王偉宇,林　洪,王靜雪

(中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東青島 266003)

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副溶血弧菌噬菌體qdvp001重組內(nèi)溶素誘導(dǎo)表達(dá)以及理化性質(zhì)初步研究

王偉宇,林洪,王靜雪*

(中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東青島 266003)

對重組內(nèi)溶素Lysqdvp001誘導(dǎo)表達(dá)條件進(jìn)行探討,發(fā)現(xiàn)適當(dāng)降低誘導(dǎo)溫度,可以避免包涵體的形成。最終確定誘導(dǎo)表達(dá)條件為25 ℃、IPTG濃度為1 mmol/L、誘導(dǎo)4 h,此時不僅蛋白表達(dá)量大并且不形成包涵體。為研究Lyqdvp001抑菌以及理化性能,采用濁度法對pH、溫度、離子強(qiáng)度對裂解活性的影響進(jìn)行探討。結(jié)果表明,Lysqdvp001具有寬pH適應(yīng)性,pH3～10均能很好發(fā)揮作用;耐高溫,在75 ℃處理30 min仍能維持70%活性;低濃度(0.1 mmol/L)的Zn2+、Fe2+以及各濃度(10、1、0.1 mmol/L)的Ca2+可以明顯提高重組內(nèi)溶素Lysqdvp001活性。結(jié)果顯示重組內(nèi)溶素有作為抑菌劑的潛力。

副溶血弧菌,副溶血弧菌噬菌體,內(nèi)溶素

副溶血弧菌是一種革蘭氏陰性致病菌,廣泛存在于近海岸及各種水產(chǎn)品中[1]。若食用被副溶血弧菌污染的食品易引起食物中毒,出現(xiàn)頭疼、腹瀉、嘔吐等一系列癥狀。近年來,副溶血弧菌引起的食物中毒事件呈現(xiàn)上升趨勢,已經(jīng)成為感染食源性疾病的主要原因之一[2],而且,對食物中毒分離得到的副溶血弧菌進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)細(xì)菌已對一些常用的抗生素產(chǎn)生了耐藥性。有文獻(xiàn)報道,從青島地區(qū)水產(chǎn)品分離得到的副溶血弧菌90%以上對氨芐西林和阿莫西林具有耐藥性[3]。因此,找到能夠替代抗生素并能有效防控副溶血弧菌的抑菌劑迫在眉睫。

內(nèi)溶素是噬菌體編碼的一種裂解酶,它通過裂解細(xì)菌細(xì)胞壁的肽聚糖來幫助子代噬菌體從細(xì)菌細(xì)胞中釋放出去[4]。與噬菌體以及小分子抗生素相比,內(nèi)溶素具有不易產(chǎn)生抗性的優(yōu)點(diǎn)[5-6]。1957年報道了第一個關(guān)于內(nèi)溶素裂解細(xì)菌的研究[7],但直到2001年才報道了鏈球菌噬菌體重組內(nèi)溶素在體內(nèi)和體外都能有效抑制A族鏈球菌的感染[8]。近年來隨著克隆表達(dá)技術(shù)的不斷成熟,越來越多的重組內(nèi)溶素被研究,并且研究表明重組內(nèi)溶素均具有良好的裂解活性[9-12]。因此,內(nèi)溶素作為新型抑菌劑具有很大的潛力。

在前期工作中,本實(shí)驗(yàn)室分離得到一株新型副溶血弧菌噬菌體qdvp001[13],對其進(jìn)行全基因組測序,通過分析后發(fā)現(xiàn)ORF60為編碼內(nèi)溶素的開放式閱讀框,對其進(jìn)行克隆表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)對誘導(dǎo)表達(dá)的最佳條件做了探究,然后分析該內(nèi)溶素的裂解性能,為將內(nèi)溶素應(yīng)用于防控副溶血弧菌方面提供基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

宿主菌副溶血弧菌ATCC 17802(以下簡稱VP17802)購買于美國典型微生物菌種保藏中心;烈性副溶血弧菌噬菌體qdvp001(保存號為CCTCC M 2011143)本實(shí)驗(yàn)室分離純化得到[13];含有內(nèi)溶素基因的重組大腸桿菌BL21-qdvp001本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建并且其制備的重組內(nèi)溶素命名為Lysqdvp001;LB肉湯購買于北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司;2216E肉湯、2216E瓊脂購買于青島海博生物技術(shù)有限公司;液體、固體培養(yǎng)基按照所購培養(yǎng)基的說明配制;異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(簡稱IPTG)購于索萊寶生物技術(shù)有限公司;溶菌酶購于索萊寶生物技術(shù)有限公司。

HZQ-F100型振蕩培養(yǎng)箱哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司;SW-CJ-2FD超凈工作臺蘇凈安泰空氣技術(shù)有限公司;Sigma 3K15型高速冷凍離心機(jī)曦瑪離心機(jī)(上海)有限公司;MLS-3750型高壓蒸汽滅菌鍋日本Sanyo公司;Power Wave XS型酶標(biāo)儀美國Biotek。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1重組內(nèi)溶素Lysqdvp001表達(dá)條件的確定

1.2.1.1誘導(dǎo)時間將重組菌BL21-qdvp001單菌落加入到10 mL含有100 μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中,37 ℃ 150 r/min振蕩過夜培養(yǎng)。次日,按照1∶50的比例將過夜培養(yǎng)的菌液加入到新鮮的LB液體培養(yǎng)基中(含有100 μg/mL卡那霉素),37 ℃ 150 r/min培養(yǎng)至OD600 nm大約0.6,加入IPTG至終濃度為1 mmol/L,37 ℃ 150 r/min誘導(dǎo)8 h,每隔1 h取1 mL菌液,離心去上清,用100 μL SDS-PAGE電泳上樣緩沖液復(fù)融沉淀,煮沸5 min,利用SDS-PAGE電泳檢測誘導(dǎo)時間。

1.2.1.2IPTG誘導(dǎo)濃度將重組菌BL21-qdvp001單菌落加入到10 mL含有100 μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中,37 ℃ 150 r/min振蕩過夜培養(yǎng)。次日,按照1∶50的比例將過夜培養(yǎng)的菌液加入到新鮮的LB液體培養(yǎng)基中(含有100 μg/mL卡那霉素),37 ℃ 150 r/min培養(yǎng)至OD600 nm大約0.6,加入IPTG使不同樣品終濃度分別為0、0.1、0.5、1、2、3、4、5 mmol/L,振蕩誘導(dǎo)4 h,取不同誘導(dǎo)濃度樣品各1 mL按照上述步驟處理進(jìn)行SDS-PAGE檢測。

1.2.1.3誘導(dǎo)溫度的確定將重組菌BL21-qdvp001單菌落加入到10 mL含有100 μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中,37 ℃ 150 r/min振蕩過夜培養(yǎng)。次日,按照1∶50的比例將過夜培養(yǎng)的菌液加入到新鮮的LB液體培養(yǎng)基中(含有100 μg/mL卡那霉素),37 ℃ 150 r/min培養(yǎng)至OD600 nm大約0.6,加入IPTG濃度使其終濃度為1 mmol/L,分別將樣品置于20、25、30、37 ℃下進(jìn)行4 h振蕩誘導(dǎo),不同溫度樣品按照上述步驟分別取樣1 mL進(jìn)行SDS-PAGE檢測。

1.2.1.4重組內(nèi)溶素Lysqdvp001表達(dá)形式的確定將重組菌BL21-qdvp001單菌落加入到10 mL含有100 μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中,37 ℃ 150 r/min振蕩過夜培養(yǎng)。次日,按照1∶50的比例將過夜培養(yǎng)的菌液加入到新鮮的LB液體培養(yǎng)基中(含有100 μg/mL卡那霉素),37 ℃ 150 r/min培養(yǎng)至OD600 nm大約0.6,加入IPTG至終濃度1 mmol/L,分別在25和37 ℃條件下誘導(dǎo)4 h,4000 r/min,離心20 min,去上清,用PBS緩沖液復(fù)融細(xì)菌沉淀,在300 W、工作5 s、休息15 s、工作99次條件下進(jìn)行超聲破碎,然后8000 r/min離心30 min,對上清和復(fù)融沉淀分別進(jìn)行SDS-PAGE檢測。

1.2.2重組內(nèi)溶素Lysqdvp001的純化將重組菌BL21-qdvp001單菌落加入到10 mL含有100 μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中,37 ℃ 150 r/min振蕩過夜培養(yǎng)。次日,按照1∶50的比例將過夜培養(yǎng)的菌液加入到300 mL新鮮的LB液體培養(yǎng)基中(含有100 μg/mL卡那霉素),在最適條件下進(jìn)行誘導(dǎo),然后參考林洪[14]的方法將樣品進(jìn)行離心、復(fù)融、超聲破碎、過濾膜。將4 mL Ni SepharoseTM6 Fast Flow填料加入柱子中,以1 mL/min的流速用超純水和結(jié)合緩沖液沖(20 mmol/L Tris-HCl,300 mmol/L NaCl,pH8.0)洗柱子直至基線平穩(wěn),加入25 mL酶液,用含有30 mmol/L咪唑濃度的結(jié)合緩沖液沖洗柱子以洗脫雜蛋白,用含有150 mmol/L咪唑的緩沖液洗脫目的蛋白,收集OD280 nm峰值的幾管洗脫液,利用10 ku超濾離心管進(jìn)行后續(xù)脫鹽處理。將純化后的重組內(nèi)溶素Lysqdvp001置于-80 ℃保存。

1.2.3濁度法測定重組內(nèi)溶素Lysqdvp001抑菌活性參考Nelson[8]方法,做適當(dāng)修改。挑取副溶血弧菌VP17802至300 mL 2216E液體培養(yǎng)基中,過夜培養(yǎng),菌體離心,用100 mmol/L EDTA復(fù)融5 min,4 ℃、8000 r/min條件下離心10 min,然后用純水復(fù)融、離心兩次獲得細(xì)菌沉淀,-80 ℃保存。

OD450 nm吸光值下降幅度間接表示裂解活性[15]。測定活性之前,將副溶血弧菌細(xì)菌沉淀用50 mmol/L Tris,pH8.2,含0.1% Triton X-100復(fù)融。在96孔板中加入100 μL細(xì)菌復(fù)融液,然后加入100 μL重組內(nèi)溶素Lysqdvp001,室溫下(20 ℃)測定15 min內(nèi)OD450 nm值。以Tris緩沖液作為陰性對照,溶菌酶作為陽性對照,每組3組平行。

1.2.4重組內(nèi)溶素Lysqdvp001的pH穩(wěn)定性將細(xì)菌沉淀用pH3.0～10.0復(fù)融緩沖液復(fù)融。將100 μL重組內(nèi)溶素Lysqdvp001加入到100 μL不同pH的細(xì)菌復(fù)融液中,利用上述濁度法測定酶活并按照公式(1)計算各個組的相對酶活力。

各個實(shí)驗(yàn)組的相對酶活力(%)=各個組的OD450 nm下降值/實(shí)驗(yàn)組中OD450 nm下降最多值×100

式(1)

1.2.5重組內(nèi)溶素Lysqdvp001溫度穩(wěn)定性將保存的Lysqdvp001分裝后分別放于30、37、45、50、55、65、75 ℃水浴,采用濁度法分別測定0、15、30 min時酶活并按照公式(2)計算各組相對酶活。

各個實(shí)驗(yàn)組的相對酶活力(%)=各個組的OD450 nm下降值/未處理組中OD450 nm下降值×100

式(2)

1.2.6重組內(nèi)溶素Lysqdvp001離子強(qiáng)度穩(wěn)定性將100 mmol/L ZnCl2、CaCl2、MgCl2和FeSO4溶液分別加入到已分裝好的細(xì)菌復(fù)融液中,使其終濃度分別為0.1、1、10 mmol/L。100 μL重組內(nèi)溶素Lysqdvp001溶液加入到100 μL 含有不同離子濃度的細(xì)菌復(fù)融液中,濁度法測定酶活,并按照公式(3)計算相對酶活。

各個實(shí)驗(yàn)組的相對酶活力(%)=各個組的OD450 nm下降值/離子濃度為0 mmol/L組OD450 nm下降值×100

式(3)

2　結(jié)果與分析

2.1重組內(nèi)溶素Lysqdvp001表達(dá)條件的確定

2.1.1誘導(dǎo)時間的確定通過測定不同誘導(dǎo)時間下蛋白表達(dá)情況,確定誘導(dǎo)時間為4 h(圖1),既能保證蛋白表達(dá)量,又避免過長時間的誘導(dǎo)表達(dá)導(dǎo)致蛋白失活等情況。

圖1　誘導(dǎo)時間對重組內(nèi)溶素Lysqdvp001表達(dá)影響的SDS-PAGE電泳圖Fig.1　The effects of different time on recombinantendolysin Lysqdvp001 by SDS-PAGE注:M表示蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子量,1為未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的細(xì)菌總蛋白,2～9分別為誘導(dǎo)1～8 h的細(xì)菌總蛋白。

2.1.2IPTG濃度的確定IPTG的濃度對誘導(dǎo)表達(dá)的影響較大,IPTG濃度過高可能會抑制大腸桿菌的生長從而造成蛋白表達(dá)量降低。在0.1～5 mmol/L范圍內(nèi)改變IPTG濃度,最終確定IPTG濃度為1 mmol/L(圖2)。

圖2　IPTG濃度對重組內(nèi)溶素Lysqdvp001表達(dá)影響的SDS-PAGE電泳圖Fig.2　The effects of different IPTG concentration on recombinant endolysin Lysqdvp001 by SDS-PAGE注:M表示蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子量,1為未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的細(xì)菌總蛋白,2～8分別為IPTG濃度為0.1、0.5、1、2、3、4、5 mmol/L時誘導(dǎo)的細(xì)菌總蛋白。

2.1.3誘導(dǎo)溫度及表達(dá)方式的確定通過SDS-PAGE電泳對重組內(nèi)溶素Lysqdvp001的誘導(dǎo)溫度進(jìn)行研究,最終確定最佳表達(dá)條件為37 ℃(圖3)。因此在誘導(dǎo)溫度37 ℃、IPTG濃度1 mmol/L的條件誘導(dǎo)4 h,但是此時重組內(nèi)溶素Lysqdvp001的表達(dá)形式為包涵體(結(jié)果未展示),原因可能是細(xì)菌生長速率過快,導(dǎo)致細(xì)菌體內(nèi)蛋白合成系統(tǒng)負(fù)擔(dān)過重,形成包涵體。因此,降低誘導(dǎo)溫度至25 ℃,其余條件不變,結(jié)果發(fā)現(xiàn)重組內(nèi)溶素主要存在于超聲后的上清液中(圖4),重組內(nèi)溶素Lysqdvp001表達(dá)方式為可溶性表達(dá)。綜上,在25 ℃、IPTG濃度為1 mmol/L、誘導(dǎo)時間為4 h時,重組內(nèi)溶素Lysqdvp001既能保證表達(dá)量又能避免形成包涵體。

圖3　不同溫度對重組內(nèi)溶素Lysqdvp001表達(dá)影響的SDS-PAGE電泳圖Fig.3　The effects of different temperature on recombinant endolysin Lysqdvp001 by SDS-PAGE注:M表示蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子量,1為未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的細(xì)菌總蛋白,2～5分別為溫度20、25、30、37 ℃誘導(dǎo)時的細(xì)菌總蛋白。

圖4　25 ℃誘導(dǎo)條件下重組內(nèi)溶素Lysqdvp001表達(dá)形式Fig.4　The expression form of recombinant endolysin Lysqdvp001 at 25 ℃注:M為蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子量,1為未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的細(xì)菌總蛋白,2為超聲破碎后上清液中的細(xì)菌總蛋白,3為超聲破碎后沉淀中的細(xì)菌總蛋白。

2.2濁度法測定重組內(nèi)溶素Lysqdvp001

當(dāng)細(xì)菌菌體被裂解后,光密度隨著下降,OD450 nm吸光值也下降,因此OD450 nm吸光值可以間接表示細(xì)菌數(shù)量的變化。由圖5可以看出,在5 min時間內(nèi),重組內(nèi)溶素Lysqdvp001使得OD450 nm吸光值下降0.6,和同濃度的400 μg/mL溶菌酶OD450 nm吸光值下降一樣,而Tris緩沖液僅使得OD450 nm吸光值下降0.01,說明重組內(nèi)溶素Lysqdvp001具有很好的抑菌活性。

圖5　濁度法測定重組內(nèi)溶素Lysqdvp001抑菌活性Fig.5　Lytic activity of Lysqdvp001 by turbidity reduction assay

由于革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁外存在一層外膜,阻礙內(nèi)溶素直接作用于細(xì)胞壁,因此當(dāng)內(nèi)溶素從外部裂解革蘭氏陰性細(xì)菌時作用效果不明顯[16]。目前,大多數(shù)研究都是使用外膜通透劑來對外膜進(jìn)行處理。外膜通透劑主要有兩大類,一類是多肽類抗生素,一類是螯合劑[17]。本實(shí)驗(yàn)采用的是常用的EDTA螯合劑,它能螯合吸附二價離子,破壞外膜穩(wěn)定性,從而使內(nèi)溶素高效的發(fā)揮作用[18]。林洪[14]的研究表明,在EDTA的協(xié)同作用下,內(nèi)溶素LysSTP4能有效的殺滅沙門氏菌。內(nèi)溶素EL188和SPN1S在EDTA的共同作用下也有效的殺滅了Pseudomonasaeruginosa和SalmonellaTyphimurium[19-20]。在今后的研究中,可以考慮改變外膜通透劑的種類、用量或者與內(nèi)溶素共同加入來改善內(nèi)溶素的抑菌效果。

2.3重組內(nèi)溶素Lysqdvp001的pH穩(wěn)定性

當(dāng)pH為4時,重組內(nèi)溶素Lysqdvp001酶活力最大,并且酸性條件下,重組內(nèi)溶素Lysqdvp001裂解活性都很好。雖然pH為10時,重組內(nèi)溶素Lysqdvp001裂解活性僅為最高酶活力的40%,但是其仍能將OD450 nm降低0.6左右(結(jié)果未展示),活性仍舊很高。說明重組內(nèi)溶素Lysqdvp001在任何pH條件下均能很好的發(fā)揮裂解作用,與一些嗜堿性裂解酶沙門氏噬菌體STP4-a重組內(nèi)溶素LysSTP4[14]、蠟樣芽孢桿菌噬菌體B4的重組內(nèi)溶素LysB4[21]等相比具有一定的優(yōu)勢。

圖6　pH對重組內(nèi)溶素Lysqdvp001裂解活性影響Fig.6　The effects of pH on the lytic activity of Lysqdvp001

2.4重組內(nèi)溶素Lysqdvp001的溫度穩(wěn)定性

由圖7可以看出,重組內(nèi)溶素在室溫下復(fù)融時酶活力最大。65 ℃以下水浴15 min,酶活力基本不變,維持在最大酶活力的90%左右;當(dāng)溫度升高到75 ℃時,水浴處理15 min,酶活力下降到70%左右,并且水浴30 min后酶活力仍維持在70%左右,說明重組內(nèi)溶素Lysqdvp001具有很好的溫度耐受性。而林洪[14]報道的重組內(nèi)溶素LysSTP4在65 ℃處理30 min后幾乎無裂解活性。

圖7　溫度對重組內(nèi)溶素Lysqdvp001裂解活性的影響Fig.7　The effects of temperature on the lytic activity of Lysqdvp001

2.5重組內(nèi)溶素Lysqdvp001離子穩(wěn)定性

由圖8可以看出,離子濃度對重組內(nèi)溶素Lysqdvp001影響比較大。高濃度的Zn2+和Fe2+(10、1 mmol/L)都顯著地抑制了酶活,低濃度的Zn2+和Fe2+(0.1 mmol/L)能顯著激活酶活。Ca2+能顯著提高酶活,特別是1 mmol/L Ca2+可以提高酶活1.7倍。高濃度(10 mmol/L)和低濃度(0.1 mmol/L)Mg2+均顯著地抑制了酶活,1 mmol/L Mg2+提高了酶活,但并不顯著。

圖8　離子強(qiáng)度對重組內(nèi)溶素Lysqdvp001裂解活性影響Fig.8　The effects of iron concentration on the lytic activity of Lysqdvp001

3　結(jié)論

重組內(nèi)溶素最佳表達(dá)條件為：IPTG濃度為1 mmol/L、25 ℃、誘導(dǎo)4 h,此時蛋白表達(dá)量大且不形成包涵體。通過濁度法測定Lysqdvp001對副溶血弧菌VP170802的裂解效果,得知該重組內(nèi)溶素Lysqdvp001具有生物活性,并且具有寬pH適應(yīng)性,能耐高溫,在75 ℃作用30 min仍能維持70%的酶活力,低濃度(0.1 mmol/L)的Zn2+、Fe2+以及各濃度(10、1、0.1 mmol/L)的Ca2+可以明顯提高重組內(nèi)溶素Lysqdvp001活性。這些性質(zhì)表明重組內(nèi)溶素Lysqdvp001具有成為新型抑菌劑的潛力,為利用內(nèi)溶素防控副溶血弧菌以及其他革蘭氏陰性細(xì)菌提供了理論基礎(chǔ)。

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Characterization of recombinant endolysin fromVibrioparahaemolytics-infecting bacteriophage qdvp001

WANG Wei-yu,LIN Hong,WANG Jing-xue*

(Food Science and Engineering,Ocean University of China,Qingdao 266003,China)

The inducible expression conditions of the recombinant endolysin Lysqdvp001 were discussed,founding that lowering temperature properly could avoid forming inclusion bodies. It was concluded that the recombinant endolysin Lysqdvp001 was induced by the addition of 1 mmol/L IPTG at 25 ℃ for 4 h. Under this condition,the Lysqdvp001 was soluble and was expressed in a high level. Then the Lysqdvp001 was characterized its lytic activity and biochemical properties such as pH,temperature and iron concentration by turbidity assay. The results showed that the Lysqdvp001 was stable over broad pH,maintaining good activities in pH3～10,and temperature ranges,maintaining 70% activity after 30 min at 75 ℃. Low iron concentration(0.1 mmol/L)of Zn2+and Fe2+and different iron concentration(10,1,0.1 mmol/L)of Ca2+could increase lytic activity of Lysqdvp001. In conclusion,the Lysqdvp001 had the potential to be antibacterial agents.

Vibrioparahaemolyticus;Vibrioparahaemolyticus-infecting bacteriophage;endolysin

2016-01-18

王偉宇(1990-),女,碩士研究生,研究方向:食品安全,E-mail:weiyu0828@163.com。

王靜雪(1976-),女,博士,教授,研究方向:食品安全,E-mail:snow@ouc.edu.cn。

山東省科技重大專項(xiàng)(2014ZZCX02703);“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國家科技支撐計劃(2015BAD16B0902)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)16-0205-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.16.032