代麗娟 鄭唐春 劉彩霞 劉 軼 由香玲 曲冠證

(1.東北林業(yè)大學林木遺傳育種國家重點實驗室，哈爾濱 150040； 2.東北林業(yè)大學生命科學學院，哈爾濱 150040)

煙草化學誘導表達系統(tǒng)的建立

代麗娟1鄭唐春1劉彩霞1劉 軼1由香玲2*曲冠證1

(1.東北林業(yè)大學林木遺傳育種國家重點實驗室，哈爾濱 150040；2.東北林業(yè)大學生命科學學院，哈爾濱 150040)

化學誘導表達系統(tǒng)對植物功能基因的研究及植物基因工程應用有重要意義。XVE是以雌激素為基礎的用于誘導轉基因植物中目的基因表達的一種系統(tǒng)，能夠在可調控方式下誘導基因的表達。目前，以煙草為遺傳轉化材料進行XVE系統(tǒng)研究的詳細報道還未見發(fā)表。本文以煙草作為研究對象，利用PCR技術從本實驗保存的質粒pROKII-GFP中擴增出GFP基因。構建雌激素誘導型植物表達載體(pER8-GFP)并利用農桿菌介導的葉盤法將外源基因導入野生型煙草中；經潮霉素抗性篩選出轉化植株后，用PCR鑒定出陽性轉化植株，將陽性轉化植株利用不同濃度和不同時間的雌激素進行處理，并結合定量PCR和NightSHADE植物活體成像系統(tǒng)對轉基因植株的表達水平進行檢測。結果表明誘導pER8-GFP載體在煙草中表達的最適雌激素濃度為25 μmol·L-1，最適時間為48 h；同時在煙草胚軸與根尖細胞中檢測到熒光信號，表明XVE化學誘導系統(tǒng)在煙草中也可以高效、嚴格的依賴雌激素的誘導來控制目的基因表達。本研究將為煙草相關的化學誘導表達研究提供技術支持與解決方案。

雌激素誘導；基因表達；XVE；煙草

植物轉基因技術是研究植物基因功能強有力的工具。至今，轉基因的策略已經從組成型表達策略轉換成更精確的時空控制策略[1]。Zuo等[2]建立了一個基于ER的誘導系統(tǒng)，命名為XVE系統(tǒng)。在植物生物學研究和生物技術的應用中，化學誘導表達系統(tǒng)(XVE)在一個可調控方式下對于基因的表達是非?？扇〉?。與組成型啟動子相比，誘導型啟動子在各種應用中提供了許多優(yōu)點和潛力[3～5]。XVE是以雌激素為基礎的用于誘導轉基因物種目的基因表達的一種系統(tǒng)，屬于嵌合式轉錄激活劑。它由3個轉錄單元組成，第一個轉錄單元是人工合成的G10-90強組成型啟動子[6]，它能調控XVE融合轉錄因子的轉錄。XVE由細菌阻遏物LexA的DBD(X)，VP16的酸性反式激活結構域(V)和人雌激素受體調控區(qū)(E)所融合而成。第二個轉錄單元是選擇性抗性標記基因；最后一個轉錄單元是最小-46 35S啟動子與8拷貝的LexA操縱子融合來控制目的基因的轉錄[7]。XVE誘導系統(tǒng)僅受化學誘導劑(17-β-雌二醇)嚴格而特定的誘導和調控，對植物無毒害和生理影響，并且在無雌激素時，存在于細胞質中，目的基因不表達；雌激素存在時，與受體結合，進入細胞核內，結合到嵌合啟動子上，激活下游基因的表達。因此，XVE系統(tǒng)是比較理想的操縱基因表達和研究基因功能的化學調控系統(tǒng)。

目前，XVE誘導系統(tǒng)已經在擬南芥[2,8～10]、長春花[11]、水稻[12～13]、柑橘[14]等植物的研究中被使用。在擬南芥中，Zuo等人[15～16]發(fā)現的這種高效的、嚴格依賴于動物雌激素誘導的植物表達系統(tǒng)(XVE)，已經通過化學誘導激活系統(tǒng)成功發(fā)現并分離了AP2和AGAMOUS的等位基因，這為后期的篩選突變體和鑒定其功能奠定了基礎。并且現已證明，XVE系統(tǒng)除嚴格依賴于雌激素外，還可根據雌激素的使用劑量來嚴格控制下游基因的表達水平[2]。李霞等[17]利用雌激素誘導Cre/loxP重組系統(tǒng)非常高效地實現了轉基因煙草的無標記。同時，在水稻的研究中，Sreekala等[13]利用β-雌二醇誘導的Cre/loxP重組系統(tǒng)獲得了無選擇標記基因。李琳潔等[14]將XVE系統(tǒng)和Cre/loxP位點特異性重組系統(tǒng)用于無性繁殖的木本植物柑橘，以建立無選擇標記轉基因轉化體系。李芳等[10]用雌二醇誘導表達的XVE啟動子超量表達細胞周期蛋白CYCD3;1，結果表明該蛋白在擬南芥中的超量表達不僅能抑制初生根的伸長，而且還能抑制初生根對重力刺激的反應能力。這與前人用組成型超量表達研究CYCD3;1相比，能更好地對基因的功能進行定位。Xu等[11]將Bcl-2家族的一個哺乳類凋亡成員Bax轉入長春花細胞中讓其過表達，誘導表達后能夠產生超敏反應，因此用來研究植物細胞體內在臨床上產生的重要次生代謝產物。Petrasek等[18]利用XVE系統(tǒng)對PIN蛋白的功能進行了相應的研究。

綜上所述，Zuo等[2]2000年建立的XVE系統(tǒng)是一種高效嚴格依賴于動物β-雌二醇誘導的植物表達載體，已經應用于植物基因功能研究的多方面。但以往對于煙草中的誘導表達系統(tǒng)的功能性研究尚不全面，到目前為止，關于雌激素誘導轉基因煙草表達最適宜的誘導體系還未見報道。因此，本研究對煙草中XVE系統(tǒng)應答β-雌二醇誘導的模式進行了研究，以期建立一個實用型的煙草誘導表達系統(tǒng)。以GFP為報告基因，參照Zuo等[2]人的相關研究報道，利用qRT-PCR和NightSHADE植物活體成像系統(tǒng)對轉基因植株在煙草中的表達特異性進行分析，來驗證轉基因煙草最佳的雌激素誘導濃度和時間，為以后進行煙草XVE系統(tǒng)應用研究提供了技術支持與理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

野生型煙草(NicotianatabacumL.)組培苗，由本實驗室保存。

1.2 菌株及主要試劑

大腸桿菌感受態(tài)(Trans1-T1)購自Transgene biotech有限公司；農桿菌EHA105由本實驗室保存；pROKII-GFP質粒為本實驗室保存；pER8質粒，由東北林業(yè)大學李成浩教授惠贈；17-β-雌二醇，潮霉素(hygromycin，Hy)，奇霉素(Spectinomycin，Spe)均購自Sigma公司；DNA marker DL5000、PCR相關試劑、限制性內切酶XhoⅠ和SpeⅠ、rTaq酶、ExTaq酶，DNA ligase kit，dNTP Mixture、SYBR? Premix ExTaqTMⅡ均購自TaKaRa公司(大連)；EasyPure? Plant RNA Kit、Plasmid mini Kit I、Gel extraction kit均購自OMEGA生物技術公司(美國)；其他實驗試劑為進口或國產分析純。

1.3 實驗方法1.3.1 植物表達載體pER8-GFP的構建

以pROKII-GFP質粒為模板，利用引物GFP-XhoⅠ-F和GFP-SpeⅠ-R(表1)進行PCR擴增反應，反應程序：10×ExTaqPCR Buffer 5.0 μL，dNTP Mix(10 mmol·L-1)2.0 μL，Primer-F(10 μmol·L-1)2.0 μL，Primer-R(10 μmol·L-1)2.0 μL，ExTaq(5 U·μL-1)0.25 μL，pROKII-GFP質粒1.0 μL，加ddH2O至終體積50 μL。反應條件：95℃ 4 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 1 min，35個循環(huán)；72℃ 7 min。PCR反應完成后，吸2 μL進行1%瓊脂糖凝膠電泳分析。將得到的PCR擴增產物進行膠回收，然后用限制性內切酶XhoⅠ和SpeⅠ分別酶切目的片段和pER8載體，酶切體系：XhoⅠ 1.0 μL，SpeⅠ 1.0 μL，10×H buffer 2.0 μL，質粒1 μg，加ddH2O至終體積20 μL。反應條件：37℃ 2.5 h。酶切完成后用1%的瓊脂糖凝膠電泳，用膠回收試劑盒回收酶切后的目的片段，然后進行目的片段連接重組，重組體系：Solution I 8.0 μL，pER8線性片段4.0 μL，GFP目的片段4.0 μL，終體積16 μL。16℃ 1 h，連接反應完成后，立即轉化大腸桿菌Trans1-T1感受態(tài)細胞，涂布于含有奇霉素(Spe)的LB平板上培養(yǎng)，37℃過夜培養(yǎng)10～15 h。然后挑取單克隆進行菌液PCR驗證，并將陽性轉化子送博仕生物技術有限公司測序鑒定。最后采用液氮凍融法將pER8-GFP質粒轉入農桿菌EHA105中，隨機挑取單克隆進行菌液PCR驗證轉化子。

表1本實驗中用到的引物(下劃線：酶切位點)

Table1Primersusedinthisstudy(Underline：restrictionsite)

引物名稱Primers引物序列Sequences用途UsageGFP?XhoⅠ?F5′?ATCCTCGAGATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC?3′GFP?SpeⅠ?R5′?ATCACTAGTTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC?3′GFP基因克隆CloningofGFPgenepER8?F5′?CATCCCCTCGACGTACTGTAC?3′GFP基因驗證VerificationofGFPgeneGFP?RT?F5′?ACAACGTCTATATCATGGCCG?3′GFP?RT?R5′?GTGCTCAGGTAGTGGTTGTC?3′實時定量PCR檢測RealtimeRT?PCRofGFPNtactin?RT?F5′?TGTGTTGGACTCTGGTGATG?3′Ntactin?RT?R5′?CGCTCGGTAAGGATCTTCATC?3′實時定量內參基因RealtimeRT?PCRofNtactin

1.3.2 煙草的遺傳轉化

參考Horsch等[19]的煙草遺傳轉化方法，并修改如下：將長勢較好，生長大約20 d左右的野生型煙草(WT)葉片，切成約1 cm2×1 cm2大小放在MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)，(25±2)℃、12 h·d-1光照下培養(yǎng)1 d；在超凈工作臺下，將EHA105[pER8-GFP]的菌種接種到20 mL含Spe抗生素的液體LB培養(yǎng)基中(50 mg·L-1Spe，50 mg·L-1Rif)，28℃，180 r·min-1振蕩培養(yǎng)至OD600=0.6～0.8；4 000 r·min-1離心5 min，濃縮菌體，讓終濃度為OD600=0.2～0.3，即可作為侵染用菌液；然后，將預培養(yǎng)2 d的煙草葉片侵染3～7 min，放置在不含抗生素的分化培養(yǎng)基(MS+0.5 mg·L-16-BA+0.05 mg·L-1NAA)上培養(yǎng)，25±2℃下共培養(yǎng)2 d后，轉置含有30 mg·L-1潮霉素(Hy)和500 mg·L-1特美汀的MS分化培養(yǎng)基上，直至分化出抗性芽。待芽長到約1 cm左右時，轉置到MS生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)備用。

1.3.3 轉基因煙草的PCR檢測

為篩選陽性轉化子株系，用CTAB法提取篩選后T1代抗性植株葉片的DNA，并將其作為模板利用表1中引物進行PCR擴增。反應條件：95℃ 4 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，35個循環(huán)；72℃ 7 min，PCR反應完成后，取2 μL擴增產物，在1%瓊脂糖凝膠中檢測擴增結果。

1.3.4 化學誘導處理

誘導劑17-β-雌二醇溶于二甲基亞砜(DMSO)中，以1 mmol·L-1的儲存液放于-20℃保存?zhèn)溆谩⒃诓缓T導物的培養(yǎng)基上篩選獲得的T2代生長10 d大的3個轉基因株系的幼苗轉移至含有雌激素(17-β-雌二醇)終濃度分別為0、0.008、0.04、0.2、1、5、25及50 μmol·L-1培養(yǎng)基中(含Hy)培養(yǎng)16 h。同時，也將篩選獲得的T2代生長10 d大的3個轉基因株系的幼苗分別在雌激素(17-β-雌二醇)終濃度為2 μmol·L-1培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)0、0.5、1、3、6、12、24、48和96 h。設置3個生物學重復，快速用錫箔紙包好并作標記，立即置于液氮中，凍于-80℃冰箱中保存。

1.3.5 實時熒光定量PCR檢測

利用EasyPure?Plant RNA Kit試劑盒分別提取經雌激素誘導處理的相同時間不同濃度及相同濃度不同時間的轉基因株系煙草幼苗的總RNA。并通過PrimeScript? RT reagent Kit Perfect Real Time試劑盒將總RNA反轉錄為cDNA，將合成的第一鏈cDNA用ddH2O稀釋10倍后用作模板。反應總體系為20 μL；10 μL SYBR Green，0.4 μL ROX Dye II，cDNA模板2 μL，正、反向引物各0.8 μL。引物如表1所示。以煙草Ntactin基因作為內參。反應程序為：95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 35 s，40個循環(huán)；95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s。每個樣品進行3次重復，并通過2-ΔΔCt法進行數據分析。

1.3.6 誘導植株的表達情況觀察

為了進一步研究雌激素(17-β-雌二醇)對GFP基因誘導的表達情況，選取表達量較高的轉基因植株用于熒光觀察。將生長10 d大的幼苗在雌激素濃度為25 μmol·L-1培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h，然后，放置于載玻片上，在激光共聚焦顯微鏡下觀察其葉片、胚軸和根尖的表達情況，同時，并將植株轉移至NightSHADE植物活體成像系統(tǒng)中，選擇Luminescence(發(fā)光檢測)，輸出偽彩色圖像，進而分析GFP基因的表達特異性，拍照保存。

2 結果與分析

2.1 植物表達載體pER8-GFP的構建

XVE載體的示意圖如圖1所示，為了研究這個系統(tǒng)，我們在XVE載體(pER8)的靶基因表達盒插入了一個cDNA編碼的綠色熒光蛋白(GFP)，具體構建步驟如下：利用PCR技術從pROKII-GFP載體中擴增出帶有XhoⅠ和SpeⅠ酶切位點的目的片段(圖2:A)，利用限制性內切酶分別對PCR擴增出的目的片段和pER8載體雙酶切(圖2:B)，酶切產物進行膠回收，然后用DNA ligase kit進行連接。隨后，在含有Spe抗生素的平板上隨機挑選8個轉化子進行菌液PCR檢驗(圖2:C)，并將陽性轉化子進行測序，結果表明插入序列未發(fā)生堿基突變，至此植物表達載體pER8-GFP構建完成。隨后將pER8-GFP的質粒轉入EHA105菌液中，隨機挑取單菌落進行PCR驗證(圖2:D)。

圖1 XVE載體的示意圖 PG10-90.組成型強啟動子；LexA. DNA結合域；VP16.轉錄激活域；hER.人類雌激素受體調節(jié)域；TE9. rbcS E9 ploy(A)尾巴；PNOS.胭脂堿合酶啟動子；Hpt.潮霉素抗性基因；TNOS.胭脂堿合酶終止子；OLexA. LexA操縱基因序列的8個拷貝；-46. -46 35S最小啟動子；MCS.靶基因的多克隆位點；T3A. rbcsS 3A ploy(A)尾巴 箭頭表示轉錄的方向Fig.1 Schematic of plant expression vector pER8 PG10-90. A strong constitutive promoter; LexA. DNA binding domain; VP16. Transcription activation domain; hER. Regulatory region of the human estrogen receptor; TE9. rbcS E9 ploy(A) addition sequence; PNOS. Nopaline synthase promoter; Hpt. Hygromycin resistance gene; TNOS. Nopaline synthase terminator; OLexA. Eight copies of the LexA operator sequence; -46. The -46 35S minimal promoter; MCS. Multiple cloning sites for target genes; T3A. rbcsS 3A ploy(A) addition sequence Arrows indicate the direction of transcription.

圖2 植物表達載體pER8-GFP的構建 A.GFP基因的克?。篗. DNA marker DL5000；1. GFP基因的PCR產物 B.GFP片段和pER8載體的雙酶切：M. DNA marker DL5000；1. PCR擴增產物的酶切結果；2. pER8載體的酶切結果 C.植物表達載體pER8-GFP菌液PCR產物：M. DNA marker DL5000；1～7. pER8-GFP轉化子的菌液PCR檢測；8.陰性對照 D. pER8-GFP在農桿菌中的菌液PCR驗證：M. DNA marker DL5000；1～7. pER8-GFP轉化農桿菌的菌液PCR產物；8.陰性對照Fig.2 The construction of pER8-GFP vector A. The cloning of GFP gene: M. DNA marker DL5000; 1. PCR product of GFP geneB. Double enzyme analysis of GFP fragments and pER8 vectors: 1. Digested result of GFP fragments; 2. Digested result of pER8 vector C. PCR products of plant expression vector pER8-GFP: M. DNA marker DL5000; 1～7. PCR detection of pER8-GFP transformants; 8. negative control D. PCR validation of pER8-GFP transformants in EHA105: M. DNA marker DL5000; 1～7. PCR products of pER8-GFP transformants in EHA105; 8. Negative control

2.2 pER8-GFP在煙草中的遺傳轉化及PCR鑒定

將生長大約3周左右的野生型煙草組培苗葉片切成約1 cm2×1 cm2大小，然后對煙草進行遺傳轉化。經過2 d的共培養(yǎng)后將葉片放入含有30 mg·L-1Hy的MS分化培養(yǎng)基上進行抗性篩選(圖3:A)，經過大約15 d左右的篩選，等抗性芽長出葉片后，將其切下放在含有抗生素的分化培養(yǎng)基上進行二次篩選分化(圖3:B)。經過多次篩選后，將伸長至1 cm左右的莖段轉移到生根培養(yǎng)基中，進行生根培養(yǎng)(圖3:C)。待生根培養(yǎng)20 d后，提取不同株系的幼葉DNA，利用表1中的pER8-F和GFP-SpeⅠ-R引物進行PCR檢測(圖3:D)。最后，在所有抗性苗中共獲得了12株轉基因植株。

圖3 pER8-GFP在煙草中的遺傳轉化及PCR鑒定 A.煙草葉片的抗性篩選；B.抗性芽的二次篩選；C.抗性芽的生根培養(yǎng)；D.抗性苗的PCR檢測；M. DNA marker DL5000；1～12. 12株抗性苗的PCR產物；13.陰性對照Fig.3 Genetic transformation and identification of GFP in tobacco A. Resistance screening of tobacco leaves; B. Resistance screening of resistant buds; C. Rooting of resistant seedlings; D. PCR detection of resistant seedlings; M. DNA marker DL5000; 1～12. 12 PCR products of resistant seedlings; 13.Negative control

2.3 誘導植株的qRT-PCR檢測

為了研究煙草GFP基因的誘導表達水平，分別提取不同濃度和不同時間用雌激素誘導處理的3個獨立的轉基因株系(L1、L2和L3)煙草幼苗的總RNA，利用qRT-PCR檢測GFP基因的表達水平，結果如圖4所示。不同濃度的雌激素誘導處理24 h后，3個轉基因株系均對不同的誘導劑濃度處理產生應答反應，而未被誘導的轉基因株系和野生型植株中沒有檢測到GFP的表達。此外，GFP在0.008 μmol·L-1的雌激素誘導下開始表達，至25 μmol·L-1時達到飽和，當繼續(xù)增大誘導濃度，表達水平沒有顯著的增加(圖4:A)。不同時間處理下，GFP的誘導表達隨著處理時間的延長，表達量顯著上調，但處理時間至48 h時達到最高水平，隨后GFP的轉錄水平隨著處理時間的延長開始下降(圖4:B)。上述結果表明化學誘導表達系統(tǒng)pER8-GFP在煙草中表達的最適雌激素濃度為25 μmol·L-1，最適時間為48 h。

圖4 GFP基因在煙草中對雌二醇的應答情況 A. GFP基因對雌二醇濃度的響應；B. GFP基因對雌二醇(濃度為2 μmol·L-1)時間的響應；35S-1，35S-2.兩個獨立的轉基因株系(35S::GFP)；WT.野生型Fig.4 Response of GFP gene to estradiol in tobacco A. Response of GFP gene to estradiol concentrations; B. Response of GFP gene to estradiol(concentration 25 μmol·L-1) times; 35S-1,35S-2. Two independent transgenic lines(35S::GFP); WT. Wild type

2.4 GFP基因在煙草中的誘導表達分析

為了進一步研究雌激素(17-β-雌二醇)對GFP基因誘導的表達情況，選取3個生長10 d左右在雌激素濃度為25 μmol·L-1培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h后的幼苗，放置于載玻片上進行鏡檢觀察，均出現了相似的表達結果。圖5則表明了轉基因株系L3表達結果。結果表明GFP基因在葉片、胚軸和根尖均有較強的熒光(圖5)。同時，將誘導后的幼苗轉移至NightSHADE植物活體成像系統(tǒng)中，輸出偽彩色圖像，進而分析GFP基因的表達特異性。圖6顯示，在GFP基因煙草植株的下胚軸及根尖均有熒光信號檢出，其中根尖區(qū)熒光信號最高。

圖5 雌二醇誘導轉基因煙草中GFP表達 35S::GFP.陽性對照；WT.陰性對照；pER8-GFP.經雌二醇誘導的轉基因植株Fig.5 Estradiol-induced GFP expression in transgenic tobacco 35S::GFP. Positive control; WT. Negative control; pER8-GFP. Transgenic plants induced by estradiol

圖6 GFP基因的表達特性分析 35S::GFP.陽性對照；WT.陰性對照；1,2.經雌二醇誘導的轉基因株系Fig.6 Expression characteristics analysis of GFP gene 35S::GFP. Positive control; WT. Negative control; 1,2. Transgenic plants induced by estradiol

3 討論

隨著植物生物技術的發(fā)展，轉基因技術以其巨大的應用價值，正逐步成為一種常規(guī)育種手段。傳統(tǒng)方法是將目的基因在轉基因植株中過量表達或抑制基因表達，但是組培過程中產生的體細胞自身突變或目的基因的隨機插入都可能引起表型變化，進而干擾對目的基因的功能鑒定?；瘜W誘導表達系統(tǒng)通過誘導處理與非誘導處理的對比，可以區(qū)分基因引起的表型變化的原因，方便、準確地鑒定研究基因的功能。誘導表達系統(tǒng)還可以解決組成型表達所引起的致死或不育等問題，經誘導后進而研究這些相關基因的功能?；瘜W誘導表達系統(tǒng)具有廣闊的應用范圍，例如應用XVE化學調控系統(tǒng)的質粒pER8，Zuo等[2]建立的XVE化學誘導系統(tǒng)是對GVG誘導系統(tǒng)的改善，GVG在多種植物中都會引起生長缺陷。而XVE系統(tǒng)不存在與GVG相似的生長缺陷。本研究采用了相似的XVE誘導系統(tǒng)和Cre/loxP重組系統(tǒng)。Cre重組酶為雌激素誘導表達型，其啟動子采用LexA+35S(-46區(qū))啟動區(qū)，LexA調控區(qū)受XVE蛋白的調控，在無雌激素的情況高效阻遏基因的表達，但有雌激素存在時，它與雌激素結合又可高效啟動基因表達[8]。Zuo等2000年在擬南芥中研究證明，該化學誘導表達系統(tǒng)可用于改善轉基因植物引起生長缺陷的問題[2]。Curtis[20]等使用XVE系統(tǒng)建立了的克隆載體用于植物中高通量基因功能分析。Zuo等[8,21～23]使用依賴雌二醇誘導的XVE系統(tǒng)激活標簽，建立了擬南芥突變體庫，獲得大量擬南芥功能性突變體。Arroyo-Herrera等[24]利用該系統(tǒng)在轉基因可可(Coffea canephora)中建立體細胞胚胎的重復發(fā)生和生產體系，并從可可的子葉中誘導產生異源分生組織；另外，Bruce等報道了另一個以ER為基礎的誘導系統(tǒng)，利用ER-C嵌合因子，使兩個轉錄因子CRC(C1和R的融合因子)和P過表達，進而鑒定出大量的下游靶基因[25]。此外，將XVE誘導系統(tǒng)用于轉基因水稻的研究中卻發(fā)現，基因不能在整株植株中表達，只能在根部才能檢測到報告基因的表達，表明此系統(tǒng)在轉基因水稻中經誘導劑誘導后表達不具有穩(wěn)定性[26]。而與其相比，本文在轉基因煙草中的研究所用的雌激素誘導的啟動子能定時定量、嚴謹高效地表達報告基因，同時通過誘導與非誘導的轉基因植株相比，排除了轉基因操作本身對植株的影響，能更加清晰準確地研究煙草中XVE系統(tǒng)應答β-雌二醇誘導的模式。

目前，使用化學誘導系統(tǒng)的研究多集中在擬南芥等植物中，但以往對于煙草中的誘導表達系統(tǒng)的功能性研究尚不全面，到目前為止，關于雌激素誘導轉基因煙草表達最適宜的誘導體系還未見報道。GFP是水母體內一種天然蛋白質，能在多種植物體內表達綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)，可以用來作為報告基因在活體細胞中進行圖像分析[27]。在本研究中，我們用GFP基因作為報告基因進行XVE系統(tǒng)在煙草中的應用研究。首先，利用qRT-PCR技術對GFP基因在煙草中的表達特異性進行分析，驗證轉基因煙草最佳的雌二醇誘導濃度和時間。研究發(fā)現，雌激素濃度達到0.008 μmol·L-1時，目的基因開始表達，當雌激素濃度達到25 μmol·L-1時達到飽和。這個結果與早期研究的最適宜誘導濃度2 μmol·L-1略有不同，這可能是不同的物種之間存在的差異導致的。同時，GFP的轉錄在誘導48 h時達到最高水平，然后GFP的轉錄水平開始逐漸的下降。最后，我們采用NightSHADE植物活體成像系統(tǒng)對其進一步的分析。結果表明在轉GFP基因的煙草植株胚軸和根尖均有熒光信號檢出，但熒光信號弱于35S組成型啟動子，這可能是由于XVE系統(tǒng)自身特點及雌激素濃度和處理時間上的差異所導致的。此外，轉基因煙草根尖區(qū)熒光信號最高，這可能是因為根尖部位接觸培養(yǎng)基中的雌激素，最先激活誘導表達有關。綜上，通過本實驗的初步研究，建立了適用于煙草轉基因的XVE系統(tǒng)研究，篩選出在煙草中雌激素誘導的最佳誘導濃度和誘導時間，這為以后進行外源基因的可控性表達分析提供了依據。

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Program for New Century Excellent Talents in University(No.NCET-12-0808)；The National Natural Science Foundation of China(No.31370661)

introduction：DAI Li-Juan(1988—),female,master student,mainly engaged in the study of tree genetics and breeding.

date:2016-06-06

EstablishmentofAChemical-inducibleGeneExpressionSysteminTobacco

DAI Li-Juan1ZHENG Tang-Chun1LIU Cai-Xia1LIU Yi1YOU Xiang-Ling2*QU Guan-Zheng1

(1.State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding,Northeast Forestry University,Harbin 150040；2.College of Life Science,Northeast Forest University,Harbin 150040)

Chemical-inducible expression system is a powerful tool for plant functional genomics and plant genetic engineering applications. XVE is a chemical-inducible expression system using estrogen for chemical induction. The detailed report about XVE using tobacco as plant material was not available yet. In this study,GFPwas amplified from the plasmid pROKII-GFPthat was preserved in this experiment by PCR. Estrogen inducible plant expression vector(pER8-GFP) was constructed and transformed into wild-type tobacco byAgrobacterium-mediated leaf disc transformation. The positive transformants were screened with hygromycin followed by a further PCR identification. The transformants were induced with different concentrations and different times of estrogen. The expression ofGFPin transgenic tobacco was tested by using qRT-PCR and NightSHADE plantsinvivoimaging system, and the results showed that the best suitable concentration of estrogen which induced the expression of pER8-GFPin tobacco was 25 μmol·L-1, and the best suitable period was 48 h. At the same time, theGFPgene appeared in the hypocotyl and root tip cells of transgenic tobacco. It showed that the XVE chemical induction system in tobacco could also be used to control the expression of the target gene efficiently by the induction of estrogen. Our study will contribute to the XVE study of tobacco in future.

estradiol-inducible;gene expression;XVE;Nicotianatabacum

教育部新世紀優(yōu)秀人才支持計劃項目(No.NCET-12-0808)；國家自然科學基金項目(No.31370661)資助

代麗娟(1988—)，女，博士研究生，主要從事林木遺傳育種研究。

* 通信作者：E-mail：yxiangling@yahoo.com

2016-06-06

* Corresponding author：E-mail：yxiangling@yahoo.com

Q943

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2016.06.016