蘇新芳,閆曉榮,閆桂琴

(山西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,山西臨汾 041000)

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接骨木葉黃酮提取工藝及體外抗氧化活性研究

蘇新芳,閆曉榮,閆桂琴*

(山西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,山西臨汾 041000)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,采用響應(yīng)面法對(duì)接骨木葉片總黃酮的超聲輔助提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化,并對(duì)接骨木葉片總黃酮乙醇提取物的乙酸乙酯、氯仿、正丁醇、水四種不同極性溶劑分級(jí)萃取組分的抗氧化活性進(jìn)行了分析。結(jié)果表明:超聲輔助提取接骨木葉片總黃酮的最佳工藝條件為:乙醇濃度70%,料液比1∶40,提取溫度70 ℃,提取時(shí)間60 min,在此條件下,總黃酮最高提取得率可達(dá)18.67%;乙酸乙酯、氯仿、正丁醇、水四種極性萃取組分中黃酮相對(duì)含量分別為54.3%、28.22%、22.01%、9.817%,且四種組分對(duì)DPPH自由基和ABTS+自由基均有一定的清除活性,但均以乙酸乙酯萃取組分的清除活性最高,說(shuō)明接骨木葉片乙酸乙酯萃取組分富含天然抗氧化劑,具有潛在的開(kāi)發(fā)價(jià)值。

接骨木,黃酮,提取,抗氧化活性

天然藥物與化學(xué)合成藥物相比,由于具低毒、低副作用等特點(diǎn)而備受人們青睞。黃酮類化合物是普遍存在于植物中的一類天然生物活性成分,具有抗癌、抗氧化、抗衰老、降血脂、抑菌等多種生物活性,在醫(yī)藥、保健等領(lǐng)域應(yīng)用極其廣泛[1];也是許多藥物合成的先導(dǎo)物質(zhì)。鑒于黃酮類化合物豐富的藥理活性和應(yīng)用價(jià)值[2-4],開(kāi)發(fā)和挖掘新的黃酮植物資源一直是天然化學(xué)領(lǐng)域眾多學(xué)者致力的研究方向。

接骨木屬忍冬科接骨木屬植物,全株可入藥。作為一種傳統(tǒng)草藥,因具接骨、止痛的功效而被長(zhǎng)期應(yīng)用于骨損傷和關(guān)節(jié)疾病的治療中[5]。此外,接骨木還具有抗炎、抗病毒、抗腫瘤等多種藥理活性[6]?，F(xiàn)有研究表明:接骨木除含有萜類、酚類等活性成分外[7-8],還富含山奈酚、槲皮素[9]、人參黃酮苷等黃酮成分[10],是一種開(kāi)發(fā)黃酮類化合物潛在的藥用植物資源。

近年來(lái)關(guān)于黃酮類化合物的提取技術(shù)已廣見(jiàn)報(bào)道,如水浸提法、酶解法、超臨界萃取法、微波輔助提取法與超聲波輔助提取法等[11]。在這些技術(shù)當(dāng)中,超聲波輔助提取法因操作簡(jiǎn)單、方便、能耗低等優(yōu)點(diǎn)而備受青睞。本研究采用響應(yīng)面法對(duì)接骨木葉片總黃酮超聲輔助提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化,并對(duì)不同極性萃取組分的抗氧化活性進(jìn)行了分析,以期為接骨木葉片開(kāi)發(fā)利用提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

接骨木葉片采自山西霍山,洗凈,80 ℃烘干,萬(wàn)能粉碎機(jī)粉碎后過(guò)60目篩備用;無(wú)水乙醇、石油醚、乙酸乙酯、三氯甲烷、正丁醇、ABTS、過(guò)硫酸鉀等均為分析純;蘆丁、DPPH試劑購(gòu)于Sigma公司。

SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司;RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上海亞榮生化儀器廠;KQ-500E型超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司;754型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)上海光譜儀器有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1單因素實(shí)驗(yàn)超聲頻率40 kHz,功率500 W,以乙醇濃度、料液比、提取溫度、提取時(shí)間為考察因素,接骨木葉總黃酮提取率為指標(biāo),進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。

1.2.1.1乙醇濃度對(duì)提取率的影響準(zhǔn)確稱取接骨木葉片干粉5份,每份1.0 g,分別加入50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液,料液比1∶40(g/mL),溫度條件70 ℃下,超聲波提取60 min，確定最佳乙醇濃度。

1.2.1.2料液比對(duì)提取率的影響準(zhǔn)確稱取接骨木葉片干粉5份,每份1.0 g,乙醇濃度為70%,料液比分別為1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60,溫度條件70 ℃下,超聲波提取60 min，確定最佳料液比。

1.2.1.3提取溫度對(duì)提取率的影響準(zhǔn)確稱取接骨木葉片干粉5份,每份1.0 g,乙醇濃度為70%,料液比1∶40,溫度分別為50、60、70、80、90 ℃,超聲波提取60 mim，確定最佳提取溫度。

1.2.1.4提取時(shí)間對(duì)提取率的影響準(zhǔn)確稱取接骨木葉片干粉5份,每份1.0 g,乙醇濃度為70%,料液比1∶40,溫度條件70 ℃下,超聲波提取時(shí)間分別為30、40、50、60、70、80 min,確定最佳提取時(shí)間。

1.2.2響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)選取最佳實(shí)驗(yàn)水平,并在每個(gè)因素最大的接骨木黃酮得率區(qū)域選擇3個(gè)合適的水平,用+1代表自變量高水平,用0代表自變量中水平,用-l代表自變量低水平(表1),應(yīng)用Design-Expert Software8.06軟件,設(shè)計(jì)4因素3水平的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn),優(yōu)化接骨木葉片總黃酮超聲輔助提取的最佳提取條件。

表1　總黃酮提取實(shí)驗(yàn)的因素水平

1.2.3總黃酮含量的測(cè)定采用NaNO2-Al(NO3)3顯色法進(jìn)行[12-13]:利用70%乙醇精密配制0.100 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液50 mL,分別精密移取此標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.25、0.50、1.00、1.50、2.00、3.00、5.00 mL于10 mL具塞比色管中,加入5%亞硝酸鈉溶液0.30 mL,搖勻靜置5 min后,再加10%硝酸鋁溶液0.30 mL,靜置6 min后再加1 mol/L氫氧化鈉溶液2.0 mL,70%乙醇定容至刻度,搖勻,靜置15 min,以試劑空白作參比液,于510 nm處測(cè)吸光度值,得出吸光度值(y)與蘆丁濃度(x)之間的線性回歸方程(y=13.038x-0.0088,R2=0.999)。

接骨木葉片提取液中黃酮含量測(cè)定方法同上,測(cè)得樣品溶液510 nm波長(zhǎng)處的吸光度值,代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中求得總黃酮濃度,計(jì)算接骨木葉片中總黃酮提取得率及各萃取物黃酮相對(duì)含量。

式(1)

其中,c:線性計(jì)算出接骨木葉總黃酮類化合物的濃度(mg/mL);v:提取液定容量(mL);n:稀釋倍數(shù);m:接骨木葉片質(zhì)量(mg)。

式(2)

其中,Q:萃取物中黃酮類化合物濃度(mg/mL),V:提取液定容體積(mL),W:萃取物干粉重量(mg)。

1.2.4不同極性萃取物的提取稱取接骨木葉片粉末100 g,用石油醚脫脂后,采用4000 mL 70%乙醇溶液作溶劑,超聲波溫度70 ℃下,提取60 min,過(guò)濾濃縮至乙醇完全揮盡,依次用1700 mL乙酸乙酯、800 mL三氯甲烷、1100 mL正丁醇、500 mL水分級(jí)萃取直至萃取液無(wú)色,萃取液減壓濃縮,濃縮至浸膏狀后于70 ℃充分干燥,研磨至粉末狀,保存,用于各組分及黃酮相對(duì)含量的測(cè)定和抗氧化活性分析。

1.2.5不同極性部位抗氧化活性的測(cè)定

1.2.5.1清除DPPH自由基活性測(cè)定參照文獻(xiàn)報(bào)道[14],準(zhǔn)確稱取4 mg DPPH溶于100 mL無(wú)水乙醇中配制成0.1 mol/L的溶液,并將不同極性接骨木葉片提取物用70%的乙醇稀釋配制成不同濃度的樣品溶液,在10 mL具塞比色管中依次加入0.1 mL樣品溶液和2.9 mL DPPH溶液,充分混勻,避光反應(yīng)30 min,于517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度A。對(duì)照組以無(wú)水乙醇代替DPPH溶液,與樣品混勻,于517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度A1,空白組以上述DPPH溶液與無(wú)水乙醇混合后測(cè)定517 nm波長(zhǎng)處的吸光度A0,以抗壞血酸為對(duì)照。計(jì)算DPPH自由基的清除率:

清除率(%)=[1-(A-A1)/A0]×100

式(3)

其中:A為樣品組吸光度值;A1為對(duì)照組吸光度值;A0為空白組吸光度值。

1.2.5.2清除ABTS+自由基活性測(cè)定ABTS+自由基清除活性分析參照文獻(xiàn)報(bào)道[15],7.4 mmol/L ABTS水溶液與2.6 mmol/L K2S2O8溶液等體積混勻,避光反應(yīng)12 h后,50%無(wú)水乙醇稀釋混合液,使其在734 nm下,吸光度為0.7±0.002成為ABTS工作液。在10 mL具塞比色管中依次加入0.1 mL不同濃度的樣品液及2.9 mL ABTS工作液,30 ℃避光反應(yīng)10 min后,用分光光度計(jì)在734 nm處測(cè)定其吸光度A。以無(wú)水乙醇代替ABTS溶液為對(duì)照組,與樣品混勻,測(cè)定吸光度A1,空白組以ABTS溶液與無(wú)水乙醇混合后測(cè)得的吸光度A0,以抗壞血酸為對(duì)照。計(jì)算ABTS自由基的清除活性:

清除率(%)=[1-(A-A1)/A0]×100

式(4)

其中:A為樣品組吸光度值;A1為對(duì)照組吸光度值;A0為空白組吸光度值。

1.3數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel(Office 2003)軟件整理數(shù)據(jù),SigmaPlot10.0和Design-Expert8.06軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2　結(jié)果與分析

2.1單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1乙醇濃度的選擇從乙醇濃度對(duì)接骨木葉片總黃酮得率的影響(圖1)可以看出,隨著乙醇濃度的增加,黃酮得率先提高后降低,當(dāng)乙醇濃度為70%時(shí),黃酮得率達(dá)最大值。其原因可能為乙醇濃度適中時(shí),醇溶性和水溶性的黃酮類化合物能達(dá)到最大溶出度;乙醇濃度過(guò)高時(shí),黃酮類化合物的溶解度下降,而醇溶性和脂溶性的物質(zhì)溶出量增多,與黃酮類化合物形成競(jìng)爭(zhēng)從而導(dǎo)致黃酮類化合物的得率下降[16]。因此,在其他條件確定的情況下,乙醇濃度以70%左右為最佳。

圖1　乙醇濃度對(duì)黃酮提取率的影響 Fig.1　Effect of ethanel concentration on the extraction rate of total flavonoids

2.1.2料液比的選擇從料液比對(duì)黃酮提取率的影響可以看出(圖2):料液比為1∶40時(shí)黃酮得率達(dá)最大值并基本保持穩(wěn)定,當(dāng)料液比超過(guò)1∶50可能由于黃酮類物質(zhì)達(dá)到溶解平衡,雜質(zhì)溶出量增加導(dǎo)致黃酮得率下降[17]。說(shuō)明在其他條件確定的情況下,料液比取1∶40為最佳。

圖2　料液比對(duì)黃酮提取率的影響Fig.2　Effect of ratio of material to liquid on the extraction rate of total flavonoids

2.1.3提取溫度的選擇在各提取處理溫度下(圖3),總黃酮得率隨溫度的變化呈先上升后下降的趨勢(shì),在提取溫度為70 ℃時(shí)黃酮得率出現(xiàn)峰值。可能由于溫度過(guò)高,黃酮活性成分會(huì)受到破壞[18]。因此當(dāng)其他條件確定時(shí),總黃酮最佳提取溫度約為70 ℃。

圖3　提取溫度對(duì)黃酮提取率的影響Fig.3　Effect of extracting temperature on the extraction rate of total flavonoids

2.1.4提取時(shí)間的選擇從提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響可知(圖4),黃酮得率隨提取時(shí)間的增加而增加,但60 min之后黃酮得率趨于平緩,這可能是因?yàn)槌暡ǖ目昭ㄐ?yīng)加速細(xì)胞內(nèi)的有機(jī)物釋放到提取液中,前60 min破碎細(xì)胞中的總黃酮已基本釋放[19]。因此,在其他條件確定的情況下,60 min約為黃酮超聲提取的最佳時(shí)間。

圖4　提取時(shí)間對(duì)黃酮提取率的影響Fig.4　Effect of extracting time on the extraction rate of total flavonoids

2.2響應(yīng)面結(jié)果分析

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,進(jìn)一步以乙醇濃度(A)、液料比(B)、提取溫度(C)、提取時(shí)間(D)為自變量。以接骨木葉片總黃酮提取率為響應(yīng)值(Y),采用響應(yīng)面法對(duì)提取條件進(jìn)行了優(yōu)化,結(jié)果見(jiàn)表2。

表2　響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析

利用Design-Expert8.06軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合,所得到回歸方程Y=-255.78+2.93A+0.71B+3.98C+0.40D-1.4×10-3AB+1.53×10-3AC-1.5×10-4AD-3.5×10-4BC+1.75×10-3BD+3.975×10-3CD-0.02A2-8.1×10-3B2-0.03C2-6.06×10-3D2;進(jìn)一步通過(guò)方差分析顯示(表3):回歸方程模型(p<0.01)極顯著,相關(guān)系數(shù):R2=0.944>0.9,失擬項(xiàng)p值不顯著,表明該模型相關(guān)度好,且與實(shí)際檢測(cè)值擬合度良好,實(shí)驗(yàn)誤差小,可以用于最佳提取條件的預(yù)測(cè);各項(xiàng)的方差分析表明,A、C、A2、B2、C2對(duì)黃酮得率有極顯著的影響,各交互項(xiàng)對(duì)黃酮得率的影響均不顯著。此外,各因素F值可反映其對(duì)響應(yīng)值的重要性,F值越大,p值越小,該因素對(duì)響應(yīng)值的影響越大[20],從各因素F值與p值的比較可以看出,各因素對(duì)接骨木總黃酮得率影響程度大小為:乙醇濃度>提取溫度>料液比>提取時(shí)間。

2.3模型的驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)

采用Design-Expert 8.06軟件進(jìn)一步對(duì)回歸模型進(jìn)行分析,依據(jù)所得到的模型獲得的超聲輔助提取接骨木葉片總黃酮最佳工藝參數(shù)為:乙醇濃度72.2%、料液比1∶42.5、提取溫度71.1 ℃、提出時(shí)間61.3 min,在此條件下黃酮類化合物提取率理論上可達(dá)18.58%?？紤]到實(shí)際操作的可行性,將最佳提取工藝參數(shù)修正為:乙醇濃度70%、料液比1∶40、提取溫度70 ℃、提取時(shí)間60 min,在此條件下進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn),提取率高達(dá)18.67%,與預(yù)測(cè)值偏差較小,說(shuō)明所獲得提取工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠,具有一定的實(shí)用價(jià)值。

2.4萃取物質(zhì)量及黃酮相對(duì)含量

稱取1.2.4中各萃取物粉末含量,參照標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程及公式(1)、(2),得到各萃取物中黃酮相對(duì)含量如表4,可知,正丁醇萃取物質(zhì)量最多,其黃酮相對(duì)含量卻僅有22.01%;得到的乙酸乙酯萃取物質(zhì)量較少,但其黃酮相對(duì)含量是四種組分中最高,達(dá)54.30%。

表4　各萃取物黃酮相對(duì)含量

2.5抗氧化性

2.5.1不同極性萃取物清除DPPH自由基活性的活性通過(guò)VC及四種不同極性萃取組分對(duì)DPPH自由基清除率的比較可以看出，VC清除DPPH自由基能力隨濃度上升而增大,當(dāng)濃度為15 mg/L時(shí),VC的清除率最大且之后趨于平穩(wěn),不再隨濃度增加而增大。接骨木葉片4種不同極性萃取組分對(duì)DPPH均有一定的清除作用,乙酸乙酯、氯仿、正丁醇萃取部位對(duì)自由基的清除率隨萃取液濃度的增加而增大;正丁醇溶液濃度60 mg/L時(shí)清除率達(dá)最大值,之后逐漸變緩不再增大;水相對(duì)自由基的清除率隨濃度變化不明顯,在40 mg/L時(shí)清除率降低為0,而后又隨濃度增加有所增大,這可能與所含黃酮種類的抗氧化性有關(guān)。相同濃度范圍內(nèi),四種萃取組分清除DPPH自由基能力大小依次為乙酸乙酯組分>氯仿組分>正丁醇組分>水相組分,說(shuō)明乙酸乙酯萃取組分的抗氧化能力最強(qiáng),且濃度為80 mg/L時(shí)其清除率與VC接近。

表3　回歸方程方差分析結(jié)果

圖5　不同極性萃取組分對(duì)DPPH自由基的清除率Fig.5　The DPPH scavenging activityrate of different polar fractions

注:**表示差異極顯著(p<0.01);*表示差異顯著(p<0.05)。

2.5.2不同極性部位清除ABTS+自由基能力的比較從圖6可以看出，VC和接骨木葉四種不同極性萃取組分對(duì)ABTS+自由基均表現(xiàn)出不同程度的清除活性,且呈明顯的量效關(guān)系,隨濃度增加,清除率也隨之增大,溶液濃度為80 mg/L時(shí),VC的清除率高達(dá)97.8%;在相同濃度范圍內(nèi),乙酸乙酯組分對(duì)ABTS+自由基的清除率最大,濃度為80 mg/L時(shí),其清除率與VC相近,氯仿組分清除率次之,其次是正丁醇組分,水相組分最小,其中正丁醇與水相兩者在濃度10～30 mg/L時(shí)的清除能力相近,濃度增大,正丁醇相表現(xiàn)出優(yōu)于水相的清除能力,這可能與所含黃酮種類和相關(guān)含量有關(guān)。以上結(jié)果同樣表明乙酸乙酯萃取物的抗氧化能力最強(qiáng)。

圖6　不同極性組分對(duì)ABTS+自由基的清除率Fig.6　The ABTS+ scavenging activity rate of different polar fractions

3　結(jié)論

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,采用四因素三水平響應(yīng)面法優(yōu)化了接骨木葉片總黃酮超聲輔助提取工藝,確定了最佳工藝條件為:乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、料液比1∶40(g/mL)、提取溫度70 ℃、提取時(shí)間60 min,總黃酮得率為18.67%。此外,還通過(guò)對(duì)接骨木葉片乙酸乙酯相、氯仿相、正丁醇相及水相四種不同極性萃取組分與VC清除DPPH和ABTS+自由基的清除活性的對(duì)比實(shí)驗(yàn)證實(shí):四種不同極性萃取物對(duì)兩種自由基均有一定的清除活性,且均以乙酸乙酯相清除活性最強(qiáng),這與其黃酮的相對(duì)含量一致,說(shuō)明接骨木葉片乙酸乙酯萃取組分富含天然抗氧化劑,具有潛在的開(kāi)發(fā)價(jià)值。

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Extraction flavonoids fromSambucuswilliamsiiHance leaves and evaluation of antioxidant activities

SU Xin-fang,YAN Xiao-rong,YAN Gui-qin*

(School of Life Science,Shanxi Normal University,Linfen 041000,China)

On the basis of single factor test,response surface method was adopted to optimize the ethanol extraction process with ultrasonic assistance for total flavonoids ofSambucuswilliamsiiHance leaves. Moreover,analysis on antioxidant activity of different fractions extracted by solvents with different polarity from the ethanol extract had been conducted forSambucuswilliamsiiHance leaves,such as,ethyl acetate,chloroform and butanol. Result showed that,the best process condition of extracting total flavonoids of elderberry leaves with ultrasonic assistance were as follows:ethanol concentration was 70%,solid-liquid ration was 1∶40,extraction temperature was 70 ℃,extraction time was 60 min. Under this condition,the highest extraction rate of total flavonoids could reach up to 18.67%. The four polarity extraction constituents ofSambucuswilliamsiiHance leaves,ethyl acetate,chloroform,butanol and water,relative contents of flavonoid from extracts were 54.3%,28.22%,22.01%,9.817%,and they had a certain of scavenging activity against DPPH and ABTS+free radicals. In fact,the scavenging activity of ethyl acetate was the highest,which indicated that,the extraction of ethyl acetate was the optimized part to separate natural antioxidant fromSambucuswilliamsiiHance leaves.

SambucuswilliamsiiHance;flavonoids;extraction;antioxidant

2016-02-19

蘇新芳(1987-)，女，在讀研究生，研究方向：生態(tài)化學(xué)，E-mail:1006905127@qq.com。

閆桂琴(1956-)，博士，教授，研究方向：,E-mail:gqyn2013@126.com。

山西省化學(xué)優(yōu)勢(shì)重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目(912019)；教育部博士點(diǎn)聯(lián)合基金項(xiàng)目(2011140412003)；山西師范大學(xué)大學(xué)社創(chuàng)新項(xiàng)目(SD2015CXXM-46)。

TS201.1

B

1002-0306(2016)16-0242-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.16.040