(gòu)；未充分發(fā)育的個(gè)體不能產(chǎn)生花芽，無生殖器官發(fā)育。胚珠超微結(jié)構(gòu)顯示：孢原細(xì)胞核占據(jù)多半的細(xì)胞空間，細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞器豐富。大孢子母細(xì)胞位于珠孔端，細(xì)胞質(zhì)中液泡、線粒體和質(zhì)體分布密集。在大孢子囊中，液泡所占空間變大，細(xì)胞核相對(duì)變小，細(xì)胞質(zhì)分布稀疏，細(xì)胞器以線粒體和質(zhì)體為主，在胚珠發(fā)育階段蛋白質(zhì)和多糖一直存在，淀粉染色逐漸加深，無脂質(zhì)存在。

扇脈杓蘭；芽發(fā)育；生長(zhǎng)周期；大孢子超微結(jié)構(gòu)

蘭科(Orchidaceae)是被子植物的第二大科，有花植物最大的科之一，在系統(tǒng)演化上屬于最高級(jí)、最進(jìn)化的類群，全世界約1 000屬近20 000余種，廣泛分布于全球除極端地區(qū)之外的陸地生態(tài)系統(tǒng)中，是生物多樣性的重要組成部分[1]。杓蘭屬(CypripediumL.)植物花大艷麗，唇瓣大而顯著，特化為深囊狀，是蘭科名貴的觀賞屬花卉之一[2]。扇脈杓蘭(CypripediumjaponicumThunb.)是杓蘭屬溫帶地生蘭，主要分布于中國(guó)陜西、浙江、安徽、江西、四川、臺(tái)灣等地[3]，境外僅見日本、韓國(guó)、緬甸有分布。扇脈杓蘭植株挺拔，葉型圓潤(rùn)，花型獨(dú)特，具有很高的觀賞價(jià)值，同時(shí)其根狀莖和帶根全草入藥，對(duì)治療跌打損傷、祛風(fēng)鎮(zhèn)痛有顯著療效，是珍貴的野生藥用和觀賞植物[3～5]。

野外生境下，扇脈杓蘭結(jié)實(shí)率僅為5%[6]，有性生殖能力低下，主要依靠無性生殖繁衍后代。然而，由于自身更新能力差及生境的人為采挖破壞，野生扇脈杓蘭居群數(shù)量銳減，分株繁殖已不足以維持其種群的穩(wěn)定。目前，扇脈杓蘭已被《國(guó)家重點(diǎn)保護(hù)野生植物(第二批)》列為一級(jí)保護(hù)植物，被世界自然保護(hù)聯(lián)盟(IUCN)瀕危物種紅色目錄列為“瀕?！蔽锓N[7]。因此，開展野生扇脈杓蘭植物資源的保育工作迫在眉睫。本研究通過對(duì)野生植株生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)的觀察，旨在揭示扇脈杓蘭植株整個(gè)生長(zhǎng)過程、芽發(fā)育、胚珠發(fā)育等特征，系統(tǒng)地掌握扇脈杓蘭的生長(zhǎng)特性，進(jìn)一步了解野生植株的天然更新方式和有性生殖困難的原因，為野生扇脈杓蘭的瀕危保護(hù)和合理開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料選自浙江省臨安市境內(nèi)西天目山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)(119°23′47″～119°28′27″E,30°18′30″～30°24′55″N)內(nèi)兩個(gè)數(shù)量較多的野生扇脈杓蘭居群，分別記為居群1、居群2。居群1約90株，地理坐標(biāo)為東經(jīng)119°25′35.2″，北緯30°18′30″，海拔1 033 m，主要伴生植物為牛蒡(Arctiumlappa)、箬竹(Indocalamustessellatus)等；居群2位于東經(jīng)119°27′6.4″，北緯30°23′36.3″，海拔1 018 m，約50株，伴生有六角蓮(Dysosmapleiantha)、交讓木(Daphniphyllummacropodum)等。試驗(yàn)地屬亞熱帶季風(fēng)氣候，年均降雨量為1 390～1 870 mm，空氣相對(duì)濕度為76%～81%[6]。土壤成分以有機(jī)質(zhì)為主，含氮、磷、鉀等微量元素，土壤pH為4.45～5.38。

1.2 研究方法1.2.1 扇脈杓蘭生長(zhǎng)過程及芽形態(tài)觀察

于2013年10～12月，每隔20天采集一次扇脈杓蘭的休眠芽8～10個(gè)，對(duì)芽進(jìn)行外觀特征的觀察和比較，并在Olympus SZ61型光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行解剖觀察，再經(jīng)過FAA固定過夜，采用石蠟切片法，在Olympus CX41型光鏡下觀察芽的顯微結(jié)構(gòu)并拍照。于2014年3月初，每隔10天對(duì)野生扇脈杓蘭植株的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)進(jìn)行觀察和拍照，直至植株凋亡為止。

1.2.2 扇脈杓蘭胚珠中大孢子超微結(jié)構(gòu)的觀察

2014年4月盛花期人工授粉之后，每10天采集一次發(fā)育過程中的果實(shí)4～6個(gè)，切成2～3 mm的小段，去掉果皮，置于2.5%戊二醛溶液中4℃下固定過夜，磷酸緩沖液沖洗3次后(每次間隔15 min)，1%的鋨酸溶液再固定1～2 h，再次用磷酸緩沖液沖洗3次，經(jīng)梯度酒精脫水(30%，50%，70%，85%，95%，100%)，環(huán)氧丙烷過渡，用樹脂浸透和包埋。將處理好的樣品先用玻璃刀作半薄切片(厚2 μm)以確定位置，再用鉆石刀作超薄切片(厚80 nm)，銅網(wǎng)收集，經(jīng)醋酸雙氧鈾50%乙醇飽和溶液和檸檬酸鉛雙染，在Hitachi H-7650型透射電鏡下觀察、拍照。

1.2.3 胚珠組織化學(xué)成分的測(cè)定

組織化學(xué)染色方法參照《植物顯微技術(shù)》[8]。將授粉后每隔10天采回的果實(shí)切成3～4 mm的小段，用FAA固定過夜，制作組織切片。多糖鑒定采用PAS反應(yīng)(高碘酸-Schiff反應(yīng))，顏色由無色變?yōu)樽霞t色；淀粉采用碘—碘化鉀法，變?yōu)樽仙?；蛋白質(zhì)亦采用碘—碘化鉀法，藥品配方與前者不同，含蛋白質(zhì)的細(xì)胞呈現(xiàn)亮黃色；脂肪測(cè)定用蘇丹Ⅲ，顏色變?yōu)槌赛S色。

2 結(jié)果與分析

2.1 扇脈杓蘭花芽形態(tài)及發(fā)育

扇脈杓蘭根狀莖沿土層方向平行生長(zhǎng)，地下深度約10～15 cm。根狀莖細(xì)長(zhǎng)且分節(jié)，頂端長(zhǎng)有一個(gè)休眠芽(圖1:A)。休眠芽在當(dāng)年植株枯落前開始生長(zhǎng)，第一年10月中下旬露出地面，隨后進(jìn)入休眠狀態(tài)，于第二年3～4月復(fù)蘇生長(zhǎng)。當(dāng)年生休眠芽淺黃綠色(圖1:B)，有3～4層互生的芽鞘包被。在Olympus SZ61型光鏡下觀察芽的縱切面，可看到花芽呈乳白色，其左右對(duì)稱分布著兩塊膠粘物質(zhì)(圖1:C)，它們可能是花粉塊的前身。第二年春季，休眠芽顏色逐漸變綠，并突破芽鞘(圖1:D)。

同一時(shí)期的休眠芽在芽長(zhǎng)等外觀形態(tài)上略有差異(圖1:E,F)，這是不同個(gè)體對(duì)養(yǎng)分吸收和利用的潛力不同所導(dǎo)致的。通過石蠟切片觀察當(dāng)年生休眠芽顯微結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示花芽由芽鞘包圍，周圍已分化出2～3枚幼葉，且解剖結(jié)構(gòu)不隨當(dāng)年采樣時(shí)間的推移而發(fā)生變化(圖1:G,H)，這說明隨著氣溫下降，植株開始越冬休眠，花芽組織不再分化。

在當(dāng)年同一采樣時(shí)期，有些個(gè)體能充分發(fā)育產(chǎn)生花芽，而有的個(gè)體無花芽產(chǎn)生，只有鮮黃色的幼葉(圖1:I,J)?；ㄑ堪l(fā)育的個(gè)體幼葉在芽休眠之前逐漸轉(zhuǎn)綠，而無花芽的個(gè)體幼葉顏色無明顯變化(圖1:K)。有無花芽的發(fā)育直接決定花器官能否形成，無花芽的植株最終只分化出扇形葉片，不能形成繁殖器官，更不能產(chǎn)生后代。

圖1 扇脈杓蘭的芽 A～B.休眠芽；C.芽縱切面；D.休眠芽轉(zhuǎn)綠；E～F.同一時(shí)期芽形態(tài)比較；G～H.不同時(shí)期花芽顯微結(jié)構(gòu)；I～J.有花芽和無花芽的個(gè)體；K.有花芽的個(gè)體幼葉變綠Fig.1 Bud of C.japonicum A-B. Dormant buds；C. Longitudinal section of bud；D. Dormant buds turned green；E-F. Comparation of bud morphology at the same stage；G-H. Microstructure of buds at different stages；I-J. Individuals of buds and non-buds；K. The leave of individuals that have buds turned green

2.2 扇脈杓蘭植株生長(zhǎng)發(fā)育周期

野生扇脈杓蘭主要通過分株的方式繁殖后代。與無距蝦脊蘭(Calanthetsoongiana)每個(gè)基株當(dāng)年可形成多個(gè)分株不同[9]，在扇脈杓蘭一個(gè)生長(zhǎng)周期內(nèi)，每個(gè)基株根狀莖上只有一個(gè)休眠芽發(fā)育，有花芽分化的休眠芽在翌年春天抽葶開花并結(jié)果，隨后果實(shí)衰老開裂，葉片枯萎，種子散盡。隨著根狀莖上新芽的分化，一個(gè)新的生長(zhǎng)周期開始。

通過對(duì)野生植株生長(zhǎng)發(fā)育特征的觀察，扇脈杓蘭大致可分為萌芽期、開花展葉期、結(jié)實(shí)期和衰亡期4個(gè)生長(zhǎng)階段。

(1)萌芽期：從當(dāng)年10月開始到次年4月初，根狀莖上的休眠芽伸長(zhǎng)生長(zhǎng)并露出地面(圖1:B)，經(jīng)過一個(gè)冬季的休眠，芽在3～4月繼續(xù)生長(zhǎng)，顏色由淺黃綠色變?yōu)槟劬G色(圖1:D)。含有花芽的植株向上生長(zhǎng)，隨后形成花、果等生殖結(jié)構(gòu)，不含花芽的個(gè)體成熟期只有葉片發(fā)育，不能產(chǎn)生生殖器官。在植株生境范圍內(nèi)，未發(fā)現(xiàn)有實(shí)生幼苗的存在，當(dāng)年種子散落后無萌發(fā)跡象。

(2)開花展葉期：次年4～5月，芽鞘逐漸脫落，花芽周圍包裹的幼葉裸露在外(圖2:A)。展葉初期，外部的2枚幼葉從底部逐漸向四周展開，葉片縱橫徑快速增長(zhǎng)。隨著展葉的進(jìn)行，花芽在葉內(nèi)側(cè)形成花蕾，單花花蕾與葉片近等高，由淺綠色的花萼和花瓣包被，先端呈閉合狀態(tài)[6](圖2:B)。展葉中期，葉片開展角度逐漸增大，花梗伸長(zhǎng)，花蕾膨大，葉狀花苞片逐漸開展，單花花序俯垂，其水平位置高于葉片，此時(shí)莖基部也略見伸長(zhǎng)生長(zhǎng)(圖2:C)。展葉末期，莖生長(zhǎng)顯著，直立挺拔，扇形葉生長(zhǎng)達(dá)到最大程度，位于整個(gè)植株近中部，2枚葉近對(duì)生，水平開展角度近180°，扇形輻射狀葉脈直達(dá)葉邊緣。花梗和子房生長(zhǎng)，頂生單花開放，2枚花瓣位于唇瓣的兩側(cè)，披針形，花瓣基部有紫色斑點(diǎn)分布(圖2:D)。未充分發(fā)育形成花芽的植株在展葉期結(jié)束也無花器官的形成(圖2:E)。

(3)結(jié)實(shí)期：次年6～8月，子房逐漸膨大形成果實(shí)。扇脈杓蘭花期持續(xù)14天左右[10]，在盛花期授粉后，子房開始增粗伸長(zhǎng)，隨后花完全枯萎(圖2:F)。授粉后前20天，子房進(jìn)入迅速增長(zhǎng)期，初期果實(shí)為淺綠色(圖2:G)，隨著果實(shí)體積的逐漸增長(zhǎng)，成熟期蒴果深綠色，具果棱(圖2:H)。

(4)衰亡期：9～10月，果皮細(xì)胞木栓化，果實(shí)由深綠色變?yōu)楹稚玔6]，果棱開裂，深棕色種子散出。葉片老化，枯黃脫落，植株衰亡(圖2:I)。

自然狀態(tài)下，扇脈杓蘭植株一個(gè)生長(zhǎng)周期歷時(shí)1年，以分株繁殖的方式維持種群的更替，種子繁殖能力差。每一基株上的休眠芽不能全部發(fā)育為花器官，從萌芽階段起就導(dǎo)致了部分個(gè)體不具有生殖發(fā)育的能力。

2.3 扇脈杓蘭胚珠中大孢子超微結(jié)構(gòu)的變化

扇脈杓蘭子房壁上著生成千上萬個(gè)胚珠，成熟時(shí)發(fā)育為大量的種子。胚珠是雌性生殖細(xì)胞形成的場(chǎng)所。在大多數(shù)蘭科植物中，授粉作用可啟動(dòng)大孢子發(fā)生過程[11]。扇脈杓蘭授粉后胚珠原基開始發(fā)育，珠心細(xì)胞經(jīng)過減數(shù)分裂和有絲分裂過程，最終形成8核成熟胚囊，具體發(fā)育時(shí)間段見表1。

表1扇脈杓蘭授粉后胚珠發(fā)育各階段

Table1Post-pollinationdevelopmentaleventsinovulesofC.japonicum

授粉后天數(shù)Daysafterpollination(d)發(fā)育階段Developmentalstages0孢原細(xì)胞Archesporialcells10～15大孢子母細(xì)胞Megasporocyte20功能大孢子Functionalmegaspore20～302核胚囊Two?nucleateembryosac304核胚囊Four?nucleateembryosac30～408核胚囊Eight?nucleateembryosac

扇脈杓蘭胚珠中大孢子超微結(jié)構(gòu)顯示：授粉當(dāng)天，胚珠原基細(xì)胞代謝旺盛，孢原細(xì)胞位于胚珠原基的頂端且有一層表皮細(xì)胞包圍，細(xì)胞呈長(zhǎng)方形，體積較其他細(xì)胞大，細(xì)胞核占據(jù)大部分的細(xì)胞空間，核仁結(jié)構(gòu)明顯。與細(xì)胞核相對(duì)的一端細(xì)胞質(zhì)豐富，內(nèi)含一個(gè)大液泡和多種細(xì)胞器(圖3:A)。細(xì)胞核周圍也分布著密集的細(xì)胞質(zhì)，質(zhì)體、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器含量豐富，液泡較為缺乏(圖3:B)，這一時(shí)期細(xì)胞分裂旺盛，細(xì)胞器種類多，線粒體為細(xì)胞代謝提供充足的能量。

授粉后10～20 d，孢原細(xì)胞進(jìn)一步分裂(圖3:C)，生成的細(xì)胞最后只有一個(gè)形成大孢子母細(xì)胞。大孢子母細(xì)胞呈不規(guī)則菱形，位于珠孔端，核仁逐漸消失，核膜尚存。合點(diǎn)端液泡含量豐富，分布著大量線粒體和質(zhì)體(圖3:D)，這為大孢子的活動(dòng)提供了充分的養(yǎng)料和能源。此后，大孢子母細(xì)胞經(jīng)過兩次減數(shù)分裂，最終只有一個(gè)細(xì)胞形成功能大孢子，其余三個(gè)細(xì)胞退化。功能大孢子細(xì)胞質(zhì)空間內(nèi)分布大量質(zhì)體，質(zhì)體上逐漸積累淀粉粒(圖3:E)，成為主要的貯藏物質(zhì)。在大孢子囊中，液泡所占細(xì)胞空間逐漸變大，細(xì)胞核相對(duì)較小，細(xì)胞質(zhì)分布稀疏，內(nèi)含豐富的線粒體和質(zhì)體(圖3:F)，細(xì)胞代謝旺盛，為隨后的胚囊發(fā)育奠定了物質(zhì)條件。組織化學(xué)成分分析顯示，在大孢子發(fā)生的過程中蛋白質(zhì)和多糖一直存在，無脂質(zhì)成分，淀粉染色逐漸加深且集中在細(xì)胞膜周圍，這與超微結(jié)構(gòu)質(zhì)體分布區(qū)域一致。細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定的化學(xué)成分組成保證了代謝過程中充足的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供給，這對(duì)大孢子母細(xì)胞充分發(fā)育最終生成雌配子體至關(guān)重要。

3 討論

3.1 花芽發(fā)育

花芽是花分化的早期形態(tài)，是植物從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)折點(diǎn)。野生扇脈杓蘭的芽著生于根狀莖頂端，分節(jié)處基本無芽宿生。休眠芽越冬后開始分化，只有部分個(gè)體充分發(fā)育成花芽，它們可以進(jìn)行生殖生長(zhǎng)；而未充分發(fā)育的芽只能分化出葉片，隨植株衰老而枯落。這種花芽發(fā)育的差異現(xiàn)象可能是自然狀態(tài)下養(yǎng)分和空間的限制所導(dǎo)致的。群體內(nèi)發(fā)生選擇性敗育現(xiàn)象，優(yōu)勢(shì)個(gè)體能夠適應(yīng)生境，充分利用營(yíng)養(yǎng)和空間產(chǎn)生花芽，而其他個(gè)體則發(fā)育不良。只有部分植株可產(chǎn)生生殖器官，這嚴(yán)重影響了扇脈杓蘭的結(jié)實(shí)量。黃花杓蘭(Cypripediumflavum)雖然也是瀕危物種，但其花芽生殖機(jī)制對(duì)生境適應(yīng)性更強(qiáng)。在黃花杓蘭根狀莖上每節(jié)有一個(gè)芽，翌年分化為充分發(fā)育的二年芽和未充分發(fā)育的二年芽，此時(shí)又有新的一年芽產(chǎn)生和多年休眠芽宿存，這3種花芽發(fā)育途徑同時(shí)進(jìn)行，體現(xiàn)了植物適應(yīng)環(huán)境的靈活性[12]。

3.2 植物生長(zhǎng)周期

扇脈杓蘭一個(gè)生長(zhǎng)周期包括萌芽期、開花展葉期、結(jié)實(shí)期和衰亡期4個(gè)階段，歷時(shí)1年，生長(zhǎng)各

階段與季節(jié)變化相適應(yīng)。地上部分借助根狀莖進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)繁殖，根狀莖皮層發(fā)達(dá)，富含淀粉粒，是營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的儲(chǔ)備場(chǎng)所[13]。雖然每一個(gè)生長(zhǎng)周期內(nèi)都有新的分株產(chǎn)生，但是，扇脈杓蘭每個(gè)基株只產(chǎn)生一個(gè)休眠芽，且休眠芽不能全部發(fā)育為具有生殖器官的個(gè)體，這就導(dǎo)致了在有限的居群個(gè)體數(shù)量范圍內(nèi)有性繁殖能力的減弱。在杏黃兜蘭(Paphiopedilumarmeniacum)中，既可營(yíng)養(yǎng)繁殖也可種子繁殖，其中分蘗芽形成的分株較為持久，與母株連接較為緊密，而根狀莖形成的分株較為短暫，因?yàn)楦鶢钋o繁殖需要良好的資源和條件，其代價(jià)就是母株的死亡[14]。扇脈杓蘭就是以根狀莖的形式分株，在母株徹底衰亡前分株已開始萌芽，其分株通過營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)所積累的能量和物質(zhì)最終是要最大限度的實(shí)現(xiàn)有性生殖的成效。

扇脈杓蘭開花期唇瓣深囊狀，為傳粉昆蟲提供了駐足空間。孫海芹等[15]研究認(rèn)為，扇脈杓蘭主要的傳粉昆蟲是熊峰。劉芬等[10]對(duì)天目山地區(qū)扇脈杓蘭繁育系統(tǒng)的研究中發(fā)現(xiàn)，其自然結(jié)實(shí)率較低，而人工授粉后自交和異交均親和，且結(jié)實(shí)率大大提高，說明該地區(qū)傳粉過程受限制或缺少有效的傳粉者。傳粉的成敗直接決定種子能否形成，因此，在盛花期進(jìn)行人工授粉將有助于推進(jìn)扇脈杓蘭野生植株的生殖發(fā)育過程。

3.3 胚珠發(fā)育

胚珠中形成的成熟胚囊是有性繁殖的雌配子體，其結(jié)構(gòu)發(fā)育的程度直接影響雌性細(xì)胞的生成、花粉管伸長(zhǎng)和受精作用。扇脈杓蘭大孢子超微結(jié)構(gòu)顯示，有些細(xì)胞發(fā)育不完全，核結(jié)構(gòu)扭曲紊亂或產(chǎn)生空腔，但這些異常細(xì)胞占總數(shù)的比重較小，不影響胚珠的正常發(fā)育。劉芬等[6]對(duì)扇脈杓蘭胚囊結(jié)構(gòu)進(jìn)行顯微觀察發(fā)現(xiàn)，雌配子體形成過程中胚囊發(fā)生敗育，敗育率為12%，屬于正常的敗育頻率?？梢姡让}杓蘭雌配子敗育不是導(dǎo)致種子敗育和有性生殖困難的直接原因。

在大孢子發(fā)生過程中，細(xì)胞骨架和內(nèi)含物質(zhì)也相應(yīng)地發(fā)生變化。墨蘭(Cymbidiumsinense)大孢子發(fā)生和雌配子形成過程伴隨著微管系統(tǒng)的重組，在初始發(fā)育階段，微管系統(tǒng)分布在皮層下部和細(xì)胞質(zhì)中，隨后微管結(jié)構(gòu)重組，并逐漸向細(xì)胞核周圍靠攏，合點(diǎn)端的微管較珠孔端分布密集，這使得大孢子母細(xì)胞產(chǎn)生極性[16]。有一些植物的孢原細(xì)胞起大孢子母細(xì)胞的作用，細(xì)胞質(zhì)在大孢子母細(xì)胞形成過程中的改組被認(rèn)為是孢子體向配子體轉(zhuǎn)化的信號(hào)[17]。在五唇蘭(Doritispulcherrima)功能大孢子壁上存在發(fā)達(dá)的胞間連絲，它是物質(zhì)交換和信息交流的重要通道[18]。而在扇脈杓蘭大孢子發(fā)育過程中，未見胞間連絲，也沒有微管系統(tǒng)，細(xì)胞骨架組成簡(jiǎn)單，細(xì)胞質(zhì)不停地發(fā)生重組，細(xì)胞器種類和含量也不斷變化。細(xì)胞內(nèi)大量的線粒體以及蛋白質(zhì)和多糖等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)維持著細(xì)胞生命進(jìn)程。

綜上所述，野生扇脈杓蘭的更新方式以根狀莖分株繁殖為主，在一個(gè)生長(zhǎng)周期內(nèi)分株萌生休眠芽，母株凋亡，休眠芽是個(gè)體發(fā)育的起點(diǎn)，經(jīng)過展葉、開花、結(jié)實(shí)等完成生長(zhǎng)過程。雖然扇脈杓蘭具有有性生殖和無性生殖兩種繁殖方式，但有性生殖能力較差，自然結(jié)實(shí)率低。作為有性生殖的補(bǔ)償機(jī)制，無性繁殖保證了物種的繁衍[19～20]。休眠芽充分發(fā)育形成花芽是有性生殖的先決條件，但是扇脈杓蘭的休眠芽不能全部產(chǎn)生生殖器官，這就導(dǎo)致了部分植株有性生殖困難。胚珠作為雌配子的載體發(fā)育正常，花粉發(fā)育和受精過程良好[21]，但所形成的種子只能發(fā)育到球形胚時(shí)期，不再進(jìn)一步分化[6]，導(dǎo)致扇脈杓蘭種子大量敗育。鑒于扇脈杓蘭的瀕?，F(xiàn)狀，應(yīng)首先考慮就地保護(hù)，使其生境免遭破壞，保證無性繁殖的延續(xù)，再進(jìn)一步探索促進(jìn)種子繁殖的有效方法。

1.陳心啟,吉占和.中國(guó)蘭花全書[M].北京:中國(guó)林業(yè)出版社,2003:1-3.

Chen X Q,Ji Z H.The orchids of China[M].Beijing:China Forestry Publishing House,2003:1-3.

2.陳俊愉.中國(guó)花卉品種分類學(xué)[M].北京:中國(guó)林業(yè)出版社,2001:287-288.

Chen J Y.Systematics for Chinese flower cultivars[M].Beijing:China Forestry Publishing House,2001:287-288.

3.郎楷永.中國(guó)植物志[M].北京:科學(xué)出版社,1999:41-42.

Lang K Y.Flora reipublicae popularis sinicae[M].Beijing:Science Press,1999:41-42.

4.林泉.浙江植物志[M].杭州:浙江科學(xué)技術(shù)出版社,1993:489-490.

Lin Q.Flora of Zhejiang[M].Hangzhou:Zhejiang Science and Technology Press,1993:489-490.

5.丁炳揚(yáng),李根有,傅承新,等.天目山植物志[M].杭州:浙江大學(xué)出版社,2010:225-227.

Ding B Y,Li G Y,Fu C X,et al.Flora of Tianmu mountain[M].Hangzhou:Zhejiang University Press,2010:225-227.

6.劉芬,田敏,王彩霞,等.扇脈杓蘭果實(shí)生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)及胚胎發(fā)育過程觀察[J].植物資源與環(huán)境學(xué)報(bào),2012,21(1):28-35.

Liu F,Tian M,Wang C X,et al.Observation on fruit growth dynamics and embryo development process ofCypripediumjaponicum[J].Journal of Plant Resources and Environment,2012,21(1):28-35.

7.Rankou H.Cypripediumjaponicum.The IUCN red list of threatened species[EB/OL].2014,http://www.iucnredlist.org.

8.李和平.植物顯微技術(shù)[M].北京:科學(xué)出版社,2009:106-109.

Li H P.Plant microtechnique [M].Beijing:Science Press,2009:106-109.

9.連靜靜,錢鑫,王彩霞,等.中國(guó)特有植物無距蝦脊蘭生物學(xué)特性及花部形態(tài)觀察[J].植物資源與環(huán)境學(xué)報(bào),2013,22(3):100-106.

Lian J J,Qian X,Wang C X,et al.Observation of biological characteristics and floral morphology of Chinese endemic speciesCalanthetsoongianaTang et Wang[J].Journal of Plant Resources and Environment,2013,22(3):100-106.

10.劉芬,李全健,王彩霞,等.瀕危植物扇脈杓蘭的花部特征與繁育系統(tǒng)[J].林業(yè)科學(xué),2013,49(1):53-60.

Liu F,Li Q J,Wang C X,et al.Floral characteristics and breeding systems of an endangered speciesCypripediumjaponicum[J].Scientia Silvae Sinicae,2013,49(1):53-60.

11.Tsai W C,Hsiao Y Y,Pan Z J,et al.The role of ethylene in orchid ovule development[J].Plant Science,2008,175(1):98-105.

12.翁恩生,胡虹,李樹云,等.黃花杓蘭的花芽發(fā)育[J].云南植物研究,2002,24(2):222-228.

Weng E S,Hu H,Li S Y,et al.Differentiation of flower bud ofCypripediumflavum[J].Acta Botanica Yunnanica,2002,24(2):222-228.

13.錢鑫,李全健,連靜靜,等.珍稀植物扇脈杓蘭營(yíng)養(yǎng)器官的解剖學(xué)研究[J].植物研究,2013,33(5):540-545.

Qian X,Li Q J,Lian J J,et al.Vegetative anatomy of the rare plantCypripediumjaponicumThunb.[J].Bulletin of Botanical Research,2013,33(5):540-545.

14.劉仲健,劉可為,陳利君,等.瀕危物種杏黃兜蘭的保育生態(tài)學(xué)[J].生態(tài)學(xué)報(bào),2006,26(9):2791-2800.

Liu Z J,Liu K W,Chen L J,et al.Conservation ecology of endangered speciesPaphiopedilumarmeniacum(Orchidaceae)[J].Acta Ecologica Sinica,2006,26(9):2791-2800.

15.孫海芹.獨(dú)花蘭和扇脈杓蘭的傳粉生態(tài)學(xué)[D].北京:中國(guó)科學(xué)院研究生院,2005.

Sun H Q.Pollination ecology of two sympatric orchids,ChangnieniaamoenaandCypripediumjaponicum[D].Beijing:University of Chinese Academy of Sciences,2005.

16.Zee S Y,Ye X L.Changes in the pattern of organization of the microtubular cytoskeleton during megasporogenesis inCymbidiumsinense[J].Protoplasma,1995,185(3):170-177.

17.丁常宏.被子植物大孢子發(fā)生的超微結(jié)構(gòu)研究[J].牡丹江師范學(xué)院學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2006(4):3-4.

Ding C H.Ultrastructure of megasporogenesis in angiosperms[J].Journal of Mudanjiang Normal University,2006(4):3-4.

18.伍成厚,李冬妹,梁承鄴,等.五唇蘭大孢子發(fā)生的超微結(jié)構(gòu)觀察[J].熱帶亞熱帶學(xué)報(bào),2005,13(1):45-48.

Wu C H,Li D M,Liang C Y,et al.Ultrastructural observations on megasporogenesis inDoritispulcherrima(Orchidaceae)[J].Journal of Tropical and Subtropical Botany,2005,13(1):45-48.

19.Sun H Q,Cheng J,Zhang F M,et al.Reproductive success of non-rewardingCypripediumjaponicumbenefits from low spatial dispersion pattern and asynchronous flowering[J].Annals of Botany,2009,103(8):1227-1237.

20.Bae K H,Choi Y E.The effect of pollination on fruit formation and in vitro culture ofCypripediumjaponicumThunb.seeds[J].Propagation of Ornamental Plants,2013,13(1):12-18.

21.閆曉娜,田敏,王彩霞.扇脈杓蘭花粉超微結(jié)構(gòu)及花粉管生長(zhǎng)的觀察[J].西北植物學(xué)報(bào),2014,34(12):2439-2445.

Yan X N,Tian M,Wang C X.Ultrastructure of pollen and observation on pollen tube growth inCypripediumjaponicum[J].Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica,2014,34(12):2439-2445.

National Natural Science Foundation of China “Studies on conservation biology of endangered speciesCypripediumjaponicumThunb”(31370553)

introduction：YAN Xiao-Na(1989—),female,Master,Assistant Engineer,mainly engaged in seed biology research of trees.

date:2016-05-18

PlantGrowthCharacteristicsandUltrastructureofMegasporeoftheWildCypripediumjaponicum

YAN Xiao-Na1,2TIAN Min1,3*WANG Cai-Xia1ZHANG Ying1

(1.Research Institute of Subtropical Forestry,Chinese Academy of Forestry,Fuyang 311400；2.Harbin Research Institute of Forestry Machinery,the State Forestry Administration,Harbin 150086；3.Key Laboratory of Tree Breeding of Zhejiang Province,Fuyang 311400)

We used two wild populations ofCypripediumjaponicumfrom West Tianmu Mountain National Nature Reserve in Zhejiang Province to study the growth characteristics ofC.japonicum. The dormant bud morphology, plant growth process and ovule development were observed regularly. The growth cycle ofC.japonicumcomprised budding, flowering and leaf stage, fruiting and decline stage, which lasted for one year. The division propagation was the main reproductive pattern, and the sexual reproduction was poor. Each plant ofC.japonicumproduced a dormant bud which grew above the ground within the first year of October. Dormant buds that developed fully would flower within the second year of April. While, dormant buds which could not develop well only produced fan-shaped leaves in the second year, and there were no floral organs. Ultrastructure of ovules showed that the archesporial cell’s nucleus occupied most of the space, with dense cytoplasm and organelles. Megasporocyte located at the micropyle end, and the vacuoles, mitochondria and plastids densely distributed. In megasporangium, vacuole occupied a large space, and the nucleus was relatively small, with sparse cytoplasm and organelles. Mitochondria and plastids were visible. During the ovule developmental stage, protein and polysaccharide existed all the way. The staining of starch gradually deepened, without the presence of lipids.

Cypripediumjaponicum;bud development;growth cycle;ultrastructure of megaspore

國(guó)家自然科學(xué)基金“瀕危植物扇脈杓蘭的保護(hù)生物學(xué)研究”(31370553)

閆曉娜(1989—)，女，碩士，助理工程師，主要從事林木種子生物學(xué)研究。

* 通信作者：E-mail：tmin115@163.com

2016-05-18

* Corresponding author：E-mail：tmin115@163.com

S682.31

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2016.06.006