章毅，許惠利，王鋒，王哲，李春麗，陳亮

不同代次人胎盤間充質(zhì)干細胞的生物活性比較研究

章毅，許惠利，王鋒，王哲，李春麗，陳亮

目的 旨在觀察不同代次人胎盤間充質(zhì)干細胞（PMSCs）體外培養(yǎng)的生物學特性和體外誘導分化潛能，為間充質(zhì)干細胞臨床應用安全性及有效性提供實驗依據(jù)。

方法 無菌條件下獲取人足月胎兒胎盤組織，通過 II 型膠原酶消化法分離 PMSCs，在常規(guī)培養(yǎng)條件下培養(yǎng)至第9 代，倒置相差顯微鏡觀察 P0、P3、P6、P9 代次的間充質(zhì)干細胞細胞形態(tài)；MTT 活細胞計數(shù)法檢測細胞生長增殖能力；流式細胞術分析細胞周期及表面標志物的陽性表達率。同時進行成脂、成骨、成軟骨誘導分化，誘導 14 d 后分別進行油紅 O 染色、茜素紅 S 染色、Masson 染色鑒定，觀察并比較不同代次 PMSCs 的多向誘導分化能力。

結果 PMSCs 具有很強的貼壁能力，主要呈紡錘梭形，不同代次的 PMSCs 有不同的體外增殖能力，以P0、P3 代較強；均高表達 CD73、CD90、CD105，低表達 CD14、CD34、CD45 和 CD20。細胞周期中 G0/G1 期細胞所占比例 P0為 90.95%、P3 為 88.97%、P6 為 85.93%、P9 為 67.89%，誘導分化實驗顯示，P6、P9 代細胞多向誘導分化能力逐漸降低。

結論 提示在選擇胎盤間充質(zhì)干細胞作為種子細胞時，應注意選擇適宜的擴增代數(shù)，以便既能保證足夠的細胞數(shù)目又能保留細胞最佳的分化能力。

胎盤； 間質(zhì)干細胞； 細胞周期； 多向誘導分化

www.cmbp.net.cn 中國醫(yī)藥生物技術, 2016, 11(5):400-406

間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一群中胚層來源的具有自我更新和多向分化潛能的多能干細胞，在適宜的培養(yǎng)條件下可被誘導分化成各種組織細胞，包括骨細胞、肌肉細胞、脂肪細胞等［1］。最新研究表明，MSCs 易于外源基因?qū)氡磉_［2］，而且具有調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的功能［3］，因此不僅可作為組織工程的種子細胞，也為基因治療提供了一個可靠的工具，同時在誘導移植耐受和治療自身免疫性疾病中具有廣泛的應用前景。目前報道的 MSCs 主要來源于骨髓，但骨髓中的含量很低，僅占骨髓中單個核細胞的 1/106～ 1/105［4］，且有時因病毒感染或因衰老使骨髓中細胞數(shù)量顯著降低或骨髓增生分化功能降低，使骨髓來源的 MSCs受到了限制。故尋找一種能替代骨髓 MSCs，并可彌補其缺陷的 MSCs 來源已越來越受到重視［5］。

胎盤是胎兒與母體之間進行物質(zhì)交換的器官，起源于胚胎發(fā)育期胚外中胚層，是由間質(zhì)、血管及滋養(yǎng)細胞組成，含有大量的間充質(zhì)成分。最新的研究表明胎盤中含有豐富的干細胞，由于其細胞形態(tài)、增殖能力、表面抗原標志、基因表達等與骨髓間充質(zhì)干細胞高度相似，而且也具有多向分化的潛能。從胎盤中分離培養(yǎng)出這些多能干細胞將為實驗研究和臨床應用開辟一個嶄新而豐富的間充質(zhì)干細胞來源［6］。

為了使 PMSCs 能更好、更持久地應用于臨床修復組織細胞和器官，在移植前評估此細胞的生物活性顯得尤為重要，目前國內(nèi)外研究表明，各代PMSCs 增殖能力及生物活性是否相同仍無定論［7］。關于 PMSCs 不同代次生物活性的系統(tǒng)研究更是少之又少，本實驗通過對不同代次 PMSCs 的增殖能力、細胞周期及多向誘導分化潛能進行觀察分析，為種子細胞移植的選取提供更多實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和主要試劑

胎盤采自足月健康新生兒，在符合國家相關法律和倫理委員會同意下，經(jīng)產(chǎn)婦或家屬簽署知情同意書后獲得。成脂、成軟骨、成骨誘導套裝購自美國 Gibco 公司；MTT 試劑盒購自碧云天公司；PI、RNase A 購自美國 Sigma 公司；MSC PhenotypingKit（CD105-PE、CD90-FITC、CD73-APC、CD14-/CD20-/CD34-/CD45-PerCP）購自德國Miltenyi Biotec 公司；油紅 O 染液、Masson 染液、茜素紅 S 染液購自南京建成公司；CO2恒溫培養(yǎng)箱、酶標儀購自美國 Thermo 公司；顯微設備購自美國 Olympus 公司；流式細胞儀購自美國 BD Bioscience 公司。

1.2 方法

1.2.1 PMSCs 的分離培養(yǎng) 無菌條件下剪取胎盤絨毛膜組織，剪成約 5 mm3的碎塊，加入 II 型膠原酶恒溫消化 1.5 h，室溫條件下以 2000 r/min離心 10 min，加入含 10% FBS 的培養(yǎng)液重懸細胞，置于 37 ℃、體積分數(shù)為 5% CO2恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，根據(jù)黏附性差異使 PMSCs 與其他組織細胞分離，經(jīng)過表面標志物鑒定，從而確定為 PMSCs。在倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)和生長情況，待細胞融合度達到 80% ～ 90% 時，胰酶消化傳代，每 2 ～ 3 天傳代 1 次。

1.2.2 不同代次細胞形態(tài)觀察、生長曲線和細胞周期檢測

1.2.2.1 細胞形態(tài)觀察 取 P0、P3、P6、P9 代PMSCs，當貼壁細胞均生長到匯合度為 80% 左右時，對細胞形態(tài)進行觀察并拍照。

1.2.2.2 繪制細胞生長曲線（MTT 法） 收集P0、P3、P6、P9 代 PMSCs，細胞計數(shù)后以每孔1 × l04個細胞接種于 7 塊 96 孔板，每孔加完全培養(yǎng)基至總體積 200 μl，在 37 ℃，5% CO2濃度恒溫孵箱中培養(yǎng)，24 h 后每天取一塊板檢測，向檢測板的每個孔中加 MTT 溶液 20 μl，在 37 ℃，5% CO2濃度恒溫箱孵育 4 h 后，每孔加入 150 μl DMSO，振蕩 10 min，使結晶物充分溶解。在全自動酶標儀上測定各孔吸光度（A）。以時間為橫坐標，A 值為縱坐標，波長為 570 nm，繪制細胞生長曲線。

1.2.2.3 PMSCs 細胞周期檢測 取 P0、P3、P6、 P9 代指數(shù)期的 PMSCs，加入 1 ml 預冷 70 % 乙醇，混勻后 4 ℃ 過夜，每管樣品中加入 5 μl RNA酶，37 ℃ 孵育 30 min，每管加入 10 μl PI 染液，室溫避光孵育 30 min 后，流式細胞儀檢測。每代次 PMSCs 有 3 個重復樣本。采用 ModFit LT 軟件獲取并分析結果。

1.2.3 PMSCs 表面標志物檢測 取 P0、P3、P6、P9 代 PMSCs，用 1 ml PBS 調(diào)整細胞總數(shù)為 5 × 106個，分別加入標記抗體 CD90-FITC、CD105-PE、CD73-APC、CD14-/CD20-/CD34-/CD45-PerCP，以鼠抗人的 IgG1-FITC、IgG1-PE、IgG1-APC、IgG1-PerCP、IgG2a-PerCP 作為同型對照，室溫避光孵育 30 min，利用流式細胞儀檢測，F(xiàn)lowJo 7.6.1軟件獲取并分析結果。

1.2.4 PMSCs 多向分化潛能及染色鑒定 取P0、P3、P6、P9 代 PMSCs，以 5 × 103/ml 密度接種于 6 孔板中，置于 37 ℃、體積分數(shù)為 5% 的CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h，待細胞融合度達到60% ～ 70% 時，分別更換為成脂、成軟骨及成骨誘導分化培養(yǎng)基，并設 DMEM 完全培養(yǎng)基培養(yǎng)為對照孔，每 3 ～ 4 天換液 1 次。每代 PMSCs 重復3 個樣本，每個樣本 3 個復孔。誘導 14 d 后，成脂誘導、成軟骨誘導、成骨誘導分別用油紅 O 染液、Masson 染液、茜素紅 S 染液染色并進行鑒定，倒置相差顯微鏡下觀察并拍照。

2 結果

2.1 不同代次 PMSCs 傳代后形態(tài)學、生長曲線和細胞周期的比較

2.1.1 不同代次 PMSCs 形態(tài)觀察結果 倒置相差顯微鏡下觀察，原代培養(yǎng)的 PMSCs 接種 48 h后，大部分細胞貼壁，形態(tài)為典型成纖維細胞樣，3 ～ 5 d 可發(fā)現(xiàn)貼壁細胞增殖形成細胞島，6 ～ 9 d后所有細胞島匯合成單細胞層鋪滿全皿，中間散在些透亮圓形雜細胞。P0 和 P3 代均為長梭形，細胞排列緊密，成旋渦狀或放射狀生長（圖 1A、B）。而 P6 和 P9 代成短梭形或多邊形，細胞體積變大，成旋渦狀或網(wǎng)狀排列（圖 1C、D）。

圖1 不同代次胎盤間充質(zhì)干細胞生長形態(tài)（A：P0 代；B：P3 代；C：P6 代；D：P9 代）（10 × 10）Figure 1 The growth and morphology of human PMSCs （A： P0； B： P3； C： P6； D： P9） （10 × 10）

2.1.2 不同代次 PMSCs 生長曲線測定結果 用MTT 方法繪制的不同代次 PMSCs 體外培養(yǎng)細胞生長曲線如圖 2 所示，各代細胞與 P0 代比較增殖能力出現(xiàn)明顯差異，P0、P3 代細胞在培養(yǎng) 2 ～3 d 細胞數(shù)即達到倍增；P6 在培養(yǎng) 2 ～ 4 d 達到指數(shù)增長期，6 ～ 7 d 進入平臺期；P9 代細胞生長增殖速度緩慢。

圖2 MTT 法繪制不同代次胎盤間充質(zhì)干細胞的生長曲線Figure 2 The growth curves of PMSCs at different passages

圖3 不同代次胎盤間充質(zhì)干細胞的細胞周期［A：P0 代；B：P3 代；C：P6 代；D：P9 代；P0、P3 增殖能力最強；隨著傳代次數(shù)的增加，G0/G1 期細胞逐漸降低，而（S + G2/M）期細胞逐漸增多］Figure 3 Cell cycles of PMSCs at different passages ［A： P0； B： P3； C： P6； D： P9； The cells of P0 and P3 have the highest proliferation ability. The percentage of G0/G1 become lower and lower， relatively， the percentage of （S + G2/M） become higher and higher with subculture］

2.1.3 不同代次 PMSCs 細胞周期測定結果 流式細胞術檢測比較不同代次 PMSCs 體外細胞周期水平，結果顯示大部分細胞均處于 G0/G1 期，G0/G1 期細胞 P0（90.95%）、P3（88.97%）、P6（85.93%）、P9（67.89%）；S 期與 G2/M 期分別是 P0（9.05%）、P3（11.02%）、P6（14.07%）、P9（32.11%）（圖 3）。從中可以看出，隨著傳代次數(shù)的增加，G0/G1 靜止期逐漸減少，而（S + G2/M）期細胞逐漸增多。

2.2 不同代次 PMSCs 表面標記物的比較

應用流式細胞術檢測結果發(fā)現(xiàn)，不同代次PMSCs 表面標記物 CD14/CD20/CD34/CD45 含量在 0.5% 以下，均為低表達；同時強陽性表達間充質(zhì)干細胞相關抗原 CD73、CD90、CD105，表達率 ＞ 98%（圖 4）。不同代次間充質(zhì)干細胞表面抗原表達率無明顯差異。

2.3 不同代次的 PMSCs 多向誘導分化

PMSCs 成脂誘導 14 d，油紅 O 染色結果顯示 P0、P3、P6 代細胞胞漿周圍均含有大小不等的脂滴，脂滴被染成紅色（圖 5 B1 ～ D1）。隨著誘導天數(shù)的增加，P0、P3 代細胞形態(tài)未發(fā)生改變，仍為梭形，誘導成脂肪細胞的數(shù)目增多，P0 代細胞胞質(zhì)聚攏飽滿，脂滴充滿整個胞漿，P3 代胞質(zhì)稍有擴散，脂滴增多且變大；而 P6、P9 代細胞形態(tài)由梭形變?yōu)閳A形或多角形，誘導成脂肪細胞數(shù)目明顯減少，P6 代細胞胞質(zhì)擴散，脂滴數(shù)目減少，P9 脂滴數(shù)目更少且小。

PMSCs 成骨誘導 14 d，茜素紅 S 染色結果顯示，P0、P3、P6 代細胞出現(xiàn)大量橘紅色沉淀，呈圓形或類圓形或堆積成片狀，有明顯的“礦化”結節(jié)形成且數(shù)量上呈遞減趨勢（圖 5B2 ～ D2），P9 代細胞經(jīng)誘導后形成的“礦化”結節(jié)數(shù)量明顯減少（圖 5E2）。

PMSCs 成軟骨誘導 14 d，倒置相差顯微鏡下觀察 P0、P3、P6、P9 代細胞貼壁良好，細胞扁平伸展，由長梭形變成多邊多角形態(tài)，具有軟骨細胞樣的形態(tài)（圖 5B3 ～ E3）；經(jīng) Masson 染色結果顯示 P0、P3、P6 代細胞膠原纖維呈現(xiàn)藍紫色，P9 代染色呈陽性明顯減少。Masson 染色在 P0、P3 代時陽性率最強，P6、P9 代時呈遞減趨勢。

3 討論

在組織工程和臨床應用干細胞治療中，干細胞種類的選擇是決定治療效果的重要因素，以往常以骨髓間充質(zhì)干細胞為治療的首選［8］。但取髓會給供者帶來很大痛苦，且有時因病毒感染或因衰老使骨髓中細胞數(shù)量顯著降低或是骨髓增生分化功能減低，使骨髓來源的間充質(zhì)干細胞受到限制。近年來研究發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細胞分布廣泛，在骨髓、胎盤、肌肉、脂肪、骨、軟骨等組織中均含有間充質(zhì)干細胞。人胎盤是人類妊娠期間胚膜和母體子宮內(nèi)膜聯(lián)合長成的母子間進行物質(zhì)交換的器官，由胚胎發(fā)育而成，它的來源更加原始，所以它的可塑性和分化能力更強［9-10］；同時胎盤屬于醫(yī)療廢棄物，獲取方便，不需要侵入性的操作等特點［11-12］，其中含豐富的間充質(zhì)干細胞，是極具價值的干細胞來源。

PMSCs 生物活性與骨髓間充質(zhì)干細胞高度相似，可在體外培養(yǎng)，具有強大的向多種組織分化的特性，在適當?shù)臈l件下可被誘導分化為韌帶細胞、骨骼肌細胞、心肌細胞、胰腺細胞、肝臟細胞等［13］，因此在許多疾病包括骨/軟骨缺損或發(fā)育不良、韌帶損傷、心肌梗死、肝功能衰竭和糖尿病等的治愈提供了新的方法和途徑，為醫(yī)學界攻克這些人類疑難病癥提供了希望。

圖4 胎盤間充質(zhì)干細胞表面抗原分子表達（不同代次間充質(zhì)干細胞均強陽性表達 CD73-APC、CD90-FITC、CD105-PE，表達率 ＞ 98%；低表達 CD14/CD20/CD34/CD45-PerCP，表達率 ＜ 0.5%）Figure 4 Surface antigens of PMSCs （The CD73-APC、CD90-FITC and CD105-PE were highly expressed by all the mesenchymal stem cells of different generations， the positive expression rate ＞ 98%. Relatively， low expressed CD14/CD20/CD34/CD45-PerCP，and the rate ＜ 0.5%）

圖5 不同代次人胎盤間充質(zhì)干細胞 14 d 誘導分化染色（40 × 10）Figure 5 After multipotent differentiation for 14 d， staining of PMSCs at different passages （40 × 10）

為了使 PMSCs 能更好、更持久地應用于臨床修復組織細胞和器官，在移植前評估此細胞的生物活性顯得尤為重要，本實驗研究不同代次 PMSCs的增殖能力、細胞周期及多向誘導分化潛能。隨著體外培養(yǎng)代次的不斷增加，細胞形態(tài)由 P0 代排列緊密的長梭形逐漸變?yōu)榫W(wǎng)狀排列的短梭形，細胞體積變大，貼壁不牢，易于消化。通過 MTT 法檢測細胞增殖能力，了解 P0、P3、P6、P9 代次細胞生長情況，結果顯示 P0 ～ P3 代間充質(zhì)干細胞的增殖能力明顯高于 P6、P9 代，P9 代細胞已沒有經(jīng)典的生長曲線，增殖速度也明顯變緩。本實驗的形態(tài)觀察結果、生長曲線試驗結果以及細胞周期檢測結果高度吻合，PMSCs 在體外培養(yǎng)時，隨著細胞代次的增加，細胞會逐漸出現(xiàn)老化現(xiàn)象。并且此結果與人骨髓間充質(zhì)干細胞、脂肪間充質(zhì)干細胞、臍帶間充質(zhì)干細胞以及其他動物來源的骨髓間充質(zhì)干細胞的試驗結果相似，均是隨著傳代次數(shù)的增加，細胞的增殖能力和分化潛力降低。

關于 PMSCs 表面標志已開展了大量研究工作，卻一直沒有明確的定論，直至 2006 年國際細胞治療協(xié)會干細胞委員會提出間充質(zhì)干細胞定義標準為 CD73、CD90、CD105 陽性率 ≥ 90%，同時低表達 CD45、CD34、CD14 或 CD11b、CD79α或 CD19、HLA-DR，表達率 ≤ 2%［14］。本實驗證實與此標準一致，低表達造血細胞的表面標志分子CD34、CD45，髓樣單核細胞分化抗原 CD14，B 細胞分化抗原 CD20，表達率 ＜ 0.5%，強陽性表達Thy-1 CD90，5'-核苷酸酶 CD73，內(nèi)皮糖蛋白CD105，表達率 ＞ 98%。表明可從胎盤中獲得高純度的間充質(zhì)干細胞，且不同代次 PMSCs 表面標志無明顯差異。

本實驗世界范圍內(nèi)首次通過流式細胞術顯示不同代次 PMSCs 的細胞周期差異，結果顯示大部分細胞均處于 G0/G1 期，但 P0 代處于 G0/G1期細胞明顯多于 P9 代 G0/G1期細胞，從中可以看出，隨著傳代次數(shù)的增加，間充質(zhì)干細胞處于G0/G1 靜止期細胞逐漸減少，而（S + G2/M）期細胞逐漸增多，說明隨著間充質(zhì)干細胞傳代次數(shù)增多，盡管保持干細胞樣形態(tài)并表達間充質(zhì)主要表面標記抗原但多向分化潛能逐漸降低。多數(shù)學者認為，G0/G1 期細胞比例越高，表明此細胞具有高度分化的潛能［15］，本實驗與此結論一致。此外，通過對不同代次 PMSCs 進行多向誘導分化證實，細胞傳代培養(yǎng)至 P9 代仍然具有誘導分化潛能，但較之P0 代細胞分化能力顯著下降。再次證明隨著細胞傳代培養(yǎng)，PMSCs 的多向誘導分化能力隨著其干性減弱在逐漸降低。

總之，PMSCs 傳代至 P6 代以后，較之 P3 代增殖能力稍有降低，但仍可保持旺盛的生長狀態(tài)，而傳至 P9 代時生長緩慢，細胞形態(tài)變?yōu)槎趟笮危w積變大，而免疫表型并無明顯變化，細胞仍能維持 PMSCs 的基本生物學性狀。但是從細胞周期及多向誘導分化潛能發(fā)現(xiàn)，隨著傳代次數(shù)的增加，P6、P9 代細胞 G0/G1 期比例明顯減少，分化能力逐漸降低，說明體外長期培養(yǎng)后 PMSCs 的誘導分化潛能下降。而從胎盤中分離 P0 代細胞數(shù)量不足，不能滿足組織工程及臨床應用干細胞治療的需求，所以在選擇 PMSCs 作為種子細胞時，應注意選擇適宜的擴增代數(shù)，以便既能保證足夠的細胞數(shù)目又能保留細胞最佳的分化能力，結合本實驗，P3 代細胞無論是在增殖能力還是多向分化的潛能方面都與 P0 代細胞并無顯著性差異，因此使用 P3 代以內(nèi)的細胞作為組織工程種子細胞是較為理想的選擇。

志謝 感謝上海市臍帶血造血干細胞庫對于實驗過程給予資金支持，感謝上海長寧婦幼保健院提供實驗材料，以及上海市臍帶血造血干細胞庫有關部門對于實驗材料的保存和運輸，感謝實驗技術員協(xié)助實驗的完成。

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Objective To observe the biological characteristics and induced differentiation potential of human placenta derived mesenchymal stem cells （PMSCs） at different passages in vitro and to provide experimental evidences for the safety and efficacy in clinical application of PMSCs.

Methods The human term placenta were obtained in sterile condition. The PMSCs were isolated by digestion using collagenase II and in adherent cultur in vitro. The PMSCs were cultured into the 9thgenerations with the normal cultural condition， and the morphological features of the primary cells， 3rd， 6thand 9thgenerations of PMSCs were observed. The proliferative ability of PMSCs was detected by MTT assay and the growth curve was drawn. The cell cycle and the positive expression rates of the surface markers of the different generations of PMSCs were detected by flow cytometry （FCM）. Meanwhile， the PMSCs were induced to differentiate into adipocytes， osteoblasts and chondroblasts in vitro， and identified by staining with oil red O， alizarin red， Masson， respectively for 14 d after being induced. The multipotent differentiation potential of PMSCs from the different generation were assessed.

Results Placenta derived mesenchymal stem cells were mainly in spindle shaped adherent cells， and PMSCs at different passages had different proliferative capability in vitro， especially the primary cells and 3rdgenerations of PMSCs with more potent proliferative activities. The PMSCs were strongly expressed CD73， CD90， CD105 and lowly expressed CD14， CD34， CD45 and CD20. The proportion of G0/G1 phase in cell cycle was 90.95% at the primary cells， 88.97% at passage 3， 85.93% at passage 6，67.89% at passage 9. The multipotent differentiation potential of PMSCs at passages 6 and 9 were decreased.

Conclusion The appropriate amplification passage should be chose in order to obtain the cells with best differentiation potential and cell quantity when using placenta derived mesenchymal stem cells as seed cells.

Author Affiliation： Shanghai Cord Blood Bank/Shanghai Stem Cell Technology Co.， Ltd./China Stem Cell Group Co.， Ltd.，Shanghai 200051， China

www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol, 2016, 11(5):400-406

Comparative study of biological activities of placenta-derived mesenchymal stem cells at different passages

ZHANG Yi， XU Hui-li， WANG Feng， WANG Zhe， LI Chun-li， CHEN Liang

Placenta； Mesenchymal stem cells； Cell cycle； Induced multi-direction differentiation

s： CHEN Liang， Email： chenliang@shanghaicordblood.org； LI Chun-li， Email： lichunlicherry@163.com

10.3969/j.issn.1673-713X.2016.05.003

上海市自然科學基金（16ZR1429200）；上海市科委研發(fā)平臺專項（16DZ2293000）；上海市嘉定區(qū)工程技術研究中心項目

200051 上海市臍帶血造血干細胞庫/上海市干細胞技術有限公司/中國干細胞集團有限公司

陳亮，Email：chenliang@shanghaicordblood.org；李春麗，Email：lichunlicherry@163.com

2016-08-01