張　淼,張美莉,狄寅禘,盧　宇

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院,內(nèi)蒙古呼和浩特 010018)

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響應面法優(yōu)化玉米黃粉蛋白水解工藝

張淼,張美莉*,狄寅禘,盧宇

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院,內(nèi)蒙古呼和浩特 010018)

采用堿性蛋白酶制備高水解度的玉米蛋白酶解物,以水解度為考察指標,設計單因素及響應面實驗,優(yōu)化其水解工藝條件。實驗結(jié)果表明:最佳水解工藝條件為底物濃度23 g/L,加酶量(E/S)3.5%,酶解溫度49.7 ℃,酶解時間4 h,pH為9.0,在此條件下,水解度可達到27.18%。

玉米黃粉,蛋白質(zhì),堿性蛋白酶,水解度,響應面法

玉米蛋白粉工廠俗稱“黃粉”,是濕法生產(chǎn)玉米淀粉的副產(chǎn)品,其蛋白質(zhì)含量一般在60%左右,是一種優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)資源。但玉米黃粉氣味獨特、口感粗糙、水溶性差、氨基酸組成不均衡,極大的限制了其在食品工業(yè)中的應用,目前我國主要將其用于飼料或自然排放,造成了蛋白資源的極大浪費和環(huán)境污染[1]。

為了提高玉米黃粉的附加值和完善玉米加工產(chǎn)業(yè)鏈,不少國內(nèi)外學者已經(jīng)開始研究水解玉米黃粉制備生物活性肽[2],它不僅有比蛋白質(zhì)更好的消化吸收性,還具有促進免疫、調(diào)節(jié)激素、抗菌、抗病毒、降血壓和降血脂等生理機能[3]。而在所有的水解方法中,酶法水解因其可控而溫和的反應條件、較高的產(chǎn)品質(zhì)量及大規(guī)模的商業(yè)可用性被認為是最合適的方法[4-6]。

未經(jīng)處理的玉米黃粉中含有黃色素,且殘余淀粉顆粒與玉米蛋白質(zhì)緊密結(jié)合[7],不利于蛋白質(zhì)的提取,因此玉米黃粉需進行脫色、脫淀粉處理后再進行玉米蛋白的提取。玉米蛋白是高度多樣化的蛋白質(zhì),成分包括白蛋白、球蛋白、谷蛋白和醇溶蛋白[8],其中68%以上是醇溶蛋白,22%是谷蛋白,另有1.2%的球蛋白和極少量白蛋白[9]。本研究以預處理玉米黃粉中提取得到的玉米蛋白為原料,采用堿性蛋白酶制備高水解度玉米蛋白酶解物,并確定最優(yōu)水解條件包括底物濃度、酶濃度、溫度、時間和pH,為后續(xù)研究高水解度玉米蛋白酶解物經(jīng)體外消化后所得消化產(chǎn)物的抗氧化性提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

玉米黃粉(蛋白含量57.24%)山東福洋生物科技有限公司;α-淀粉酶(3900 U/g)北京澳博星生物技術有限責任公司;糖化酶(10 WU/g)北京中生瑞泰科技有限公司;堿性蛋白酶(20 WU/g)北京博奧拓達科技有限公司。

DKB-501A型超級恒溫水槽上海森信實驗儀器有限公司;SHZ-88-1水浴恒溫振蕩器上海雅榮生化設備儀器有限公司;PB-10酸度計美國賽多利斯公司;TV-1漩渦混合器北京北德科學器材有限公司;3-18K高速冷凍離心機德國Sigma公司;T6新世紀紫外可見分光光度計北京普析通用儀器有限責任公司;FD-2冷凍干燥機北京博醫(yī)康實驗儀器公司。

1.2實驗方法

1.2.1玉米黃粉的預處理參照孫強[7,10]等的方法并做適當改進,玉米黃粉粉碎,過40目篩,以料液比1∶10(W/V)加入無水乙醇,70 ℃水浴振蕩萃取2 h脫色,離心(6000 r/min,20 min),傾去上清液,沉淀干燥。重復操作兩次,脫色完成。將脫色玉米黃粉以料液比1∶3(W/V)加入超純水,90 ℃糊化1 h后,調(diào)節(jié)pH5.5,60 ℃,加入2%(E/S)的α-淀粉酶,反應至碘實驗不產(chǎn)生藍色,調(diào)節(jié)pH至4.8,45 ℃,加入3%(E/S)的糖化酶,水解4 h,沸水浴滅酶30 min,離心(6000 r/min,20 min),傾去上清液,沉淀干燥,得預處理玉米黃粉。

1.2.2玉米蛋白的提取參照崔立平[11]的方法并做適當改進,將預處理玉米黃粉以料液比1∶16(W/V)加入超純水,用1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至11.0,靜置15 min,用1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至11.0,65 ℃水浴振蕩2 h,離心(6000 r/min,20 min)取上清液,用1 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至4.0,靜置15 min,離心(6000 r/min,20 min),傾去上清液,沉淀用超純水洗滌2次,調(diào)節(jié)pH至7.0,冷凍干燥,得玉米蛋白。

1.2.3玉米蛋白酶解物制備將玉米蛋白制成均勻的懸濁液,用1 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)至適當pH,加入一定量的堿性蛋白酶,于恒溫水浴中進行水解,并保持pH恒定,水解若干小時后調(diào)節(jié)pH至7.0,并迅速沸水浴中滅酶15 min,冷卻后離心(6000 r/min,20 min),取上清液即為玉米蛋白酶解物。

1.2.4水解度(DH)的測定采用茚三酮法[12]。

式中:h-水解后每克蛋白質(zhì)被裂解的肽鍵毫摩爾數(shù),mmol/g;htot-每克原料蛋白質(zhì)的肽鍵毫摩爾數(shù),mmol/g;玉米蛋白htot為7.35 mmol/g;c-水解液中游離氨基濃度,μmol/mL;ρ-水解液中蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度,mg/mL;m-每克原料蛋白質(zhì)的游離氨基的毫摩爾數(shù),0.06426 mmol/g。

1.2.5不同因素對水解度的影響

1.2.5.1底物濃度對水解度的影響在pH9.0、加酶量(E/S)2%、酶解溫度50 ℃條件下水解4 h,測定不同底物濃度(10、30、50、70、90 g/L)下的水解度,3次平行實驗,取平均值,以水解度為考察指標,做水解度隨底物濃度變化曲線。

1.2.5.2pH對水解度的影響在底物濃度30 g/L、加酶量(E/S)2%、酶解溫度50 ℃條件下水解4 h,測定不同pH(8.0、8.5、9.0、9.5、10.0)下的水解度,3次平行實驗,取平均值,以水解度為考察指標,做水解度隨pH變化曲線。

1.2.5.3加酶量對水解度的影響在底物濃度30 g/L、在pH9.0、酶解溫度50 ℃條件下水解4 h,測定不同加酶量(E/S)(1%、2%、3%、4%、5%)下的水解度,3次平行實驗,取平均值,以水解度為考察指標,做水解度隨加酶量變化曲線。

1.2.5.4酶解溫度對水解度的影響在底物濃度30 g/L、pH9.0、加酶量(E/S)2%條件下水解4 h,測定不同酶解溫度(40、45、50、55、60 ℃)下的水解度,3次平行實驗,取平均值,以水解度為考察指標,做水解度隨酶解溫度變化曲線。

1.2.5.5酶解時間對水解度的影響在底物濃度30 g/L、pH9.0、加酶量(E/S)2%、酶解溫度50 ℃條件下水解,測定不同酶解時間(3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 h)下的水解度,3次平行實驗,取平均值,以水解度為考察指標,做水解度隨酶解時間變化曲線。

1.2.6響應面優(yōu)化設計在單因素實驗基礎上,選取加酶量、酶解溫度、底物濃度3個因素為自變量,水解度為響應值,根據(jù)Box-Behnken中心組合設計原理設計3因素3水平實驗,其中-1、0、1代表各因素的低、中、高水平,實驗因素水平編碼表見表1。

表1　因素水平及編碼

1.3數(shù)據(jù)處理

本研究采用Excel和Design Expert 8.0軟件完成數(shù)據(jù)的處理及分析。

2　結(jié)果與分析

2.1單因素實驗結(jié)果

2.1.1底物濃度對水解度的影響由圖1可知,當?shù)孜餄舛葹?0 g/L時,水解度達到最大,底物濃度超過30 g/L時,水解度隨底物濃度增高反而減小,其原因可能是底物濃度增大后,蛋白不能充分浸潤,進而影響了酶對蛋白的作用[13],故選取30 g/L的底物濃度為最佳。

圖1　底物濃度對水解度的影響Fig.1　Effect of substrate concentration on degree of hydrolysis

2.1.2pH對水解度的影響由圖2可知,當pH為9時,水解度達到最大,pH超過9時,水解度隨pH增高反而減小,故選取pH9.0為最佳。pH的改變能影響酶活性中心上必需基團的解離程度,同時影響底物和輔酶的解離程度,從而影響酶分子對底物分子的結(jié)合和催化作用[14]。

圖2　pH對水解度的影響Fig.2　Effect of pH on degree of hydrolysis

2.1.3加酶量對水解度的影響由圖3可知,水解度隨加酶量的增高而持續(xù)增大,當加酶量低于3%時,水解度迅速增大,而加酶量高于3%時,水解度增大幅度很小。這可能因為底物濃度一定的情況下,加酶量未使底物飽和時,酶濃度越大,對肽段的切割作用越大,水解度越大;當加酶量增加到一定值時,反應體系內(nèi)酶過量,底物被酶所飽和,底物上可供酶所切割的位點有限,再增加酶量,水解度也不會有更大的變化[15]。因此從經(jīng)濟角度考慮,選擇3%的加酶量為最佳。

圖3　加酶量對水解度的影響Fig.3　Effect of proteases dosage on degree of hydrolysis

2.1.4酶解溫度對水解度的影響由圖4可知,當溫度為50 ℃時,水解度達到最大,溫度超過50 ℃時,水解度隨溫度升高反而減小,這是因為酶分子吸收了過多的能量,引起維持酶分子結(jié)構(gòu)的次級鍵解體,導致蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,使得酶活力減弱[14],故選取溫度50 ℃為最佳。

圖4　酶解溫度對水解度的影響Fig.4　Effect of hydrolysis temperature on degree of hydrolysis

2.1.5酶解時間對水解度的影響由圖5可知,水解度隨時間的增長而持續(xù)增大,當時間小于4 h時,水解度迅速增大,而時間大于4 h時,水解度增大幅度很小,這是因為隨著產(chǎn)物的增加,酶可作用的肽鍵逐漸減少,酶催化反應達到平衡狀態(tài),酶活力受到抑制[16]。因此從效率角度考慮,選擇時間4 h為最佳。

圖5　酶解時間對水解度的影響Fig.5　Effect of hydrolysis time on degree of hydrolysis

2.2響應面實驗結(jié)果與分析

2.2.1響應面實驗結(jié)果與方差分析根據(jù)單因素實驗結(jié)果,選取A加酶量,B酶解溫度,C底物濃度進行3因素3水平的響應面分析實驗,實驗設計及結(jié)果見表2。

表2　響應面實驗設計及結(jié)果

表3　回歸模型方差分析

注:*表示差異顯著(p<0.05);**表示差異極顯著(p<0.01)。

根據(jù)表2的實驗數(shù)據(jù),利用Design Expert 8.0軟件對數(shù)據(jù)進行回歸分析,擬合后得到水解度(Y)與加酶量(A),酶解溫度(B)和底物濃度(C)的二次多項回歸方程為:

Y=+26.67+1.04A-0.18B-0.81C-0.050AB-0.63AC+0.29BC-1.44A2-2.52B2-1.54C2

回歸方程的方差分析見表3。由表3可知,模型(p<0.0001)極顯著,失擬項(p=0.2419>0.05)不顯著,R2=0.9967,表明該模型相關性好,預測值與實際值擬合度良好。各因素對水解度影響的先后順序為:加酶量>底物濃度>酶解溫度。一次項A和C影響極顯著,B影響不顯著,表明加酶量和底物濃度對水解度影響都很大。交互項中AC影響極顯著,BC影響顯著,AB影響不顯著,表明加酶量與底物濃度、溫度與底物濃度都存在交互作用,由此可知各因素對水解度的影響并不是簡單的線性關系[17]。二次項A2、B2和C2影響均極顯著。

圖6　各因素兩兩間交互作用對水解度影響的響應曲面圖Fig.6　Response surface plots of variable parameters on degree of hydrolysis

2.2.2響應曲面分析在回歸模型方差分析的基礎上,根據(jù)回歸方程,利用Design Expert 8.0軟件得到具有顯著和極顯著交互作用的任意兩因素響應曲面圖和等高線圖,如圖6所示。等高線的形狀可以反映出交互效應的強弱,橢圓形表示兩因素交互作用顯著,而圓形與之相反[18]。另外,同一等高線圖中,等高線密度大的因素對響應值的影響大于等高線密度小的因素。由圖6可以看出,底物濃度與加酶量對水解度影響極顯著,當酶解溫度固定為50 ℃,底物濃度在23 g/L左右,加酶量(E/S)在3.45%左右時水解度達到最大值;當加酶量(E/S)在3%時,水解度受酶解溫度和底物濃度交互作用影響較大,在一定范圍內(nèi)水解度隨著酶解溫度和底物濃度的升高而增大,當酶解溫度在49.75 ℃左右,底物濃度在24 g/L左右,水解度達到極值,但隨著酶解溫度和底物濃度的逐漸升高,水解度反而減小。

2.2.3驗證實驗利用Design Expert 8.0軟件,對所建立的數(shù)學模型進行參數(shù)最優(yōu)化分析,得到優(yōu)化水解工藝條件為:加酶量(E/S)3.44%,酶解溫度49.7 ℃,底物濃度22.8 g/L,理論水解度為27.05%。為方便實際操作,修正加酶量為3.5%,底物濃度為23 g/L,酶解溫度保持不變,在酶解時間4 h、pH9.0下重復進行3次平行實驗,實際測得平均水解度為27.18%,與理論值相差約0.50%。因此,各工藝參數(shù)合理可靠,具有實際應用價值。

3　結(jié)論

本研究通過單因素實驗確定堿性蛋白酶水解玉米蛋白的初始水解條件為底物濃度30 g/L,pH9.0,加酶量(E/S)3%,酶解溫度50 ℃,酶解時間4 h。在此基礎上,進行響應面分析實驗,確定各因素對水解度影響的先后順序為:加酶量>底物濃度>酶解溫度,并得到最佳水解工藝條件:加酶量(E/S)3.5%,酶解溫度49.7 ℃,底物濃度23 g/L,酶解時間4 h,pH9.0,在此條件下測得水解度可達到27.18%。通過回歸方程的方差分析可知,該模型對實驗擬合度較高,應用該模型優(yōu)化水解工藝條件可靠。

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Optimization of hydrolysis technology of corn gluten meal by response surface methodology

ZHANG Miao,ZHANG Mei-li*,DI Yin-di,LU Yu

(College of Food Science and Engineering,Inner Mongolia Agricultural University,Huhhot 010018,China)

The corn polypeptide with high degree of hydrolysis(DH)was prepared by alkaline protease,with corn protein as raw material and degree of hydrolysis as detecting index by mono-factor analysis and response surface methodology. The results showed that under the optimal conditions:substrate concentration 23 g/L,proteases dosage 3.5%,hydrolysis temperature 49.7 ℃,hydrolysis time 4 h and pH 9.0,the degree of hydrolysis was 27.18%.

corn gluten meal;protein;alkaline protease;degree of hydrolysis;response surface methodology

2016-02-19

張淼(1990-),女,碩士研究生,研究方向:特色農(nóng)產(chǎn)品加工,E-mail:miaomiao10010@126.com。

張美莉(1966-),女,博士,教授,研究方向:植物生物活性成分的分離提取,E-mail:zhangmeili22@sina.com。

內(nèi)蒙古自然科學基金(2013MS1221)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)16-0201-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.16.031