李亞嫻,谷　越,汪秋寬,何云海,任丹丹

(大連海洋大學(xué)國家海藻加工技術(shù)研發(fā)分中心,遼寧省水產(chǎn)品加工及綜合利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,遼寧大連 116023)

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澳洲禿參酶解制備多肽的工藝優(yōu)化

李亞嫻,谷越,汪秋寬*,何云海,任丹丹

(大連海洋大學(xué)國家海藻加工技術(shù)研發(fā)分中心,遼寧省水產(chǎn)品加工及綜合利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,遼寧大連 116023)

以澳洲禿參為原料,考察了適宜酶解用酶的種類。以優(yōu)化的復(fù)合酶,通過單因素和正交實(shí)驗(yàn),研究了在不同加酶量、酶解時(shí)間、溫度、pH的條件下,酶解液中多肽的得率。得到了優(yōu)化的酶解條件,并對(duì)酶解產(chǎn)物進(jìn)行了氨基酸組成檢測。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,采用優(yōu)化的復(fù)合酶配方,澳洲禿參最優(yōu)酶解工藝為:酶解溫度55 ℃、pH7.5、料液比1∶5、加酶量1500 U/g蛋白,酶解時(shí)間3 h,多肽得率可達(dá) 18.6%;酶解產(chǎn)物中氨基酸總量占干重約78%,其中必需氨基酸占干重的21%,四種呈味氨基酸總和占干重41%。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果為未來以澳洲禿參為原料研制保健品和調(diào)味品奠定了基礎(chǔ)。

澳洲禿參,酶解,多肽,氨基酸

海參為棘皮動(dòng)物門(Echinodermata)海參綱(Holothurioider)動(dòng)物的總稱。全世界有海參約1000多種,可食用的約有40種,我國約有140種,其中約20種可供食用[1]。海參是一種高蛋白、低脂肪、低糖、高營養(yǎng)價(jià)值的海產(chǎn)品,含有18種以上的氨基酸和多種維生素及豐富的微量元素,已成為傳統(tǒng)的美味佳肴和保健品[2]。海參中蛋白質(zhì)含量豐富,是制備生物活性多肽的理想原料[3]。海參多肽具有良好的溶解性和穩(wěn)定性,易被消化吸收,且食用安全,并且具有降血壓、預(yù)防心腦血管疾病、抗疲勞、提高免疫力、抗腫瘤、抗氧化、延緩衰老等生物活性[4-5]。

近年來,對(duì)于海參多肽的研究多集中于對(duì)提取的工藝優(yōu)化以及其活性、機(jī)理等方面的研究。楊濤[6]等以海參內(nèi)臟為原料,確定了堿性蛋白酶水解制備海參多肽的最佳條件并通過實(shí)驗(yàn)證明海參內(nèi)臟水解的多肽具有較好的清除羥自由基和超氧自由基能力。Schmeer[7]發(fā)現(xiàn)了糖肽或小分子的核蛋白可能具有抗腫瘤的活性。李志英等[8]以干虎紋參為原料,采用木瓜蛋白酶對(duì)其進(jìn)行酶解,得到最優(yōu)酶解工藝為:酶解溫度55 ℃、pH8.0、酶解時(shí)間2 h,最后得到的酶解液具有良好的抗氧化性。付學(xué)軍[9]等以鮮刺參為實(shí)驗(yàn)原料研究了利用酶解法制備海參多肽,同時(shí)分離純化海參多糖的工藝。得到利用A.S1398 精制中性蛋白酶綜合提取海參多肽和多糖的最優(yōu)酶解條件:加水量為鮮海參質(zhì)量的6倍、加酶量1.0%、溫度30 ℃、水解時(shí)間6 h。在該條件下多肽得率達(dá)12.0%,多糖得率達(dá)2.68%。在對(duì)海洋生物的研究中發(fā)現(xiàn),多肽的生理作用與組成多肽的氨基酸序列有關(guān)[10-11]。YuanhuiZhao[12]等對(duì)海地瓜的體壁蛋白進(jìn)行酶解,對(duì)分離純化得到的兩種小分子肽進(jìn)行活性研究,結(jié)果表明這兩種小分子肽對(duì)血管緊張轉(zhuǎn)換酶具有抑制作用。Shinichi Kato[13]等從日本仿刺參口腔中提取出兩種小分子肽分別是五肽和七肽,研究發(fā)現(xiàn)它們對(duì)促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟和生殖細(xì)胞的形成都起到了不同程度的作用。

澳洲禿參學(xué)名糙海參,為棘皮動(dòng)物門、海參屬。產(chǎn)自澳大利亞東北海岸的原生態(tài)深海海域,經(jīng)煮熟去皮后呈光禿狀,故又稱禿參。因其資源極其豐富,價(jià)格十分低廉,為天然保健食品和調(diào)味品研發(fā)提供了廣大的發(fā)展空間。以往的對(duì)多肽酶解工藝的優(yōu)化研究,大多只選用單一酶進(jìn)行酶解,且多選用中性蛋白酶。本實(shí)驗(yàn)以澳洲禿參為實(shí)驗(yàn)原料,選擇兩種酶組成復(fù)合酶,通過單因素及正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化確定海參最佳的酶解工藝并對(duì)海參酶解液中氨基酸組成進(jìn)行了初步的探究。其豐富的必需氨基酸和呈味氨基酸組成,為該酶解物開發(fā)保健食品和調(diào)味品提供了理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

干制澳洲禿參大連水產(chǎn)品市場;木瓜蛋白酶酶活為(354853±4277) U,索萊寶科技有限公司;中性蛋白酶酶活為(238133±3288) U,上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司;風(fēng)味蛋白酶酶活為(23760±2345) U,上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司;安捷倫氨基酸分析試劑盒安捷倫科技有限;高效液相色譜(HPLC)所用的流動(dòng)相為色譜純;其余試劑為市售分析純。

EF20-FiveEasy Plus pH計(jì)梅特勒公司;TU-1810DAPC紫外可見分光光度計(jì)北京普析通用儀器有限公司;安捷倫1260高效液相色譜儀配有可變波長紫外檢測器和安捷倫色譜工作站,數(shù)據(jù)處理系統(tǒng),安捷倫分析儀器公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1原料前處理將海參浸泡于去離子水中進(jìn)行脫鹽,每隔2 h換一次水。使用硝酸銀滴定法[14]檢測,若浸泡液中無沉淀析出則表示脫鹽完成。將海參進(jìn)行勻漿,得勻漿液備用。

1.2.2酶的篩選勻漿液中加入3倍體積水,采用三種酶——木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶,在各自最適酶解條件下(木瓜蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶pH6.5、55 ℃;中性蛋白酶pH7.0、50 ℃),均酶解3h,其加酶量均為3000 U/g蛋白。

1.2.3單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1復(fù)合酶比例優(yōu)化考察將篩選出的兩種酶組成復(fù)合酶,以澳洲禿參為原料,在50 ℃下酶解3 h,加酶量為3000 U/g蛋白,料液比為1∶3,pH為7.0添加中性蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶復(fù)合酶,在復(fù)合酶(中性蛋白酶:風(fēng)味蛋白酶)酶比例依次為1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1條件下測定酶解液中的多肽得率。確定最優(yōu)酶比例。

1.2.3.2酶解反應(yīng)溫度的確定在酶解時(shí)間4 h,酶加量1500 U/g蛋白,料液比為 1∶3,pH為7.0的條件下,設(shè)置酶解溫度依次為40、45、50、55、60、65 ℃,考察各酶解溫度下的多肽得率。

1.2.3.3酶解反應(yīng)時(shí)間的確定在酶解溫度50 ℃,酶加量為1500 U/g蛋白,料液比1∶3,pH為7.0的條件下,設(shè)置酶解時(shí)間依次為3、4、5、6、7、8 h,考察不同酶解時(shí)間對(duì)多肽得率的影響。

1.2.3.4酶解反應(yīng)pH的確定在酶解溫度50 ℃,酶解時(shí)間 4 h,料液比1∶3,酶加量為1500 U/g蛋白的條件下,將pH分別調(diào)至 5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0,考察不同pH對(duì)多肽得率的影響。

1.2.3.5酶解反應(yīng)料液比的確定在酶解溫度50 ℃,酶解時(shí)間 4 h,酶加量1500 U/g蛋白,pH為7.0的條件下,設(shè)置料液比依次為1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7,考察不同料液比對(duì)多肽得率的影響。

1.2.3.6酶解反應(yīng)酶加量的確定在酶解溫度為50 ℃,酶解時(shí)間4 h,料液比1∶3,pH為7.0的條件下,設(shè)置酶加量依次為1000、1500、2000、2500、3000、3500 U/g蛋白,考察不同加酶量對(duì)多肽得率的影響。

1.2.4正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)。本著節(jié)約資源的理念,在正交實(shí)驗(yàn)中料液比因素選擇與單因素實(shí)驗(yàn)相同的斷點(diǎn)。正交因素水平表見表1。

表1　正交因素水平表

1.2.5多肽含量測定使用三氟乙酸(TCA)+雙縮脲法[15-17],測定酶解液中多肽含量。取海參酶解后上清液,加入其等體積10%三氯乙酸溶液,4000 r/min離心10 min,取上清,雙縮脲法測定多肽含量。以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品做標(biāo)準(zhǔn)曲線,得y=0.0348x+0.0167,R2=0.9987。

多肽得率的計(jì)算方法:多肽得率(%)=(酶解液體積×酶解液多肽濃度)/原料中蛋白含量×100

1.2.6澳洲禿參酶解液氨基酸組成分析酶解液按Agilent氨基酸檢測試劑盒說明進(jìn)行衍生,Agilent1260高效液相色譜儀分析檢測。柱溫,27 ℃;檢測波長,360 nm;流動(dòng)相流速,1.2 mL/min;流動(dòng)相A,50%乙腈溶液;流動(dòng)相B,0.05 mol/L醋酸鈉-醋酸緩沖液(pH=6.4)加入1%N,N二甲基甲酰胺。流動(dòng)相梯度設(shè)定如下:0 min,84%A→0.4 min,84%A→4 min,69%A→9.5 min,64%A→17 min,45%A→28 min,35%A→36 min,0%A。

1.2.7數(shù)據(jù)處理每一實(shí)驗(yàn)進(jìn)行三次平行實(shí)驗(yàn),本實(shí)驗(yàn)用Excel軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2　結(jié)果與討論

2.1酶的篩選

對(duì)木瓜蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、中性蛋白酶分別酶解澳洲禿參的酶解液中多肽含量加以比較。由圖1可知,木瓜蛋白酶酶解后多肽得率最低,這可能與木瓜蛋白酶專一性較強(qiáng),酶解速率低有關(guān)。風(fēng)味蛋白酶的酶解效果強(qiáng)于木瓜蛋白酶。中性蛋白酶的酶解效果最好,其海參多肽的得率最高,鑒于以上結(jié)果,在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中,選擇中性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶復(fù)合,對(duì)澳洲禿參進(jìn)行進(jìn)一步的酶解考察。

圖1　三種蛋白酶酶解澳洲禿參的酶解液多肽得率Fig.1　The enzymolysis effects of Holothuria scabra with three different enzymes

2.2酶解工藝的優(yōu)化

2.2.1兩種復(fù)合酶最佳比例的確定兩種復(fù)合酶按不同比例組合對(duì)澳洲禿參酶解后多肽得率如圖2所示,隨著中性蛋白酶在復(fù)合酶中所占比例的不斷增加,酶解液中多肽得率呈先升高,后降低的走勢(shì)。中性蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶的復(fù)合酶在酶比例為3∶1時(shí)達(dá)到最大值;該比例復(fù)合酶的酶解效果優(yōu)于這兩種酶單獨(dú)的酶水解效果。故選取復(fù)合酶的最適比例為3∶1,以此進(jìn)行酶解工藝的單因素與正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化。

圖2　復(fù)合酶比例對(duì)澳洲禿參酶解液多肽得率的影響Fig.2　The effect of two enzyme ratio on the Holothuria scabra enzymolysis

2.2.2酶解溫度對(duì)多肽得率的影響酶解溫度對(duì)酶解液中多肽得率的影響如圖3所示。當(dāng)酶解溫度低于55 ℃時(shí),多肽得率隨酶解溫度增加而升高,55 ℃時(shí)達(dá)到最大值,之后開始下降。其原因?yàn)楫?dāng)反應(yīng)溫度低于反應(yīng)所用酶的最適溫度時(shí),酶解反應(yīng)速率會(huì)隨著溫度的升高而不斷增大;而當(dāng)溫度高于酶最適溫度后,由于酶活力下降酶解效果逐漸下降,酶解液中的多肽得率隨之降低。根據(jù)圖3中結(jié)果,酶解溫度在55 ℃左右時(shí),多肽得率最高。因此選擇50、55、60、65 ℃作為正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)參數(shù)。

圖3　酶解溫度對(duì)澳洲禿參酶解液多肽得率的影響Fig.3　The effects of temperature on the Holothuria scabra enzymolysis

2.2.3酶解時(shí)間對(duì)多肽得率的影響酶解時(shí)間對(duì)酶解液中多肽得率的影響如圖4所示。隨著酶解時(shí)間的增加,多肽得率先升高,4 h時(shí)達(dá)到最大,隨后逐漸下降。分析原因可能是隨著酶解時(shí)間的增加,多肽進(jìn)一步酶解成氨基酸,從而降低酶解液中多肽的得率。因此,酶解反應(yīng)時(shí)間不宜過長,以4 h最優(yōu)。因此,選擇3、4、5、6 h作為后續(xù)正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)參數(shù)。

圖4　酶解時(shí)間對(duì)澳洲禿參酶解液多肽得率的影響Fig.4　The effects of time on the Holothuria scabra enzymolysis

2.2.4pH對(duì)酶解液多肽得率的影響pH對(duì)酶解液中多肽得率的影響如圖5所示。在pH7左右,多肽得率出現(xiàn)峰值。由于風(fēng)味蛋白酶的最適pH為6.5,中性蛋白酶的最適pH為7,又根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室前期針對(duì)加拿大紅參等不同種類海參酶解結(jié)果,表明在偏堿性條件下,酶解效果較好[18],因此,添加pH7.5和8.0兩個(gè)條件一同進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)考察。

圖5　酶解pH對(duì)澳洲禿參酶解液多肽得率的影響Fig.5　The effects of pH valueonthe Holothuria scabra hydrolyzing

圖6　料液比對(duì)澳洲禿參酶解液多肽得率的影響Fig.6　The effects of material and water ratio on the Holothuria scabra enzymolysis

2.2.5料液比對(duì)多肽得率的影響料液比對(duì)酶解液中多肽得率的影響如圖6所示。澳洲禿參在料液比1∶2～1∶5范圍內(nèi)時(shí),酶解液多肽得率隨著反應(yīng)體系中水的增加而提高,料液比在1∶5～1∶7范圍內(nèi)時(shí),多肽得率無顯著性差異。這是由于在料液比為1∶2時(shí),由于反應(yīng)體系中水比較少,使得底物粘稠,與蛋白酶的接觸少,酶解反應(yīng)速率低,以至于酶解程度也較低。隨著反應(yīng)體系中水的增加,酶與底物充分接觸,水解速率不斷增加。又因?yàn)榱弦罕仍?∶5～1∶7范圍內(nèi)時(shí),多肽得率隨料液比變化無明顯增大,考慮到工業(yè)化生產(chǎn)時(shí)加水量過多會(huì)因?yàn)闈饪s工藝增加生產(chǎn)成本,本實(shí)驗(yàn)選擇在1∶5～1∶7范圍內(nèi)以料液比1∶5為代表,與1∶2、1∶3、1∶4一起進(jìn)行正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

2.2.6加酶量對(duì)多肽得率的影響加酶量對(duì)酶解液中多肽得率的影響如圖7所示。酶解液多肽得率會(huì)隨著加酶量的變化而變化。澳洲禿參的最適加酶量為1500 U/g蛋白。當(dāng)酶加量低于其最優(yōu)酶加酶時(shí),會(huì)因酶濃度過低而造成蛋白水解程度降低;相反,過高的酶濃度造成多肽進(jìn)一步水解成氨基酸,從而使其含量降低。后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇1000、1500、2000、2500 U/g蛋白作正交優(yōu)化。

圖7　酶加量對(duì)澳洲禿參酶解液多肽得率的影響Fig.7　The effects of enzyme amount added on the Holothuria scabra enzymolysis

2.2.7酶解條件正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2，由R值可得各因素影響提取過程的主次順序是A(酶解溫度)>C(料液比)>D(酶解時(shí)間)>E(酶加量)>B(pH)。由k值可知最優(yōu)組合為A1B3C4D1E2,即酶解溫度為50 ℃、pH為7.5、料液比1∶5、酶解時(shí)間為3 h、酶加量為1500 U/g蛋白。

表2　澳洲禿參正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3　最優(yōu)實(shí)驗(yàn)組合的驗(yàn)證

正交16組實(shí)驗(yàn)中的多肽得率最大組為A2B3C4D1E2,即酶解溫度55 ℃、pH7.5、料液比1∶5、酶解時(shí)間3 h、酶加量1500 U/g蛋白。對(duì)A1B3C4D1E2、A2B3C4D1E2兩個(gè)組合進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果見表3，兩者的多肽得率分別為18.37%、18.60%，因此經(jīng)過驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),最優(yōu)酶解工藝為A2B3C4D1E2,即酶解溫度為55 ℃、pH為7.5、料液比1∶5、酶解時(shí)間為3 h、酶加量為1500 U/g蛋白,酶解液中多肽得率為18.6%。本研究與蘇永昌等[19]以新鮮地瓜參為原料進(jìn)行的最佳的酶解工藝的研究相比,二者的酶解溫度和時(shí)間一致,pH、加酶量相差無幾,但是后者的多肽得率卻低于本實(shí)驗(yàn)的多肽得率,這可能是由于本研究選用的是中性蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶組成的復(fù)合酶,而蘇永昌等選用的是單一中性蛋白酶進(jìn)行的酶解的原因。這說明復(fù)合酶的酶解效果優(yōu)于一種酶的單獨(dú)酶解效果。

2.3海參酶解液氨基酸分析結(jié)果

由表4可知,澳洲禿參酶解液中氨基酸組成比較全面,其中必需氨基酸占干重的達(dá)21%,四種呈味氨基酸——天冬氨酸,谷氨酸,甘氨酸,丙氨酸占干重達(dá)41%,表明該酶解產(chǎn)物可進(jìn)一步作為保健食品或調(diào)味品進(jìn)行開發(fā)。

表4　酶解液凍干粉氨基酸測定結(jié)果(mg/100 g干基)

3　結(jié)論

研究以澳洲禿參為原料,通過酶的篩選實(shí)驗(yàn)選定了中性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶組成的復(fù)合酶以3∶1為最佳酶比例,通過單因素及正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化確定海參最佳酶解工藝為酶解溫度55 ℃、pH7.5、料液比1∶5、酶解時(shí)間3 h、酶加量1500 U/g蛋白。其酶解液中多肽得率達(dá)18.6%。該海參酶解液中含有豐富的氨基酸,其中呈味氨基酸的比例也較高,可作為保健食品或調(diào)味品原料進(jìn)一步開發(fā)。

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Optimization of enzymolysis technology for preparation of polypeptides fromHolothuriascabra

LI Ya-xian,GU Yue,WANG Qiu-kuan*,HE Yun-hai,REN Dan-dan

(Dalian Ocean University,National R&D Branch Center For Seaweed Processing,Key Laboratory of Aquatic Product Processing and Utilization of Liaoning Province,Dalian 116023,China)

This research focused on the enzymolysis technique usingH.scabrato obtain polypeptides. Using a combination of subtilism and flavourzyme,and through single factor experiments and orthogonal test,the optimal enzymolytic factors such as enzyme dose,time of enzymolysis,temperature and pH value,were determined. The amino acid composition of the enzymolysis product was also analyzed. The results showed that the yield of polypeptides reach up to 18.6% in optimized enzymolysis condition:a material and water ratio of 1∶5 at 55 ℃,with a pH value of 7 and enzyme dose of 1500 U/gprotein,incubated for 3 h.The total amino acids accounted for 78% of the dry weight of the enzymolysis product,in which 21% was made up by essential amino-acid,and 41% was by flavor amino acids. The results provided useful information for future development of functional foods and condiments usingH.scabraas raw material.

Holothuriascabra;enzymolysis;polypeptide;amino acid

2016-02-17

李亞嫻(1985-),女,碩士,研究方向:水生生物資源利用,E-mail:sssa-625@163.com。

汪秋寬(1962-),女,教授,研究方向:水生生物資源利用,E-mail:wqk320@dlou.edu.cn。

海洋公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(201405040)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)16-0215-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.16.034