申 琴，馬 強(qiáng)，劉春蓮，焦海燕

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·論著·

MUTYH基因多態(tài)性對(duì)原發(fā)性男性不育癥和精子DNA完整性的影響研究

申 琴，馬 強(qiáng)，劉春蓮，焦海燕

目的探討MUTYH基因rs3219489、rs10527342位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性(SNPs)對(duì)原發(fā)性男性不育癥和精子DNA完整性的影響及其與吸煙、飲酒的交互作用。 方法選取2011年8月—2012年12月在寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心門診就診的245例原發(fā)性男性不育癥患者為病例組，其中少精弱精癥患者166例(少精弱精癥亞組)、精液指標(biāo)正常男性不育癥患者79例(精液指標(biāo)正常亞組)；另選取同期在寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院體檢健康且有生育史的男性329例為對(duì)照組。采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)技術(shù)分析MUTYH基因rs3219489、rs10527342位點(diǎn)基因型分布和等位基因頻率。采用精子染色質(zhì)擴(kuò)散(SCD)試驗(yàn)檢測(cè)精子DNA損傷程度，采用精子DNA斷裂指數(shù)(DFI)表示。結(jié)果對(duì)照組與病例組MUTYH基因rs3219489位點(diǎn)GG、CG、CC基因型分布比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)； CG+CC基因型頻率和G、C等位基因頻率比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。對(duì)照組與病例組MUTYH基因rs10527342位點(diǎn)AA、AP、PP基因型分布，AP+PP基因型頻率和A、P等位基因頻率比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。對(duì)照組、少精弱精癥亞組與精液指標(biāo)正常亞組MUTYH基因rs3219489位點(diǎn)GG、CG、CC基因型分布比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；CG+CC基因型頻率和G、C等位基因頻率比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。3組MUTYH基因rs10527342位點(diǎn)AA、AP、PP基因型分布，AP+PP基因型頻率和A、P等位基因頻率比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。病例組精子DFI〔(46.2±22.3)%〕高于對(duì)照組〔(21.4±9.2)%〕(P<0.05)。少精弱精癥亞組與精液指標(biāo)正常亞組精子 DFI高于對(duì)照組，少精弱精癥亞組精子DFI高于精液指標(biāo)正常亞組(P<0.05)。MUTYH基因rs3219489、rs10527342位點(diǎn)不同基因型原發(fā)性男性不育癥患者精子 DFI 比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。MUTYH基因rs3219489位點(diǎn)與rs10527342位點(diǎn)間存在中度連鎖不平衡(D′=0.749，r2=0.289)。MUTYH基因rs3219489、rs10527342位點(diǎn)與吸煙、飲酒均不存在交互作用(P>0.05)。 結(jié)論MUTYH基因rs3219489位點(diǎn)的C等位基因可能是原發(fā)性男性不育癥的保護(hù)因素，rs10527342位點(diǎn)可能與原發(fā)性男性不育癥無關(guān)。精子DFI的增加可能會(huì)導(dǎo)致原發(fā)性男性不育癥的患病風(fēng)險(xiǎn)增加。rs3219489、rs10527342位點(diǎn)可能對(duì)精子DNA完整性沒有影響，且與吸煙、飲酒均無交互作用。

不育,男(雄)性；MUTYH基因；多態(tài)性,單核苷酸；精子；DNA

申琴，馬強(qiáng)，劉春蓮，等.MUTYH基因多態(tài)性對(duì)原發(fā)性男性不育癥和精子DNA完整性的影響研究[J].中國全科醫(yī)學(xué)，2016，19(30)：3698-3704.[www.chinagp.net]

SHEN Q，MA Q，LIU C L，et al.Effect of MUTYH gene polymorphisms on primary male infertility and sperm DNA integrity[J].Chinese General Practice，2016，19(30)：3698-3704.

引起男性不育的病因復(fù)雜，如精子發(fā)生障礙、環(huán)境因素等，其中有70%以上的男性不育原因不明，臨床上稱為原發(fā)性男性不育癥(包括原發(fā)性無精子癥及少弱畸精子癥)。在很大程度上，原發(fā)性男性不育癥是由于精子發(fā)生過程中，相關(guān)基因的突變導(dǎo)致異常的生精過程所引起的不育[1]。精子發(fā)生(spermatogenesis)是一個(gè)高度復(fù)雜的細(xì)胞增生與分化過程，涉及睪丸內(nèi)大量活性氧(ROS)的損害以及吸煙、飲酒等環(huán)境因素的影響，從而導(dǎo)致DNA損傷[2]。RYBAR等[3]指出，在原發(fā)性男性不育癥患者中，精子DNA損傷率較正常人明顯升高，說明精子DNA損傷與原發(fā)性男性不育癥密切相關(guān)。堿基切除修復(fù)MUTYH基因是DNA損傷修復(fù)中的主要途徑[4]。MUTYH基因功能的異常會(huì)導(dǎo)致低效的DNA修復(fù)和8-羥脫氧鳥苷(8-OHdG)的積累，造成DNA損傷[5]。MUTYH基因rs10527342位點(diǎn)(AluYb8MUTYH)和rs3219489位點(diǎn)(Gln324His)單核苷酸多態(tài)性(SNPs)是錯(cuò)義突變位點(diǎn)，可能影響MUTYH基因的功能，從而導(dǎo)致個(gè)體DNA修復(fù)能力異常。因此，本研究探討MUTYH 基因多態(tài)性與原發(fā)性男性不育癥和精子DNA完整性的關(guān)系及其與吸煙、飲酒的交互作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1　對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象選取2011年8月—2012年12月在寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心門診就診的245例原發(fā)性男性不育癥患者為病例組，其中少精弱精癥患者166例(少精弱精癥亞組)、精液指標(biāo)正常男性不育癥患者79例(精液指標(biāo)正常亞組)；年齡21～43歲，平均年齡(32.5±5.9)歲；符合《世界衛(wèi)生組織人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》的診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]，排除染色體異常者、Y染色體微缺失者、梗阻性無精子癥和激素異常者。另選取同期在寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院體檢健康且有生育史的男性329例為對(duì)照組，年齡28～71歲，平均年齡(51.0±15.5)歲。

1.2吸煙與飲酒情況收集受試者吸煙與飲酒情況，其中吸煙定義為每天吸煙不少于1支，持續(xù)1年，或總量不少于18包/年。飲酒定義為每周飲酒不少于2次；白酒不少于50 g/次，或其他酒類不少于500 ml/次。達(dá)不到此標(biāo)準(zhǔn)認(rèn)定為不吸煙和不飲酒。

1.3標(biāo)本采集使用含有乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝劑的靜脈采血管抽取外周靜脈血3 ml，-20 ℃保存，用于基因組DNA提?。徊±M患者提供1份精液標(biāo)本(手淫法采集精液，收集患者一次排精量的精液)，-80 ℃保存，用于精子染色質(zhì)擴(kuò)散(SCD)試驗(yàn)。另外收集67例對(duì)照組男性的精液標(biāo)本作為SCD試驗(yàn)的對(duì)照。本研究通過了寧夏醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)并獲得所有受試者的知情同意。

1.4MUTYH基因SNPs分型

1.4.1DNA提取嚴(yán)格按照全血細(xì)胞DNA提取試劑盒說明書〔天根生化科技(北京)有限公司〕提取外周血基因組DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)進(jìn)行SNPs分型從文獻(xiàn)中查找 rs3219489位點(diǎn)[7]和 rs10527342位點(diǎn)[5]引物(見表1)，均在GeneBank中進(jìn)行序列比對(duì)驗(yàn)證。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR 反應(yīng)體系：雙蒸水(ddH2O)4.625 μl，2×Masteer Mix 6.25 μl，DNA聚合酶0.125 μl，上游引物0.25 μl，下游引物0.25 μl，DNA 1.0 μl。擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，68 ℃/63 ℃ 退火45 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)35次；72 ℃總延伸10 min。采用RsaⅠ和AluYb8 限制性內(nèi)切酶(NEB公司)分別對(duì)rs3219489、rs10527342位點(diǎn)PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)3.0%瓊脂糖凝膠電泳后用Gel Doc-2000凝膠成像系統(tǒng)觀察條帶分布來判斷基因型。隨機(jī)抽取30例樣本進(jìn)行兩個(gè)位點(diǎn)的PCR-RFLP重復(fù)試驗(yàn)，保證酶切結(jié)果的正確性。每種基因型各挑選2例患者，經(jīng)PCR擴(kuò)增后進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，以確?；蚍中偷臏?zhǔn)確性。

1.5SCD試驗(yàn)采用SCD試驗(yàn)檢測(cè)兩組精子DNA損傷程度。計(jì)數(shù)300個(gè)精子，觀察精子光暈大小，根據(jù)精子光暈與精子頭橫徑的比例，分為大、中、小和無光暈4個(gè)等級(jí)：大光暈：>2/3精子頭橫徑，中光暈：>1/3～2/3精子頭橫徑，小光暈：≤1/3精子頭橫徑。大光暈和中光暈表示精子DNA完整無碎片，小光暈和無光暈表示精子DNA斷裂為碎片。精子DNA損傷程度采用精子DNA斷裂指數(shù)(DNA fragment index,DFI) 表示，DFI=(小光暈精子數(shù)+無光暈精子數(shù))/精子總數(shù)×100%。

2　結(jié)果

2.1Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)對(duì)照組MUTYH基因rs3219489、rs10527342位點(diǎn)基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡(χ2值分別為1.23和1.09，P>0.05)，說明本研究所選的樣本具有群體代表性。2.2對(duì)照組與病例組MUTYH基因rs3219489、rs10527342位點(diǎn)基因型分布和等位基因頻率比較對(duì)照組與病例組MUTYH基因rs3219489位點(diǎn)GG、CG、CC基因型分布比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；CG+CC基因型頻率，G、C等位基因頻率比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在顯性遺傳模型下，攜帶CG+CC基因型個(gè)體患原發(fā)性男性不育癥的風(fēng)險(xiǎn)是攜帶GG型個(gè)體的0.69倍〔OR=0.69，95%CI(0.49，0.96)〕；攜帶C等位基因個(gè)體患原發(fā)性男性不育癥的風(fēng)險(xiǎn)是攜帶G等位基因個(gè)體的0.75倍〔OR=0.75，95%CI(0.59，0.95)〕。對(duì)照組與病例組MUTYH基因rs10527342位點(diǎn)AA、AP、PP基因型分布，AP+PP基因型頻率和A、P等位基因頻率比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見表2)。

2.3對(duì)照組、少精弱精癥亞組與精液指標(biāo)正常亞組MUTYH基因rs3219489、rs10527342位點(diǎn)基因型分布和等位基因頻率比較對(duì)照組、少精弱精癥亞組與精液指標(biāo)正常亞組MUTYH基因rs3219489位點(diǎn)GG、CG、CC基因型分布比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；CG+CC基因型頻率和G、C等位基因頻率比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中精液指標(biāo)正常亞組MUTYH基因rs3219489位點(diǎn)CG+CC基因型頻率和C等位基因頻率低于對(duì)照組和少精弱精癥亞組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；對(duì)照組與少精弱精癥亞組MUTYH基因CG+CC基因型頻率和G、C等位基因頻率比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。攜帶CG+CC型個(gè)體患精液指標(biāo)正常男性不育癥的風(fēng)險(xiǎn)是攜帶GG型個(gè)體的0.50倍〔OR=0.50,95%CI(0.30，0.82)〕；攜帶C等位基因個(gè)體患精液指標(biāo)正常男性不育癥的風(fēng)險(xiǎn)是攜帶G等位基因個(gè)體的0.56倍〔OR=0.56，95%CI(0.38，0.82)〕。對(duì)照組、少精弱精癥亞組與精液指標(biāo)正常亞組MUTYH基因rs10527342位點(diǎn)AA、AP、PP基因型分布，AP+PP基因型頻率和A、P等位基因頻率比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見表3)。

2.4各組精子DFI比較病例組精子DFI〔(46.2±22.3)%〕高于對(duì)照組〔(21.4±9.2)%〕，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.01，P<0.05)。對(duì)照組、少精弱精癥亞組與精液指標(biāo)正常亞組精子DFI比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中少精弱精癥亞組與精液指標(biāo)正常亞組精子DFI高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；少精弱精癥亞組精子DFI高于精液指標(biāo)正常亞組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表4)。

表1　MUTYH基因rs3219489、rs10527342位點(diǎn)SNPs分型基本信息

注：引物序列中的小寫字母為人工引入的錯(cuò)配堿基；rs10527342位點(diǎn)是由326 bp的AluYb8元件反向插入MUTYH基因第15內(nèi)含子中形成，是一種插入/缺失變異(A→P)

表2　對(duì)照組與病例組MUTYH基因rs3219489、rs10527342位點(diǎn)基因型分布和等位基因頻率比較〔n(%)〕

表3對(duì)照組、少精弱精癥亞組與精液指標(biāo)正常亞組MUTYH基因rs3219489、rs10527342位點(diǎn)基因型分布和等位基因頻率比較〔n(%)〕

Table 3Comparison of genotype distribution and allele frequency of MUTYH rs3219489 and rs10527342 among control group,oligoasthenospermia subgroup and normozoospermia subgroup

組別例數(shù)rs3219489位點(diǎn)基因型GG CG CC CG+CC 等位基因G Crs10527342位點(diǎn)基因型AA AP PP AP+PP 等位基因A P對(duì)照組329123(37.4)153(46.5)53(16.1)206(62.6)399(60.6)259(39.4)94(28.6)159(48.3)76(23.1)235(71.4)347(52.7)311(47.3)少精弱精癥亞組16671(42.8)72(43.4)23(13.8)95(57.2)214(64.5)118(35.5)49(29.5)83(50.0)34(20.5)117(70.5)181(54.5)151(45.5)精液指標(biāo)正常亞組 79 43(54.4)30(38.0)6(7.6)36(45.6)ab116(73.4)43(26.6)ab16(20.3)46(58.2)17(21.5)63(79.7)78(49.4)80(50.6)χ2值8.977.858.583.472.591.14P值0.060.020.010.480.270.57

注：與對(duì)照組比較，aP<0.05；與少精弱精癥亞組比較，bP<0.05

Table 4Comparison of sperm DFI among control group,oligoasthenospermia subgroup and normozoospermia subgroup

組別例數(shù)精子DFI對(duì)照組6721.4±9.2少精弱精癥亞組16650.0±22.1a精液指標(biāo)正常亞組7938.2±20.7abF值32.80P值<0.01

注：DFI=DNA斷裂指數(shù)；與對(duì)照組比較，aP<0.05；與少精弱精癥亞組比較，bP<0.05

2.5原發(fā)性男性不育癥患者M(jìn)UTYH基因rs3219489、rs10527342位點(diǎn)不同基因型間精子 DFI 比較MUTYH基因rs3219489位點(diǎn)GG、CG、CC基因型原發(fā)性男性不育癥患者精子 DFI 比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見表5)；MUTYH基因rs10527342位點(diǎn)AA、AP、PP基因型原發(fā)性男性不育癥患者精子 DFI 比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見表6)。

2.6MUTYH基因rs3219489、rs10527342位點(diǎn)遺傳易患性分析及其與吸煙、飲酒的交互作用采用Haploview軟件分析MUTYH基因rs3219489、rs10527342位點(diǎn)的單體型，結(jié)果顯示，MUTYH基因rs3219489位點(diǎn)與rs10527342位點(diǎn)間存在中度連鎖不平衡(D′=0.749，r2=0.289)。采用單純病例研究，將研究對(duì)象按照基因型和環(huán)境因素進(jìn)行分組，探討基因-環(huán)境交互作用對(duì)原發(fā)性男性不育癥患病風(fēng)險(xiǎn)的影響，結(jié)果顯示，MUTYH基因rs3219489、rs10527342位點(diǎn)與吸煙、飲酒均不存在交互作用(P>0.05，見表7)。

表7　 MUTYH基因rs3219489、rs10527342位點(diǎn)與吸煙、飲酒對(duì)原發(fā)性男性不育癥發(fā)病影響的交互作用(例)

注:a數(shù)據(jù)有刪失，表中數(shù)據(jù)剔除刪失數(shù)據(jù)

Table 5Comparison of sperm DFI among GG,CG and CC genotypes of MUTYH rs3219489 of patients with primary male infertility

基因型例數(shù)精子DFIGG11444±21CG10250±24CC2941±21F值0.32P值0.73

Table 6Comparison of sperm DFI of AA,AP and PP genotypes of MUTYH 10527342 of patients with primary male infertility

基因型例數(shù)精子DFIAA6543±19AP12948±24PP5146±22F值0.40P值0.68

3　討論

人精子染色質(zhì)由DNA雙鏈和魚精蛋白結(jié)合而形成高度濃縮的結(jié)構(gòu)，易受到遺傳或吸煙、飲酒等環(huán)境因素的損傷，是影響男性不育的重要因素之一[7]。人類DNA損傷修復(fù)系統(tǒng)主要包括：錯(cuò)配修復(fù)通路、堿基切除修復(fù)通路、核酸切除修復(fù)通路及雙鏈斷裂修復(fù)通路等[8]。MUTYH 基因定位于 1p32.1～1p34.3 ，長7.1 kb，含有16個(gè)外顯子，編碼一個(gè)535個(gè)氨基酸的蛋白[9]，MUTYH是堿基切除修復(fù)通路的關(guān)鍵蛋白，是一種特異的腺嘌呤轉(zhuǎn)葡糖基酶，定位于細(xì)胞核和線粒體內(nèi)[10]。復(fù)制DNA后MUTYH迅速掃描子鏈 DNA，切除子鏈DNA中與母鏈8-OHdG錯(cuò)配的A[11]。MUTYH基因功能的異常會(huì)導(dǎo)致低效的DNA修復(fù)和8-OHdG的積累，造成DNA損傷。如果MUTYH 失活，則會(huì)因8-OHdG的異常積累引起G∶C→T∶A的堿基置換，從而引起相關(guān)基因及其蛋白發(fā)生功能性改變[12]。研究證實(shí)，rs3219489 (G→C，Gln324His)位點(diǎn)CC基因型會(huì)增加瑞典人群和日本人群直腸癌的患病風(fēng)險(xiǎn)[13]，提示rs3219489位點(diǎn)可能會(huì)導(dǎo)致遺傳不穩(wěn)定性。rs10527342位點(diǎn)是由AluYb8元件反向插入MUTYH基因第15內(nèi)含子中形成的一個(gè)常見變異[14]。AluYb8 MUTYH 突變純合子或雜合子個(gè)體基因組中8-OHdG水平顯著高于野生純合子，并且是中國人群2型糖尿病的危險(xiǎn)因素[15]，提示該位點(diǎn)可導(dǎo)致MUTYH的功能異常。大量證據(jù)表明，MutY糖基化酶同系物(MUTYH)在許多癌癥的發(fā)病機(jī)制中扮演著重要角色[16]，并且MUTYH基因多態(tài)性是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的危險(xiǎn)因素[17]。2型糖尿病、腫瘤、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎以及男性不育等均是復(fù)雜的多基因疾病，受環(huán)境和遺傳因素影響[18-21]。故推測(cè)MUTYH 基因的多態(tài)性可能會(huì)影響精子DNA完整性及原發(fā)性男性不育癥。

rs3219489位點(diǎn)位于MUTYH基因的編碼區(qū)[22]，其G/C等位基因的變化可以直接影響蛋白質(zhì)的功能，因此可以產(chǎn)生嚴(yán)重的表型后果[23-24]。CZARNY等[25]研究表明,rs3219489位點(diǎn)GG基因型增強(qiáng)遲發(fā)性復(fù)發(fā)類型的風(fēng)險(xiǎn)。CAI等[26]研究發(fā)現(xiàn)，rs3219489位點(diǎn)GG基因型、rs10527342位點(diǎn)均增加終末期腎臟疾病的風(fēng)險(xiǎn)，而CC基因型增加患直腸癌的風(fēng)險(xiǎn)[27]，本研究結(jié)果顯示，MUTYH 基因rs3219489位點(diǎn)與原發(fā)性男性不育癥有關(guān)，攜帶CG+CC型個(gè)體患原發(fā)性男性不育癥的風(fēng)險(xiǎn)較攜帶GG型個(gè)體低，攜帶C等位基因個(gè)體患原發(fā)性男性不育癥的風(fēng)險(xiǎn)較攜帶G等位基因個(gè)體低；MUTYH 基因rs3219489位點(diǎn)與精液指標(biāo)正常男性不育癥有關(guān)，攜帶CG+CC型個(gè)體患精液指標(biāo)正常男性不育癥風(fēng)險(xiǎn)較攜帶GG型的個(gè)體低。G、C等位基因頻率分布在精液指標(biāo)正常亞組與對(duì)照組和少精弱精癥亞組中亦有差異，攜帶C等位基因個(gè)體患精液指標(biāo)正常男性不育癥的風(fēng)險(xiǎn)是攜帶G等位基因個(gè)體的0.56倍，提示MUTYH 基因rs3219489位點(diǎn)的C等位基因可能是原發(fā)性男性不育癥的保護(hù)因素；但是MUTYH 基因rs3219489位點(diǎn)3種不同基因型個(gè)體間精子DFI并無差異，提示MUTYH 基因rs3219489位點(diǎn)可能是通過更復(fù)雜的機(jī)制參與原發(fā)性男性不育癥的發(fā)病過程。本研究探討MUTYH 基因rs3219489位點(diǎn)與原發(fā)性男性不育癥的遺傳易患性，還需更多的研究來驗(yàn)證。MUTYH 基因rs10527342位點(diǎn)的變異基因型(PP和AP)并不會(huì)對(duì)原發(fā)性男性不育癥的遺傳易患性和精子DFI產(chǎn)生影響，同時(shí)，其與吸煙和飲酒也無交互作用。此位點(diǎn)還有待于在不同地區(qū)、不同人群中驗(yàn)證，進(jìn)一步明確二者之間的關(guān)系。

本研究SCD試驗(yàn)結(jié)果表明，病例組患者精子 DFI 高于對(duì)照組，提示精子DFI的增加可能會(huì)增加原發(fā)性男性不育癥的患病風(fēng)險(xiǎn)。精子DNA完整性降低不僅會(huì)影響精子的活力，導(dǎo)致流產(chǎn)[28]，還會(huì)降低輔助生殖技術(shù)治療的受精率和優(yōu)質(zhì)胚胎率[29]。此外，嚴(yán)重的精子DNA損傷還和輔助生殖技術(shù)成功率低有關(guān)[30]。因此，精子DNA完整性降低不僅可降低男性生育力，也會(huì)影響后續(xù)的輔助生殖治療結(jié)果。

綜上所述，精子DNA損傷修復(fù)是多基因、多步驟、多通路的復(fù)雜過程，同時(shí)與環(huán)境因素有關(guān)，雖然MUTYH基因rs3219489、rs10527342位點(diǎn)對(duì)原發(fā)性男性不育癥的發(fā)病沒有貢獻(xiàn)，可能對(duì)精子DNA完整性沒有影響，但此基因可能是微效基因，與其他相關(guān)基因的交互可能與原發(fā)性男性不育癥相關(guān)。此外，本研究選取的研究對(duì)象是中國北方寧夏地區(qū)人群，證實(shí)了MUTYH基因rs3219489、rs10527342位點(diǎn)SNPs與本地區(qū)原發(fā)性男性不育癥的發(fā)病無關(guān)，但可能只能反映寧夏地區(qū)人群的特征，此位點(diǎn)SNPs與不同人種、不同地區(qū)原發(fā)性男性不育癥是否相關(guān)，有待于不同人群、多地區(qū)的研究證實(shí)。

作者貢獻(xiàn)：申琴進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)與實(shí)施、資料收集整理、撰寫論文、成文并對(duì)文章負(fù)責(zé)；申琴、馬強(qiáng)、劉春蓮進(jìn)行試驗(yàn)實(shí)施、評(píng)估、資料收集；焦海燕進(jìn)行質(zhì)量控制及審校。

本文無利益沖突。

[1]TüTTELMANN F，RAJPERT-DE MEYTS E，NIESCHLAG E，et al.Gene polymorphisms and male infertility——a meta-analysis and literature review[J].Reprod Biomed Online，2007，15(6):643-658.

[2]TAHA E A，EZ-ALDIN A M，SAYED S K，et al.Effect of smoking on sperm vitality，DNA integrity，seminal oxidative stress，zinc in fertile men[J].Urology，2012，80(4):822-825.DOI:10.1016/j.urology.2012.07.002.

[3]RYBAR R，MARKOVA P，VEZNIK Z，et al.Sperm chromatin integrity in young men with no experiences of infertility and men from idiopathic infertility couples[J].Andrologia，2009，41(3):141-149.DOI:10.1111/j.1439-0272.2008.00905.

[4]ENGSTROM L M，BRINKMEYER M K，HA Y，et al.A zinc linchpin motif in the MUTYH glycosylase interdomain connector is required for efficient repair of DNA damage[J].J Am Chem Soc，2014，136(22):7829-7832.DOI:10.1021/ja502942d.

[5]CHEN H，SUN C，GUO W，et al.AluYb8 insertion in the MUTYH gene is related to increased 8-OHdG in genomic DNA and could be a risk factor for type 2 diabetes in a Chinese population[J].Mol Cell Endocrinol，2011，332(1/2):301-305.DOI:10.1016/j.mce.2010.11.021.

[6]谷翊群.世界衛(wèi)生組織人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)[M].5版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2001.

[7]BUNGUM M.Sperm DNA integrity assessment:a new tool in diagnosis and treatment of fertility[J].Obstet Gynecol Int，2012,2012:531042.DOI:10.1155/2012/531042.

[8]YSHAHI A，LEE J H，KANG Y， et al.Mismatch-repair protein MSH6 is associated with Ku70 and regulates DNA double-strand break repair[J].Nucleic Acids Res,2011，39(6):2130-2143.DOI:10.1093/nar/gkq1095.

[9]BRINKMEYER M K，DAVID S S.Distinct functional consequences of MUTYH variants associated with colorectal cancer:damaged DNA affinity，glycosylase activity and interaction with PCNA and Hus1[J].DNA Repair (Amst),2015，34:39-51.DOI:10.1016/j.dnarep.2015.08.001.

[10]MARKKANEN E，HüBSCHER U，VAN LOON B.Regulation of oxidative DNA damage repair:the adenine:8-oxo-guanine problem[J].Cell Cycle,2012，11(6):1070-1075.DOI:10.4161/cc.11.6.19448.

[11]WANG L，LEE S J，VERDINE G L.Structural basis for avoidance of promutagenic DNA repair by MutY adenine DNA glycosylase[J].J Biol Chem,2015，290(28):17096-17105.DOI:10.1074/jbc.M115.657866.

[12]CHEN H，SUN C，GUO W，et al.AluYb8 insertion in the MUTYH gene is related to increased 8-OHdG in genomic DNA and could be a risk factor for type 2 diabetes in a Chinese population[J].Mol Cell Endocrinol,2011，332(1/2):301-305.DOI:10.1016/j.mce.2010.11.021.

[13]KUNO T，MATSUBARA N，TSUDA S，et al.Alterations of the base excision repair gene MUTYH in sporadic colorectal cancer[J].Oncol Rep,2012,28(2):473-480.DOI:10.3892/or.2012.1836.

[14]SUN C，CHEN H，GUO W，et al.A common mutation of the MYH gene is associated with increased DNA oxidation and age-related diseases[J].Free Radic Biol Med，2010，48(3):430-436.DOI:10.1016/j.freeradbiomed.2009.11.015.

[15]CAO L，ZHOU W，ZHU Y，et al.Combined analysis of polymorphism variants in hMTH1，hOGG1 and MUTYH genes on the risk of type 2 diabetes in the Chinese population[J].Gene,2013,519(1):50-54.DOI:10.1016/j.gene.2013.01.053.

[16]KONG F，HAN X Y，LUAN Y，et al.MUTYH association with esophageal adenocarcinoma in a Han Chinese population[J].Asian Pac J Cancer Prev，2013，14(11):6411-6413.

[17]KUNG Y J,TSAI K S,HUANG C M，et al.MUTYH gene polymorphisms as risk factors for rheumatoid arthritis[J].Biomed Res Int，2015，2015:893796.DOI:10.1155/2015/893796.

[18]AL MUFTAH W A，AL-SHAFAI M，ZAGHLOOL S B，et al.Epigenetic associations of type 2 diabetes and BMI in an Arab population[J].Clin Epigenetics,2016，8:13.DOI:10.1186/s13148-016-0177-6.

[19]ZHAO Z，WEN W，MICHAILIDOU K，et al.Association of genetic susceptibility variants for type 2 diabetes with breast cancer risk in women of European ancestry[J].Cancer Causes Control,2016,27(5):679-693.DOI:10.1007/s10552-016-0741-6.

[20]ADTANI P，MALATHI N.Epstein-Barr virus and its association with rheumatoid arthritis and oral lichen planus[J].J Oral Maxillofac Pathol,2015,19(3):282-295.DOI:10.4103/0973-029X.174643.

[22]SYNOWIEC E，WJCIK K A，CZUBATKA A，et al.Lack of association between polymorphisms of the DNA base excision repair genes MUTYH and hOGG1 and keratoconus in a Polish subpopulation[J].Arch Med Sci，2015，11(5):1101-1110.DOI:10.5114/aoms.2015.54867.

[23]NG P C，HENIKOFF S.Predicting the effects of amino acid substitutions on protein function[J].Annu Rev Genomics Hum Genet，2006，7:61-80.

[24]LEE P H，SHATKAY H.F-SNP:computationally predicted functional SNPs for disease association studies[J].Nucleic Acids Res,2008,36(Database issue):D820-824.

[25]CZARNY P，KWIATKOWSKI D，GALECKI P，et al.Association between single nucleotide polymorphisms of MUTYH，hOGG1 and NEIL1 genes，and depression[J].J Affect Disord，2015,184:90-96.DOI:10.1016/j.jad.2015.05.044.

[26]CAI Z，CHEN H，TAO J，et al.Association of base excision repair gene polymorphisms with ESRD risk in a Chinese population[J].Oxid Med Cell Longev,2012,2012:928421.DOI:10.1155/2012/928421.

[27]PICELLI S，ZAJAC P，ZHOU X L，et al.Common variants in human CRC genes as low-risk alleles[J].Eur J Cancer,2010,46:1041-1048.DOI:10.1016/j.ejca.2010.01.013.

[28]ROBINSON L，GALLOS I D，CONNER S J，et al.The effect of sperm DNA fragmentation on miscarriage rates:a systematic review and meta-analysis[J].Hum Reprod，2012，27(10):2908-2917.DOI:10.1093/humrep/des261.

[29]SIMON L，PROUTSKI I，STEVENSON M，et al.Sperm DNA damage has a negative association with live-birth rates after IVF[J].Reprod Biomed Online，2013，26(1):68-78.DOI:10.1016/j.rbmo.2012.09.019.

[30]BUCAR S，GON?ALVES A，ROCHA E，et al.DNA fragmentation in human sperm after magnetic-activated cell sorting[J].J Assist Reprod Genet,2015,32(1):147-154.DOI:10.1007/s10815-014-0370-5.

(本文編輯：陳素芳)

Effect of MUTYH Gene Polymorphisms on Primary Male Infertility and Sperm DNA Integrity

SHENQin，MAQiang，LIUChun-lian，JIAOHai-yan.

KeyLaboratoryofFertilityMaintainingoftheMinistryofEducation,NingxiaMedicalUniversity,Yinchuan750004,China

Correspondingauthor：JIAOHai-yan,KeyLaboratoryofFertilityMaintainingoftheMinistryofEducation,NingxiaMedicalUniversity,Yinchuan750004,China；E-mail：hyjiao1602@hotmail.com

ObjectiveTo evaluate the effect of two SNPs (rs3219489 and rs10527342) of MUTYH gene on primary male infertility and sperm DNA integrity and their interaction with smoking and alcohol consumption.Methods245 primary male infertile patients who received treatment in the Outpatient Department of the Center for Reproductive Medicine in the General Hospital of Ningxia Medical University from August 2011 to December 2012 were selected as case group,including 166 patients with oligoasthenospermia (oligoasthenospermia subgroup) and 79 patients with normozoospermia male infertility (normozoospermia subgroup),and 329 healthy males with reproductive history from the physical examination of the hospital in the same period were selected as control group.PCR-RFLP was employed to analyze the genotype distribution and allele frequency of MUTYH rs3219489 and rs10527342.The damage degree of DNA was determined by sperm chromatin dispersion and was manifested by sperm DNA fracture index (DFI).ResultsControl group and case group were not significantly different in the distribution of GG,CG and CC genotypes of MUTYH rs3219489 (P>0.05),but were significantly different in the frequency of CG+CC genotype and G and C allele frequency (P<0.05).Control group and case group were not significantly different in the distribution of AP,AP and PP genotypes,the frequency of AP+PP genotype and the A and P allele frequency of MUTYH rs10527342(P>0.05).Control group,oligoasthenospermia subgroup and normozoospermia subgroup were not significantly different in the distribution of GG,CG and CC genotypes of MUTYH rs3219489 (P>0.05),but were significantly different in the frequency of CG+CC genotype and the G and C allele frequency (P<0.05).The three groups were not significantly different in the distribution of AA,AP and PP genotypes,the frequency of AP+PP genotype and the A and P allele frequency of MUTYH rs10527342(P>0.05).Case group was higher than control group in sperm DFI〔(46.2±22.3)% vs.(21.4±9.2)%〕(P<0.05).Oligoasthenospermia subgroup and normozoospermia subgroup were higher than control group in sperm DFI,and oligoasthenospermia subgroup was higher than normozoospermia subgroup in sperm DFI (P<0.05).There were no significant differences in sperm DFI among patients with different genotypes of MUTYH rs3219489 and rs10527342 (P>0.05).Moderate linkage disequilibrium existed between MUTYH rs3219489 and rs10527342 (D′=0.749，r2=0.289).There were no interaction of MUTYH rs3219489 and rs10527342 with smoking and alcholic consumption (P>0.05).ConclusionC allele of MUTYH rs3219489 may be a protective factor for primary male infertility,and MUTYH rs10527342 may have correlation with primary male infertility.The increase of sperm DFI may cause the increase in the risk of primary male infertility,and rs3219489 and rs10527342 may have no correlation with the integrity of sperm DNA and have no interaction with smoking and alcoholic consumption.

Infertility,male；MUTYH gene；Polymorphism,single nucleotide；Spermatozoa；DNA

寧夏回族自治區(qū)自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(NZ14070)

750004寧夏銀川市，寧夏醫(yī)科大學(xué)生育力保持教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與細(xì)胞學(xué)系(申琴，焦海燕)；川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科(馬強(qiáng))；寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心(劉春蓮)

焦海燕，750004寧夏銀川市，寧夏醫(yī)科大學(xué)生育力保持教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與細(xì)胞學(xué)系；

E-mail：hyjiao1602@hotmail.com

R 698.2

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2016.30.012

2016-03-24；

2016-08-12)