王三合 康曉玲 樊 平 陳 群
西北工業(yè)大學(xué)醫(yī)院(西安710072)
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益腎方對(duì)IgA腎病細(xì)胞因子表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究
王三合 康曉玲樊平陳群
西北工業(yè)大學(xué)醫(yī)院(西安710072)
目的:觀察益腎方對(duì)IgA腎病模型大鼠細(xì)胞因子表達(dá)的影響。方法:將40只SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組10只,造模組30只兩組,采用口服牛血清白蛋白聯(lián)合尾靜脈注射葡萄球菌腸毒素B法造模。將IgA腎病模型大鼠分成3組:益腎方組、造模組、強(qiáng)的松治療組各10只。分別灌胃給藥,4周后取血,酶聯(lián)免疫法(ELISA)測(cè)定IL-6、Leptin和PDGF水平。結(jié)果:與模型組比較,各藥物治療組均有IL-6、Leptin和PDGF表達(dá)降低作用;與正常對(duì)照組比較,各組IL-6、Leptin和PDGF表達(dá)均增強(qiáng)(P<0.05);與模型組比較,益腎方能顯著降低IL-6、Leptin和PDGF的表達(dá)。 結(jié)論:益腎方可能是通過(guò)降低IL-6、Leptin和PDGF的表達(dá)治療IgA腎病。
IgA腎病(IgA nephrophathy, IgAN)是我國(guó)最常見(jiàn)的原發(fā)性腎小球疾病,發(fā)病率占原發(fā)性腎小球疾病的58.2%,是全世界發(fā)病率最高的原發(fā)性腎小球疾病,也是慢性腎臟病的主要病理類型[1]。近年研究發(fā)現(xiàn),眾多細(xì)胞因子與IgA腎病的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸關(guān)系密切,而白細(xì)胞介素-6(IL-6)是細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)中的重要因子之一[2]。目前,有關(guān)細(xì)胞因子與IgA腎病的關(guān)系已成為研究的熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察益腎方對(duì)IgA腎病模型大鼠IL-6、Leptin和PDGF指標(biāo)的變化,從細(xì)胞因子水平探討益腎方治療IgA腎病的可能機(jī)制,為益腎方的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。
1材料與方法
1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物21日齡幼年Sprague-Dawley (SD) 大鼠40只,體重100±50g,由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。
1.2動(dòng)物模型的建立正常對(duì)照組大鼠自由進(jìn)食與飲水,而模型組大鼠隔日灌服BSA200mg/kg體重(BSA用0.1%BSA酸化水溶解),第6周開(kāi)始按20mg/kg,1次/d尾靜脈注射1%BSA(每1gBSA溶于1250ml注射用水中,配成含BSA0.4mg/0.5ml的溶液)連續(xù)3d,第8周時(shí)按0.5mg/kg尾靜脈注射SEB,每周1次(1 mg SEB溶于50ml注射用水,配成每0.5ml注射用水含0.01mg SEB的溶液),連續(xù)注射3周,觀察至12周末。
1.3分組及藥物干預(yù)模型大鼠分三組,每組10只,正常對(duì)照組10只。將模型大鼠30只隨機(jī)分成3組:益腎方組(湯劑容量為每次每公斤體重10ml)、模型組(灌以相同劑量的清水)、強(qiáng)的松治療組(0.1mg/100g);1次/d,連續(xù)4周。
1.4取材實(shí)驗(yàn)的第12周末和第16周末用代謝籠收集大鼠24h尿液進(jìn)行尿總蛋白測(cè)定。采用腹主動(dòng)脈取血分離血清,-20℃保存。
1.5檢測(cè)指標(biāo)及方法采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA法)試劑盒測(cè)定血清樣本中IL-6、Leptin、PDGF-BB水平,嚴(yán)格參照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。計(jì)算血清IL-6、Leptin和PDGF水平。
2結(jié)果2.1正常對(duì)照組大鼠在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,一般情況正常,模型組大鼠在造模時(shí),注射SEB后均有不同程度的食欲減少,精神萎靡等表現(xiàn)。造模第12周末收集大鼠尿液進(jìn)行檢測(cè),見(jiàn)表1。
表1 各組大鼠第12周末尿紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、24h
注:與正常對(duì)照組比較*P<0.05
2.2各組大鼠治療4周后血清細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果結(jié)果顯示,與正常對(duì)照組比較,各組尿液中紅細(xì)胞個(gè)數(shù)和24h尿蛋白定量均較正常對(duì)照組顯著增加,各治療組之間血尿與蛋白尿水平無(wú)顯著性差異(P>0.05),顯示造模成功。
表2 各組大鼠治療4周后血清細(xì)胞
注:*表示與正常對(duì)照組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,#表示與模型組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異
2.3各組大鼠第16周末尿紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、24h尿蛋白定量結(jié)果治療4周后對(duì)IL-6、Leptin、PDGF-BB的檢測(cè)結(jié)果,見(jiàn)表2。尿紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、24h尿蛋白定量結(jié)果,見(jiàn)表3。
表3 各組大鼠第16周末尿紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、24h
注:*表示與正常對(duì)照組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,#表示與模型組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異與模型組比較,強(qiáng)的松組、益腎方組大鼠尿紅細(xì)胞、24h尿蛋白均有降低(P<0.05),強(qiáng)的松組、益腎方組尿紅細(xì)胞、24h尿蛋白測(cè)定結(jié)果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異
3討論目前IgAN動(dòng)物模型建立方法有以下幾種:自發(fā)病變型、免疫誘導(dǎo)型和繼發(fā)病變型。自發(fā)病變型采用ddy小鼠和高IgA小鼠,而這種小鼠價(jià)格昂貴,且該小鼠腎臟與人類腎臟組織結(jié)構(gòu)差別較大;免疫誘導(dǎo)型多采用尾靜脈注射葡萄球菌腸毒素+灌胃牛血清白蛋白(BSA)誘發(fā)IgAN[3],但葡萄球菌腸毒素是外毒素易引起機(jī)體損害,還有采用皮下注射注射CCL4和蓖麻油,灌胃牛血清白蛋白及尾靜脈注射0.05mg脂多糖(LPS),誘發(fā)IgA腎病模型,該模型模型雖有較強(qiáng)IgA的沉積,但肝功能損害嚴(yán)重,常伴有肝細(xì)胞壞死變性和假小葉生成[4]。
繼發(fā)病變型則采用體外將MOPC-315雜交瘤的二硝基苯酚抗體與牛血清白蛋白(二硝基苯酚化)配成免疫復(fù)合物,通過(guò)鼠靜脈注入BAIb/c鼠體內(nèi),而致免疫復(fù)合物沉積在腎小球系膜區(qū),但此法模型動(dòng)物血尿不明顯[4]。
本研究采用尾靜脈注射葡萄球菌腸毒素+灌胃牛血清白蛋白(BSA)誘發(fā)IgAN,考慮到葡萄球菌腸毒素易引起機(jī)體損害,改為0.5mg/kg尾靜脈每周注射一次以減少損傷,從研究結(jié)果看造模成功。有研究結(jié)果顯示一般在造模12周左右可建立穩(wěn)定、可靠的IgA腎病模型。因此,本研究在造模12周時(shí)代謝籠留尿檢測(cè)模型動(dòng)物血尿和尿蛋白情況以確定動(dòng)物模型是否成功,在模型成功后進(jìn)行藥物干預(yù)4周以觀察藥物治療效果。
IgAN目前治療以糖皮質(zhì)激素及細(xì)胞毒藥物為主,但有時(shí)這些藥物的副作用讓患者較難接受。中醫(yī)藥治療IgAN有一定療效。
本方為肝腎陰虛之方,證屬腎中真水不足,水虧無(wú)以養(yǎng)木,而致陰虛陽(yáng)亢且虛火內(nèi)生,治療宜采用滋補(bǔ)肝腎,方中熟地具有甘柔補(bǔ)血,滋腎填精之功,當(dāng)歸補(bǔ)血活血為君藥,山茱萸、枸杞子、女貞子滋養(yǎng)肝腎固腎氣為臣藥,黃芪可補(bǔ)氣升陽(yáng),山藥健脾益胃可助運(yùn)化,茯苓滲利脾濕,而丹皮涼肝瀉火,生地、赤芍、白茅根具有清熱涼血之用,小薊涼血止血、金櫻子固精、旱蓮草滋陰、仙鶴草收斂共為佐使。全方補(bǔ)瀉結(jié)合,開(kāi)合相濟(jì),共奏滋陰補(bǔ)腎固精、清熱涼血活血之功效。
腎穿刺活檢是診斷IgA腎病的金標(biāo)準(zhǔn),近年來(lái)超聲引導(dǎo)下腎活檢使腎活檢的安全性得到提升,本研究采用的腎穿刺均是在超聲引導(dǎo)下進(jìn)行的,但是腎穿刺活檢是有創(chuàng)性檢查,有發(fā)生出血等風(fēng)險(xiǎn),且腎穿刺活檢結(jié)果有時(shí)不足以準(zhǔn)確評(píng)估腎小球病變嚴(yán)重程度。因此,尋找能夠用于IgA腎病診斷、病情評(píng)估或判斷預(yù)后的無(wú)創(chuàng)性生物標(biāo)志物已成為研究熱點(diǎn)[5]。
細(xì)胞因子IL-6是由T細(xì)胞、B細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞等分泌的糖蛋白,具有多種生物學(xué)活性,研究發(fā)現(xiàn)IL-6可增加系膜細(xì)胞蛋白激酶的活性,加重腎損害[6]。本研究結(jié)果顯示:IgA腎病模型大鼠血清IL-6水平明顯高于正常對(duì)照組,兩者比較有顯著性差異(P<0.05);服用益腎方治療后,IL-6水平顯著下降,與模型組比較有顯著性差異(P<0.05)。提示IL-6表達(dá)升高是IgA腎病的生物標(biāo)記物之一,益腎方可降低IL-6的表達(dá)促進(jìn)組織修復(fù)。
總之,本研究結(jié)果提示,IL-6、Leptin和PDGF水平與臨床腎間質(zhì)病理?yè)p傷之間具有一定的相關(guān)性。血清IL-6、Leptin和PDGF水平可作為無(wú)創(chuàng)性生物標(biāo)記物,若能有大數(shù)據(jù)樣本檢測(cè)結(jié)果支持,血清IL-6、Leptin和PDGF水平有可能成為IgA腎病診斷、病情評(píng)估或判斷預(yù)后的無(wú)創(chuàng)性生物標(biāo)志物。
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(收稿2016-04-03;修回2016-06-16)
The experimental study on the effects of cytokine expression of Yishen-Fang in IgAN rats
Hospital of northwestern polytechnical university
(Xi’an 710072)WangSanheKang XiaolingFan Ping et al
Objective:To observe the effects of cytokine expression of Yishen-Fang treatment in IgAN rats. Methods: 40 SD rats were randomly divided into two groups, 10 for normal control group, 30 for model group. 30 IgAN rats were randomly divided into 3 groups: Yishen-Fang treatment group, model group, prednisone treatment group. There are 10 rats in each group. After Gavage for four weeks, the blood was collected. The IL-6, Leptin and PDGF values were measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Results:Compared with the model group, the expression of IL-6, Leptin and PDGF values decrease were shown in all drug treatment groups. Compared with the normal control group, the values of IL-6, Leptin and PDGF in each group were significantly increased(P<0.05). The expression of IL-6, Leptin and PDGF in the Yishen-Fang treatment group was significantly reduced when compared with the model group. Conclusion:Yishen-Fang may treat the IgAN rats by reducing the expression of IL-6, Leptin and PDGF.
Kidney Diseases (TCM)/Chinese traditional medicine therapyYishen-FangAnimal ExperimentationRats
*陜西省中醫(yī)管理局項(xiàng)目(13-LC085)
西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部地方病研究所(西安710000)
腎病/中醫(yī)藥療法益腎方 動(dòng)物 ,實(shí)驗(yàn)大鼠
R692
A doi:10.3969/j.issn.1000-7369.2016.10.079
陜西省衛(wèi)生計(jì)生委研究項(xiàng)目(2014ZD072)
△西安市新城區(qū)中醫(yī)醫(yī)院(西安710003)
▲陜西省中醫(yī)醫(yī)院(西安710003)