許　濤，王　旭，劉佳玲，馮　雪，吳曉東，史鐵偉，白春英

（赤峰學院　醫(yī)學院，內(nèi)蒙古　赤峰　024000）

蒙古族人群中5-脂氧合酶基因E254K多態(tài)性的研究

許濤，王旭，劉佳玲，馮雪，吳曉東，史鐵偉，白春英

（赤峰學院醫(yī)學院，內(nèi)蒙古赤峰024000）

本文通過相關實驗研究了蒙古族正常人群中5-脂氧合酶E254K多態(tài)性分布情況，同時與漢族正常人群中分布情況進行相比，為之后研究該多態(tài)性與蒙古族人群中哮喘患者之間的關系奠定了基礎.

5-脂氧合酶；E254K多態(tài)性；等位基因特異性PCR

1　引言

花生四烯酸在分解代謝體系中十分重要的生物酶，該酶為5-脂氧合酶（5-lipoxygenase 5-LO），白三烯（Leukotrienes LTs）是花生四烯酸的分解代謝后所得到的物質(zhì)，這種物質(zhì)多數(shù)會誘發(fā)人體呼吸道炎癥發(fā)應、呼吸道支氣管痙攣及其呼吸急促等現(xiàn)象，其中白三烯（LTS）的生理活動較為強烈、產(chǎn)生生理作用時間相對比較長，是導致人體引發(fā)過敏性支氣管哮喘疾病發(fā)生的關鍵性炎癥物質(zhì).在5-脂氧合酶基因中擁有14個外顯因子，該mRNA基因在5-脂氧合酶中整體長度為2568bp，根據(jù)參考文獻［1-2］中表現(xiàn)出5-脂氧合酶基因多變性和人群內(nèi)有哮喘疾病的發(fā)生相關聯(lián)，此中cDNA第760位的基因G突變成為A，其中坐落于第六個外顯因子上的基因是760G＞A，有關在分子生物基因診斷庫中曾有相關記錄，與之相對的第254位上的氨基酸中通過其攜帶有負離子電荷的谷氨酸（E）轉(zhuǎn)變成攜帶有正離子電荷的賴氨酸（K），該一單核苷酸的多變性（SNP）誘發(fā)了離子電荷的變化，影響了5-脂氧合酶的特性或此酶與其他相關酶之間的彼此效用.有研究證明我國漢族人群中5-脂氧合酶基因E254K多態(tài)性與哮喘的發(fā)生有關，但在蒙古族正常人群中的分布情況還不清楚.該研究的目的在于檢測該多態(tài)性在蒙古族正常人群中的分布情況，同時與漢族正常人群中的分布情況進行對比，為進一步研究該多態(tài)性與蒙古族哮喘患者的關系奠定基礎.

2　材料與方法

2.1樣本的采集與編號

樣本來源于附屬醫(yī)院正常體檢的蒙古族人群和在校的蒙古族學生志愿者，采集3毫升外周血，對于收集來的標本進行實名登記和編號.共采集了200名蒙古族正常人群樣本.

2.2白細胞的分離及DNA的提取

參考白春英等［3］方法，0.2%NaCL溶液中紅細胞易破裂，白細胞不受影響的特點.即3ml全血加0.2%NaCl到10ml，混勻裂解紅細胞（2500rpm，5min），棄上清加0.2%Na-Cl混勻進一步裂解未裂解的紅細胞（2500rpm，5min）棄上清.最后加 1ml 0.2%NaCl吸打混勻，移入 1.5ml離心管（12000rpm，1min），棄上清，白細胞沉淀-20℃保存之后按提取DNA基因組的操作步驟進行.

2.3引物的設計與PCR反應體系

該研究采用等位基因特異性PCR法（AS-PCR），該方法對引物設計有特殊的要求，可以快速、簡便、低成本的檢測等位基因單核苷酸多態(tài)性.由于Taq DNA聚合酶缺乏3’-5’外切酶的活性，在選擇突變型引物擴增正常DNA模板時，野生型引物的堿基與模板無法形成磷酸酯鍵導致Taq酶無法延伸，檢測不到特異長度的條帶，從而表明模板DNA無此突變.檢測到特異長度的條帶，表明該模板為突變型基因組成.如果突變型引物和非突變型引物分別用于擴增同一DNA模板，則對擴增結果判斷分析是否有特定位點基因的特定突變［4］.根據(jù)這一原理針對野生型和突變型設計3’端的堿基，一般倒數(shù)第二位的堿基會設計成故意錯配的堿基，可以更好的提高引物的特異性［5］.我們參考文獻［6］訂購引物：5-LO 254W引物序列（檢測Glu）：5’-CgC TgC ACA gAg CTg CCt g-3’；5-LO 254M引物序列（檢測Lys）：5`-CgC TgC ACA gAg CTg CCt A-3’；5LOEX6A引物序列（共用的右側引物）：5’-cgc aat tcc tcc tct gat gt-3’，PCR產(chǎn)物為301bp；設計的內(nèi)參照用左側引物為5LO EX8S引物序列：5’aga ggc gaa gtt ctc caa ca；右側引物為5LO EX8A引物序列（內(nèi)參照）：5’aac agg gac gga gag tga tg-3’，PCR產(chǎn)物為600bp.

PCR反應體系：分A管和B管，兩管中均加入對照用一對引物和共用的下游引物，區(qū)別在于每個管子分別加入野生型和突變型的上游引物.反應體系中加入PCR mix：12.5μl；內(nèi)參照引物5LO EX8S和5LO EX8A（10μM）各1μl；引物5-LO 254W（A管）/5-LO 254M（B管）和5LOEX6A（10μM）各1μl；模板（150-200ng/μl）：1μl；滅菌水；7.5μl，總體系25μl.

PCR反應條件：95℃預變性5min，然后按95℃30sec、56℃30sec、72℃1min，循環(huán)35次，末次循環(huán)后72℃延伸10min，4℃保存.

2.4瓊脂糖凝膠電泳和EB染色

首先量取瓊脂（Agar）粉0.75g，小心倒入到錐心瓶中，之后再加入1x TAE稀釋后的緩沖溶液40ml；放入微波爐中高溫煮至沸騰，搖晃3-4次，取出后等到瓊脂溶液冷卻至50度-55度之間時（小心瓊脂溶液不可以溫度過底而出現(xiàn)凝結），再慢慢傾入到制膠膜具和提前插好的梳子中；樣品孔應該對應放在陰極端；之后向電泳槽內(nèi)倒入1xTAE稀釋后緩沖溶液，液體的凹液面要略高于膠面2mm左右，打開電源后觀察左右端是否有氣泡產(chǎn)生，如有則表示電路正常開始跑電泳30分鐘.電泳跑完后，小心拿出瓊脂凝膠膜將其平移放入到備好EB染色液中暗光浸染30min，在凝膠成像系統(tǒng)（Tocan240）中觀察圖像并進行數(shù)據(jù)分析，再將測試圖像保留.

3　結果

3.1凝膠電泳結果

取PCR產(chǎn)物10ul，進行2%的瓊脂糖凝膠電泳，鑒定PCR擴增的結果，取5ulDNA markerI作為標記，條帶分別為600、500、400、300、200、100（bp），見圖1.

圖1　等位基因特異性PCR法檢測5-脂氧合酶E254K電泳結果

第1泳道為markerI，每個樣本分A和B兩管，A管加的是野生型引物，B管加的是突變型引物.第2和3泳道為一個樣本，結果顯示為A管和B管除了有內(nèi)參照物條帶外都出現(xiàn)了目的條帶，說明是雜合突變型GA.第4和5泳道為一個模板，說明也是雜合突變型GA.第6和7泳道為一個樣本，結果顯示A管除了有內(nèi)參照條帶外還有目的條帶，而B管未出現(xiàn)目的條帶說明為野生型GG；第8和9泳道為一個樣本，結果顯示為野生型GG.

3.2基因頻率和基因型頻率

該研究共檢測了200名蒙古族正常人群的5-LO基因E254K多態(tài)性位點，對比課題組之前研究的212名漢族正常人群中該位點的基因頻率和基因型頻率，見表1.

表1

4　結論

項目組檢測5-脂氧合酶E254K多態(tài)性在蒙古族正常人群中的分布情況，在200名蒙古族人中檢測出6人有該位點的雜合突變，基因型為GA，等位基因G的基因頻率為0.985，等位基因A的基因頻率為0.015，基因型頻率GG為0.97，GA為0.03.與課題組前期212名漢族正常人群中的分布情況進行對比，通過t檢驗統(tǒng)計分析結果顯示p＞0.05，說明該位點在蒙古族正常人群中的分布與漢族正常人群沒有顯著性的差異.該結果為研究5-LO E254K位點在蒙古族哮喘患者中的分布奠定了基礎.

〔1〕Chunying Bai，Eiko Matsui，HidenoriOhnishi，etal.A novelpolymorphism，E254K，in the5-lipoxygenase gene associated with bronchial asthma［J］.International Journal of Molecular Medicine，2008，21：139-144.

〔2〕Bai C，Yu X，Yun R，et al.Association of 5-lipoxygenase gene polymorphisms with bronchialasthma［J］.Exp Ther Med，2012，4（6）：967-971.

〔3〕白春英，周靜，瑞云，等.經(jīng)濟、有效提取外周血基因組DNA的方法［J］.檢驗醫(yī)學與臨床，2010（17）：1795-1798.

〔4〕李春曉，張曉龍，曹曉梅，等.特異性等位基因PCR擴增技術檢測家蠅擊倒抗性相關鈉通道的基因突變［J］.中國媒介生物學及控制雜志，2007，18（3）：255-256.

〔5〕徐克前.分子生物學檢驗技術實驗指導（第二版）［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2007：154-158.

〔6〕白春英，史鐵偉，瑞云，等.等位基因特異性PCR法檢測5-脂氧合酶基因多態(tài)性 ［J］.山東醫(yī)藥雜志，2012，52（31）：28-29.

R562.2

A

1673-260X（2016）10-0054-02

2016-06-05

白春英，赤峰學院醫(yī)學院分子醫(yī)學研究中心重點實驗室