葉　松,王洪彬，凌　敏，桂書祺，毛淑紅，路福平*

(1.工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室,天津　300457；2.天津市工業(yè)微生物重點實驗室,天津　300457；3.天津科技大學(xué)　生物工程學(xué)院,天津　300457)

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適用于高通量篩選的氫化可的松生物轉(zhuǎn)化率快速檢測方法研究

葉松1,3,王洪彬1,2,3，凌敏1,3，桂書祺1,3，毛淑紅1,2,3，路福平1,2,3*

(1.工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室,天津300457；2.天津市工業(yè)微生物重點實驗室,天津300457；3.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院,天津300457)

以濃硫酸顯色反應(yīng)為基礎(chǔ)，通過分光光度計可見光雙波長法測定氫化可的松轉(zhuǎn)化率。利用朗伯比爾定律，結(jié)合三維數(shù)據(jù)建模二階校正，建立了氫化可的松生物轉(zhuǎn)化率的快速測定方法，回收率為96.9%～110.8%。驗證實驗顯示，其測定結(jié)果與藥典方法(高效液相色譜)具有很高的一致性，能夠滿足菌種高通量初篩檢測的需求。該研究在該菌種高通量選育方面有良好的應(yīng)用前景。

氫化可的松；生物轉(zhuǎn)化率；雙波長檢測法；高通量篩選

甾體藥物是僅次于抗生素的第二大類藥物，在臨床上具有極其重要的醫(yī)藥價值，通常在免疫調(diào)節(jié)、皮膚疾病治療及生育控制方面有較好的作用[1-3]。其中，甾體藥物氫化可的松(Hydrocortisone,HC)是一種腎上腺皮質(zhì)激素類藥物,具有抗炎、抗毒、抗過敏等作用[4-7]，已被廣泛用于治療各種疾病[8-10]。此外，氫化可的松還是生產(chǎn)潑尼松等其他類高效皮質(zhì)激素藥物的基礎(chǔ)原料[11]。在我國，氫化可的松是以17α-羥基孕甾-4-烯-3,20-二酮-21-醋酸酯(RSA)為底物，藍色梨頭霉(Absidiacoerulea)作為生產(chǎn)菌株，通過生物轉(zhuǎn)化法進行大規(guī)模生產(chǎn)[12]。

但目前工廠所用菌種在轉(zhuǎn)化過程中會產(chǎn)生約30%的副產(chǎn)物表氫化可的松(Epihydrocortisone,EHC)[12]，這嚴重制約了HC轉(zhuǎn)化率的提高，因此迫切需要通過菌種選育篩選出轉(zhuǎn)化特異性更高的菌種。目前國內(nèi)外尚無適合氫化可的松轉(zhuǎn)化菌種選育的高通量篩選方法，主要的技術(shù)瓶頸在于缺乏適合的高通量產(chǎn)物檢測技術(shù)[13]。氫化可的松和表氫化可的松主要的檢測方法為高效液相色譜法[14]，該法雖然準確可靠，但操作繁瑣耗時，不適于高通量篩選[15]。本研究以濃硫酸顯色反應(yīng)為基礎(chǔ)，通過可見光雙波長檢測來測定氫化可的松轉(zhuǎn)化率，建立了一種便捷、靈敏和可靠的氫化可的松轉(zhuǎn)化特異性的檢測方法，在其菌種高通量選育方面有較好的應(yīng)用前景。

1　實驗部分

1.1試劑、材料與儀器

標準品：17-羥基-孕甾-4-烯-3,20-二酮-21-醋酸酯(RSA，純度≥99%)、氫化可的松(11β,17α,21-三羥基-孕甾-4-烯-3,20-二酮，純度≥99%)、表氫化可的松(11α,17α,21-三羥基-孕甾-4-烯-3,20-二酮，純度≥99%)均由天津市津津制藥廠提供；濃硫酸(上海生工有限公司)；甲醇(Fisher公司)。

藍色犁頭霉(Absidiacoerulea)由天津科技大學(xué)應(yīng)用微生物研究室菌種保藏中心提供。

斜面PDA培養(yǎng)基：土豆汁1 L,葡萄糖20 g,瓊脂20 g。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖10.5 g，酵母膏2.3 g，玉米漿12.5 g，硫酸銨5.0 g,自來水1 L，pH 6.4～6.7。

1200高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)；UV-2201型紫外可見分光光度計(日本島津公司)；酶標儀(美國賽默飛世爾公司)；超純水裝置(美國密理博公司)；電子天平(德國梅特勒公司)。

1.2實驗方法

1.2.1溶液制備氫化可的松標準溶液：精確稱取氫化可的松標準品5 mg，加無水乙醇溶解后定容于10 mL容量瓶中，配成濃度為0.5 mg/mL儲備液，在4 ℃下冷藏保存。

RSA、表氫化可的松標準溶液的配制方法同上。

1.2.2分光光度計多波長掃描分別取0.025 mg產(chǎn)物氫化可的松、副產(chǎn)物表氫化可的松和底物RSA與900 μL濃硫酸反應(yīng)15 min，在可見光范圍內(nèi)做全波長掃描，掃描波長范圍為400～710 nm。

1.2.3吸光度加和性實驗同一批次，添加不同體積RSA，HC，EHC標準品溶液于96孔石英酶標板中，配成一系列具有不同RSA，HC，EHC含量的混合組分。同時再按照每一混合組分中RSA，HC，EHC的含量，分別對應(yīng)地將RSA，HC，EHC標準溶液以單組分形式加入96孔石英酶標板的3個小孔中。待標準溶液中的無水乙醇完全揮發(fā)后，加入200 μL濃硫酸，反應(yīng)15 min，分別在RSA，HC的最大吸收峰波長處測定單組分、混合組分的吸光度，并對測定結(jié)果進行吸光度加和性分析。

1.2.4基于朗伯比爾定律的HC轉(zhuǎn)化率可見光雙波長檢測實驗同一批次在RSA，HC的最大吸收峰波長處，測定不同質(zhì)量HC，EHC，RSA單組分標準品與濃硫酸反應(yīng)后絡(luò)合物的吸光度，作3種標準品的絡(luò)合物濃度與吸光度的關(guān)系曲線，得出K474 nmHC，K474 nmEHC，K474 nmRSA，K535 nmHC，K535 nmEHC，K535 nmRSA的值。同時，依據(jù)表1中HC不同含量(即HC的轉(zhuǎn)化率)，將RSA，HC，EHC標準溶液按換算體積加入上述96孔石英酶標板中，配成一系列的RSA，HC，EHC不同混合組分，保持總質(zhì)量為0.025 mg。待無水乙醇揮發(fā)后，向每孔加入200 μL濃硫酸，反應(yīng)15 min，分別在RSA和HC吸收峰最高的波長處測定吸光度。

1.2.5基于三維數(shù)據(jù)的擬合HC轉(zhuǎn)化率可見光雙波長檢測法實驗同一批次，將RSA，HC，EHC標準溶液按換算體積加入上述96孔石英酶標板中，配成一系列的RSA，HC，EHC不同混合組分，保持總質(zhì)量為0.025 mg。待無水乙醇揮發(fā)后，向每孔加入200 μL濃硫酸，反應(yīng)15 min，分別在RSA，HC吸收峰最高的波長處測定一系列混合組分的吸光度A1，A2。通過軟件Sigmaplot，將轉(zhuǎn)化率X、吸光度A1，A2數(shù)據(jù)擬合，得到這三組數(shù)據(jù)之間的數(shù)量關(guān)系公式。

1.2.6驗證方法菌體的培養(yǎng)與轉(zhuǎn)化：將斜面種子用無菌水制成孢子懸浮液(107個/mL)，按5%接種量接入每孔裝有3 mL發(fā)酵液體培養(yǎng)基的24孔深孔微生物培養(yǎng)板中，使用微孔振蕩儀420 r/min培養(yǎng)36 h后，接48孔斜面板保存菌種，同時投入底物，進行催化轉(zhuǎn)化。28 ℃下振蕩培養(yǎng)24 h后，加入預(yù)先用乙醇溶解的底物(最終底物質(zhì)量濃度為2.5 g/L)，繼續(xù)在相同培養(yǎng)條件下生物轉(zhuǎn)化72 h。

轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的萃取與轉(zhuǎn)化率分光光度計雙波長檢測：向發(fā)酵液中添加等體積的乙酸乙酯進行萃取，靜置，取上層有機相6 μL于96孔石英酶標板中，待乙酸乙酯揮發(fā)后加入200 μL濃硫酸，反應(yīng)15 min。按照可見光雙波長法分別在RSA和HC吸收峰最高的波長處測定吸光度，通過公式計算得到HC的轉(zhuǎn)化率。

轉(zhuǎn)化率高效液相色譜檢測法：色譜條件：采用C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)，流動相為甲醇-水(70∶30)，流量0.8 mL/min，進樣量10 μL，柱溫25 ℃；UV 242 nm檢測。

圖1　不同標準品與濃硫酸反應(yīng)絡(luò)合物的可見光譜圖Fig.1　Absorption spectra of the complex compounds of different standards

2　結(jié)果與討論

2.1可見光最大吸收波長的測定

用雙光束紫外可見分光光度計將HC，EHC，RSA單組分標準品與濃硫酸反應(yīng)后的絡(luò)合物于可見光波長范圍內(nèi)掃描，測得吸收曲線如圖1所示。結(jié)果表明:HC在474 nm處有最大吸收峰，RSA在535 nm處有最大吸收峰，EHC在474 nm和535 nm處均有吸收。

2.2可見光測定線性特征的考察

以底物RSA、中間產(chǎn)物RS、主產(chǎn)物HC和副產(chǎn)物EHC作為標樣繪制標準曲線，結(jié)果顯示，在0.2×10-4～2.0×10-4mol/L濃度范圍內(nèi)，RSA，HC，EHC的絡(luò)合物濃度與對應(yīng)吸光度呈良好的線性關(guān)系。在波長474 nm處，其相關(guān)系數(shù)分別為0.997 1，0.996 4，0.996 6；在波長535 nm處，其相關(guān)系數(shù)分別為0.996 4，0.997 2，0.997 9。結(jié)果表明曲線線性良好，可用于定量分析。

2.3吸光度的加和性實驗

不同系列單組分吸光度之和與混合組分吸光度之間的關(guān)系曲線分析結(jié)果顯示，在波長474 nm處，混合組分的吸光度與各單組分吸光度之和的偏差較小，說明該波長下具有較好的加和性，大致可以滿足A≈ARSA+AHC+AEHC。而在波長535 nm處，混合組分的吸光度與各單組分吸光度之和具有一定偏差，表現(xiàn)出的加和性不如波長474 nm處。

2.4基于理論推導(dǎo)的氫化可的松轉(zhuǎn)化率的雙波長測定方法

基于在波長474 nm處，3種物質(zhì)的混合組分總吸光度與各單組分吸光度之間的加和性較好，根據(jù)朗伯比爾定律對HC轉(zhuǎn)化率的雙波長檢測方法進行了理論推導(dǎo)。

藍色犁頭霉以RSA為底物進行生物催化轉(zhuǎn)化，得到主產(chǎn)物HC(約70%)，副產(chǎn)物EHC(約30%)。因此忽略藍色犁頭霉生物轉(zhuǎn)化過程中極少量其他位置羥基化合物的影響，將HC作為主產(chǎn)物，EHC作為副產(chǎn)物，RSA作為底物進行檢測。通過測定混合物在波長474 nm和535 nm處的吸光度A，根據(jù)朗伯比爾定律，可得公式(1)：

A474 nm=K474 nmHC×CHC+K474 nmEHC×CEHC+K474 nmRSA×CRSA

A535 nm=K535 nmHC×CHC+K535 nmEHC×CEHC+K535 nmRSA×CRSA

(1)

假設(shè)1 mol RSA轉(zhuǎn)化為HC和EHC的摩爾數(shù)分別為m和n，未轉(zhuǎn)化的RSA的摩爾數(shù)則為(1-m-n)；如果設(shè)RSA的投料濃度為C0，則轉(zhuǎn)化3 d后，發(fā)酵液中：CHC+CEHC+CRSA=C0；設(shè)X=CHC/C0，Y=CEHC/C0，則：CRSA/C0=(1-X-Y)，X為HC的摩爾轉(zhuǎn)化率。代入公式(1)后可得公式(2)：

A474 nm=K474 nmHC×C0X+K474 nmEHC×C0Y+K474 nmRSA×C0(1-X-Y)

A535 nm=K535 nmHC×C0X+K535 nmEHC×C0Y+K535 nmRSA×C0(1-X-Y)

(2)

已知在該檢測方法中，RSA的投料量可換算為C0=1.96×10-4mol/L。根據(jù)“1.2.4”檢測方法，同一批次，作出單組分HC，EHC，RSA標準品與濃硫酸反應(yīng)后的絡(luò)合物在波長474，535 nm處的濃度與吸光度標準曲線，得出：

K474 nmHC=0.540×104，K474 nmEHC=0.332×104，K474 nmRSA=0.076 1×104，K535 nmHC=0.136×104，K535 nmEHC=0.246×104，K535 nmRSA=0.196×104，將其代入公式(2)，簡化后即推導(dǎo)出HC轉(zhuǎn)化率的計算公式(3)：

X=(A474 nm-5.124×A535 nm+1.82)/1.508

(3)

同時，根據(jù)HC不同含量比(即HC轉(zhuǎn)化率)配制的HC，RSA，EHC不同組分含量的混合標準品與濃硫酸反應(yīng)15 min后，得到其在474，535 nm波長處的吸光度，根據(jù)上述公式計算出X值，結(jié)果見表1。

表1　初探方法實驗結(jié)果Table 1　The result of proposed method tests

實驗結(jié)果顯示：X的計算值與實際值之間誤差較大。在對混合樣品進行多組分分析時,由于溶液中各種物質(zhì)相互之間對可見光的吸收作用,從而導(dǎo)致分析結(jié)果不準確，誤差很大。

2.5基于三維數(shù)據(jù)擬合的氫化可的松轉(zhuǎn)化率的雙波長測定方法

由于朗伯比爾定律測定方法的誤差較大，提出一種非線性濃度校準模型的假設(shè)。通過標樣數(shù)據(jù)估算出吸收校準參數(shù)，建立分析模型。

根據(jù)“1.2.5”方法，同一批次，得出不同HC含量(即HC轉(zhuǎn)化率)的混合組分與濃硫酸反應(yīng)后在474，535 nm波長處的吸光度，對HC轉(zhuǎn)化率X，A474 nm，A535 nm數(shù)據(jù)進行擬合，得出三者之間的數(shù)量關(guān)系。

根據(jù)多次實驗數(shù)據(jù)擬合三維數(shù)據(jù)圖發(fā)現(xiàn)，當X的實際值介于0～1之間，無法得到較高的擬合度。因此對X進行分段擬合，最終發(fā)現(xiàn)選用X在0～0.6，0.6～1之間的數(shù)據(jù)分段擬合，擬合程度最高，相關(guān)系數(shù)均達0.99以上。

研究了X實際值在0.6～1之間時，X值與混合組分在474，535 nm處吸光度之間的關(guān)系，根據(jù)數(shù)據(jù)模擬了三維曲面，結(jié)果如圖2A，得到X值的計算公式(4)：

(4)

同時研究了X實際值為0～0.6時，X值與混合溶液在474，535 nm處吸光度之間的關(guān)系，根據(jù)數(shù)據(jù)模擬了三維曲面，結(jié)果如圖2B，得到X值的計算公式(5)：

(5)

圖2　氫化可的松轉(zhuǎn)化率(X)與A474 nm和A535 nm的擬合曲線Fig.2　Fitting curves of hydrocortisone biotransformation rate(X) with A474 nm and A535 nmA.X：0～0.6;B.X:0.6～1

為驗證模型的預(yù)測能力，對同一批號樣品，保持總質(zhì)量一定(0.025 mg)，按照HC不同轉(zhuǎn)化率配比RSA,HC,EHC的含量，進行回收率實驗，結(jié)果如表2。結(jié)果表明回收率為96.9%～110.8%，證明模型有效，可對混合體系中HC的轉(zhuǎn)化率進行較為精確的預(yù)測。

表2　回收率實驗結(jié)果Table 2　The result of recovery tests

對多次重復(fù)實驗的數(shù)據(jù)進行分析，發(fā)現(xiàn)K=(A474 nm-A535 nm)/A474 nm的值隨HC轉(zhuǎn)化率的增大而增大。因此，最終將檢測方法確定為:在同一批次實驗中，首先按照對一系列不同的標準品混合組分中X，A474 nm，A535 nm進行數(shù)據(jù)擬合，得出公式(4～5)；再計算出一系列不同的標準品混合組分中，當X=0.6時，K=(A474 nm-A535 nm)/A474 nm的值K0；然后，按照“1.2.6”方法，將發(fā)酵液中待測試樣在474，535 nm處的OD值代入公式K=(A474 nm-A535 nm)/A474 nm，比較計算出的K值與K0，將轉(zhuǎn)化率在0～0.6之間的數(shù)據(jù)與0.6～1之間的數(shù)據(jù)分開；最后，將發(fā)酵液中待測試樣在474，535 nm處的OD值，以不同的轉(zhuǎn)化率區(qū)間，代入公式(4～5)，計算出待測發(fā)酵液中HC的轉(zhuǎn)化率，進而快速檢測出發(fā)酵液中HC的轉(zhuǎn)化率。

表3　方法驗證實驗結(jié)果Table 3　The result of feasibility verifying test

2.6氫化可的松轉(zhuǎn)化率的雙波長測定方法的考察與驗證

選取實驗室保存的具有不同轉(zhuǎn)化特異性的10株藍色犁頭霉突變株，作RSA的生物轉(zhuǎn)化，分別采用藥典規(guī)定的HPLC法和可見光雙波長檢測法檢測HC的轉(zhuǎn)化率。兩種方法對比結(jié)果見表3。發(fā)現(xiàn)HPLC方法與可見光雙波長檢測法的結(jié)果偏差不大。因此認為可見光雙波長測定方法可用于HC轉(zhuǎn)化率的粗略檢測。

3　結(jié)　論

本文利用朗伯比爾定律，結(jié)合三維數(shù)據(jù)建模，對發(fā)酵液中氫化可的松的轉(zhuǎn)化率進行了定量分析。實驗表明，利用朗伯比爾定律，結(jié)合三維數(shù)據(jù)建模二階校正相結(jié)合，可用于氫化可的松生物催化轉(zhuǎn)化率的測定。測定結(jié)果與藥典方法高效液相色譜法基本一致。該法操作簡便，節(jié)約時間，效率高，適用于發(fā)酵液中氫化可的松轉(zhuǎn)化率的快速檢驗，從而為高通量篩選高產(chǎn)氫化可的松的菌株提供了一種快速、有效的檢測方法。

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A New Rapid Method for Hydrocortisone Biotransformation Rates Determination Applicable for High-throughput Selection System

YE Song1,3，WANG Hong-bin1,2,3，LING Min1,3，GUI Shu-qi1,3，MAO Shu-hong1,2,3，LU Fu-ping1,2,3*

(1.Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology,Ministry of Education,Tianjin300457,China；2.Tianjin Key Laboratory of Industrial Microbiology,Tianjin300457,China；3.College of Biotechology,Tianjin University of Science and Technology,Tianjin300457,China)

In this study,concentrated sulphuric acid was employed for the determination of hydrocortisone biotransformation rate,which could be monitored via dual wavelength analysis.A rapid and simple method for the determination of hydrocortisone biotransformation rate was developed by combining the well-known Lambert Beer law and the 3D data modeling method.The method recoveries were in the range of 96.9%-110.8%.The validation results,which were consistent with that of HPLC method,showed that the method could meet the needs for preliminary screening ofAbsidiacoeruleavia high-throughput system.This study has a good application prospect in breedingAbsidiacoeruleaof high specific biotransformation ability.

hydrocortisone;biotransformation rate;dual wavelength analysis;high-throughput selection

2016-02-17；

2016-03-30

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃(863計劃)項目(2011AA02A211)

路福平，博士，教授，研究方向：酶工程與應(yīng)用微生物，Tel:022-60600160，E-mail:lfp@tust.edu.cn

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.09.008

O657.3；TQ460.72

A

1004-4957(2016)09-1121-06