冉凡嬌,孫　謐,包　靜,郝建華

(1.農(nóng)業(yè)部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,青島市海洋酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所,山東青島 266071;2. 上海海洋大學(xué)食品學(xué)院,上海 201306)

?

Bohai sea-9145重組脂肪酶基因工程菌的發(fā)酵表達(dá)條件優(yōu)化

冉凡嬌1,2,孫謐1,*,包靜1,郝建華1

(1.農(nóng)業(yè)部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,青島市海洋酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所,山東青島 266071;2. 上海海洋大學(xué)食品學(xué)院,上海 201306)

為提高大腸桿菌(E.coli)基因工程菌產(chǎn)Bohai sea-9145重組脂肪酶(Lipase,EC3.1.1.3)的能力,有效制備Bohai sea-9145脂肪酶。采用單因素實(shí)驗(yàn)、Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)和Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn),對該重組酶基因工程菌的發(fā)酵表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化。最終確定的最佳條件是:接種量為1.5%,培養(yǎng)基的初始pH為8.0,誘導(dǎo)劑IPTG的添加時間為3.5 h,終濃度為0.5 mmol/L,誘導(dǎo)時間為15 h,誘導(dǎo)溫度為16 ℃,搖床轉(zhuǎn)速為200 r/min,經(jīng)優(yōu)化后該菌的產(chǎn)酶量是優(yōu)化前的9.72倍。

Bohai sea-9145重組脂肪酶,基因工程菌,產(chǎn)酶條件優(yōu)化,響應(yīng)面分析

脂肪酶(Lipase,EC3.1.1.3)是一類主要水解甘油三酯的?；饷?可以將甘油三酯降解生成甘油二酯、單甘油酯和脂肪酸,是一種重要的工業(yè)酶制劑[1]。在食品[2-3]、制藥[4]、有機(jī)合成[5]、皮革[6]、日用化工[7]等方面具有非常廣闊的應(yīng)用前景。

海洋微生物的生活環(huán)境較陸地微生物復(fù)雜多樣,來自海洋的微生物酶類比陸地微生物酶作用范圍更廣,應(yīng)用前景更廣闊,已經(jīng)成為各國科學(xué)家廣泛關(guān)注的熱點(diǎn)。Bohai sea-9145脂肪酶是一種來自海洋的新型低溫堿性脂肪酶,具有極大的發(fā)展?jié)摿?其脂肪酶基因lipYp(1116 bp)來源于海洋酵母YarrowialipolyticaBohai sea-9145,該酵母于2004年由邵鐵娟等[8]從2000多份渤海海區(qū)海水海泥樣品中分離出來;隨后,董宏偉等[9]對該酶的分離純化條件及理化性質(zhì)進(jìn)行了研究,得到達(dá)到電泳純的脂肪酶,分子量為(40.0±1) ku;李忠磊等[10]采用基因重組和分子生物學(xué)相關(guān)技術(shù),將該酶基因進(jìn)行了異源表達(dá)。

本文的研究是在該酶大腸桿菌基因工程菌BL21的基礎(chǔ)上進(jìn)行的,基因工程菌易繁殖、易培養(yǎng)、代謝快的特點(diǎn)使該酶的制備得以簡化,但產(chǎn)酶效率仍然不高,其酶液活力僅為121.38 U/mL。本文主要通過單因素實(shí)驗(yàn)、Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)和Box-Behnken響應(yīng)面分析設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的方法,對Bohai sea-9145大腸桿菌基因工程菌的發(fā)酵表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化,提高該脂肪酶的制備效率。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

海洋解脂耶氏酵母(Y.lipolyticaBohaisea-9145)由本研究團(tuán)隊(duì)自渤海海泥中分離并鑒定保存;埃希氏大腸桿菌(EscherichiacoliBL21 PET22-LiYp,E.coli)基因工程菌由本研究團(tuán)隊(duì)構(gòu)建并提供;對硝基苯基月桂酸酯(p-nitropHenyl laurate,pNP-laurate)、對硝基苯酚(p-nitrophenol,pNP)、卡那霉素(kanamycin,Kana)、氨芐青霉素(ampicillin,Amp)和異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside,IPTG)購自Sigma公司;蛋白胨和酵母粉購自英國Oxoid公司;Prestained Protein Marker購自New England Bio Labs公司;其它試劑均購自國藥集團(tuán);LB液體培養(yǎng)基胰蛋白胨1%,酵母粉0.5%,氯化鈉1%;LB固體培養(yǎng)基LB液體培養(yǎng)基加2%的瓊脂。

SHIMADZU UV-2550島津分光光度計(jì)購自日本島津公司;SHAKER型恒溫培養(yǎng)搖床購自上海市離心機(jī)械研究所;SW-CJ型超凈工作臺購自中外合資蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;20PR-52D高速冷凍離心機(jī)購自日立公司;LKB2219恒溫水浴購自瑞典BROMMA公司;ORION Model 818 pH計(jì)購自美國奧立龍;JY96-ⅡN型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)購自寧波新芝科技生物股份有限公司;Bio-Rad Mini III蛋白電泳儀購自美國伯樂公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1溶液的配制100 mg/mL Kana貯存液配制:1 g Kana溶于10 mL雙蒸水中,0.22 μm的濾膜過濾除菌,分裝后-20 ℃保存;2.38 g IPTG溶于10 mL雙蒸水或去離子水中,0.22 μm的濾膜過濾除菌,分裝后-20 ℃保存;脂肪酶測活A(yù)液,83.33 mg pNP-laurate溶于異丙醇定容至25 mL,4 ℃保存;脂肪酶測活B液,4.0 g Triton X-100溶于100 mmol/L pH8.0磷酸鹽緩沖液中,定容至1 L,4 ℃保存。

1.2.2脂肪酶活性的測定參照李忠磊[10]和Hatzinikolaou[11]等的方法并加以改進(jìn)。適宜條件下pNP-laurate作為底物,可被脂肪酶等摩爾的分解為pNP,其最大吸收峰在410 nm,因而檢測產(chǎn)物中的pNP在410 nm處的吸光度即可確定脂肪酶的酶活力。

將100 μL A液和1.5 mL B液混合置于35 ℃水浴中預(yù)熱3 min,隨后加入100 μL酶液(對照組選擇100 ℃滅活的酶液),繼續(xù)水浴6 min,反應(yīng)結(jié)束后加入2.0 mL乙醇并冰浴終止反應(yīng),410 nm下測定其吸光值。

脂肪酶活力單位(U)定義為,在35 ℃,pH8.0的條件下,每分鐘催化底物水解產(chǎn)生1.0 μmol pNP所需的酶量。

1.2.3大腸桿菌工程菌發(fā)酵產(chǎn)酶的單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1培養(yǎng)基初始pH對產(chǎn)酶的影響調(diào)整LB培養(yǎng)基的初始pH分別為6、7、7.5、8、8.5、9,保持其他條件相同對重組酶基因工程菌進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后收集菌體并破碎細(xì)胞,檢測酶活性,以酶活力最高的數(shù)據(jù)為100%,計(jì)算相對酶活(以下同上)。

1.2.3.2接種量對產(chǎn)酶的影響調(diào)整培養(yǎng)基的初始pH為“1.2.3.1”項(xiàng)的最優(yōu)值,將種子液分別按0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%的接種量接種,其它條件同“1.2.3.1”。培養(yǎng)結(jié)束后收集菌體并破碎細(xì)胞,檢測酶活性。

1.2.3.3誘導(dǎo)劑添加時間對產(chǎn)酶的影響調(diào)整培養(yǎng)基的初始pH為“1.2.3.1”項(xiàng)的最優(yōu)值,按“1.2.3.2”項(xiàng)的最適接種量接種,在37 ℃、200 r/min的條件下分別培養(yǎng)2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6 h,加入誘導(dǎo)劑IPTG進(jìn)行誘導(dǎo),并在每個時間段取樣測大腸桿菌的菌體濃度OD600,尋找最佳誘導(dǎo)時機(jī)。培養(yǎng)結(jié)束后收集菌體并破碎細(xì)胞,檢測酶活性。

1.2.3.4誘導(dǎo)劑終濃度對產(chǎn)酶的影響調(diào)整培養(yǎng)基的初始pH為“1.2.3.1”項(xiàng)的最優(yōu)值,按“1.2.3.2”項(xiàng)的最適接種量接種,在“1.2.3.3”項(xiàng)優(yōu)化的最佳時間加入誘導(dǎo)劑IPTG,調(diào)整其終濃度分別為0.1、0.3、0.5、0.7、1.0、1.2、1.4 mmol/L。培養(yǎng)結(jié)束后收集菌體并破碎細(xì)胞,檢測酶活性。

1.2.3.5誘導(dǎo)溫度對產(chǎn)酶的影響根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果調(diào)整培養(yǎng)基的初始pH、接種量、誘導(dǎo)劑添加時間分別為最優(yōu)值,讓加入誘導(dǎo)劑后的菌液分別在8、16、22、30、37 ℃下誘導(dǎo)培養(yǎng)過夜。培養(yǎng)結(jié)束后收集菌體并破碎細(xì)胞,并檢測酶活性。

1.2.3.6誘導(dǎo)時間對產(chǎn)酶的影響根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別調(diào)整培養(yǎng)基的初始pH、接種量、誘導(dǎo)劑添加時間、誘導(dǎo)溫度為最優(yōu)值,將菌液分別誘導(dǎo)6、8、10、12、14、16、18、20、22 h。收集菌體并破碎細(xì)胞,檢測酶活性。

1.2.3.7搖床轉(zhuǎn)速對菌體產(chǎn)酶的影響根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別調(diào)整培養(yǎng)基的初始pH、接種量、誘導(dǎo)劑添加時間、誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時間為最優(yōu)值,在搖床轉(zhuǎn)速分別為80、100、140、180、200、220、240 r/min的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后收集菌體并破碎細(xì)胞,檢測酶活性。

1.2.4響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵條件

1.2.4.1用Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)篩選主要影響因子根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)選取培養(yǎng)基初始pH、接種量、誘導(dǎo)劑添加時間、誘導(dǎo)劑終濃度、誘導(dǎo)時間、誘導(dǎo)溫度和搖床轉(zhuǎn)速共7個因素進(jìn)行PB實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1,為響應(yīng)面法優(yōu)化產(chǎn)酶條件篩選主要影響因子[12]。

1.2.4.2利用Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)確定最佳配方根據(jù)PB實(shí)驗(yàn)結(jié)果,本設(shè)計(jì)選取誘導(dǎo)劑添加時間、誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時間作為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的主要影響因子(其他條件按單因素實(shí)驗(yàn)最優(yōu)結(jié)果),各因素及水平如表2所示。

表1　Plackett-Burman設(shè)計(jì)因子水平

表2　響應(yīng)面因子及水平

1.3數(shù)據(jù)處理

單因素實(shí)驗(yàn)每個因素重復(fù)三次,采用Microsoft Office Excel 2003處理數(shù)據(jù)并作圖;Plackett-Burman和Box-Behnken實(shí)驗(yàn)采用Design Expert 8.0.5.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理并作圖。

2　結(jié)果與分析

2.1單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1培養(yǎng)基初始pH對產(chǎn)酶的影響外部環(huán)境的pH會影響基因工程菌的生長和代謝,一般來說大腸桿菌的最適生長pH在6.0～8.0范圍內(nèi),不同類型的重組工程菌,適合其外源蛋白表達(dá)的pH是不同的。如圖1所示,當(dāng)培養(yǎng)基初始pH在7.5～8.5范圍內(nèi)時較適合外源蛋白的表達(dá),因而相對酶活較高,當(dāng)pH為8.0時,相對酶活達(dá)到最大值。因此,本實(shí)驗(yàn)確定培養(yǎng)基的初始pH為8.0。

圖1　培養(yǎng)基初始pH對菌株產(chǎn)酶的影響Fig.1　The effect of different initial pH of the medium on the production of enzyme

圖2　不同接種量對菌株產(chǎn)酶的影響Fig.2　The effect of different amount of inoculation on the production of enzyme

2.1.2接種量對產(chǎn)酶的影響如圖2所示,當(dāng)接種量從0.5%增加到1.5%時,隨著接種量的增大,相對酶活呈上升趨勢,這是因?yàn)樵诖诉^程中細(xì)菌生長速度的加快使菌濃度增加,蛋白表達(dá)量升高,酶活隨之增大,當(dāng)接種量為1.5%時,相對酶活達(dá)到最大值,當(dāng)接種量繼續(xù)增大時,由于細(xì)菌生長過快,代謝產(chǎn)物積累過多,影響了后期蛋白的表達(dá),產(chǎn)酶量開始降低。因此,本實(shí)驗(yàn)確定的最佳接種量為1.5%。

2.1.3誘導(dǎo)劑添加時間對產(chǎn)酶的影響誘導(dǎo)劑添加的越晚,菌體密度越高,但菌體相對較老,蛋白表達(dá)效率會降低。誘導(dǎo)劑添加的越早,細(xì)菌越快從生長階段進(jìn)入表達(dá)階段,但由于菌體總密度較低,因而蛋白表達(dá)量不高[13]。因此需要對該菌的菌體濃度進(jìn)行分析,并選擇合理的時間添加誘導(dǎo)劑。如圖3所示,當(dāng)OD600在0.6～0.8的范圍內(nèi),即種子液培養(yǎng)后的2.5～4 h內(nèi)添加誘導(dǎo)劑IPTG時,相對酶活處于較高狀態(tài),當(dāng)培養(yǎng)至3.5 h(OD600=0.75)添加誘導(dǎo)劑IPTG時,相對酶活達(dá)到最高值。因此,本實(shí)驗(yàn)確定誘導(dǎo)劑IPTG的添加時間為3.5 h(即OD600=0.75時)。

圖3　誘導(dǎo)劑添加時間對菌株產(chǎn)酶的影響Fig.3　The effect of different timeto add inducing agent on the production of enzyme

2.1.4誘導(dǎo)劑終濃度對產(chǎn)酶的影響誘導(dǎo)劑IPTG的濃度與蛋白表達(dá)的速度相關(guān),高濃度的IPTG會加快外源蛋白的表達(dá),但是IPTG具有一定的細(xì)胞毒性,濃度過高時會降低細(xì)胞的活性。從圖4中可以看出當(dāng)誘導(dǎo)劑濃度在0.3～0.7 mmol/L時,菌體表達(dá)外源蛋白的速率較高,酶活維持在相對較高的狀態(tài),當(dāng)誘導(dǎo)劑終濃度為0.5 mmol/L時的相對酶活最大。因此,本實(shí)驗(yàn)確定誘導(dǎo)劑的終濃度為0.5 mmol/L。

圖4　誘導(dǎo)劑終濃度對菌株產(chǎn)酶的影響Fig.4　The effect of different inducerconcentration on ezyme production

2.1.5誘導(dǎo)溫度對產(chǎn)酶的影響降低溫度可以減緩菌體生長的速度,降低蛋白表達(dá)的速率,延長蛋白表達(dá)的時間。如圖5所示,當(dāng)誘導(dǎo)溫度為8 ℃時,由于溫度過低,外源蛋白表達(dá)的速率較低,因而酶活較低;當(dāng)誘導(dǎo)溫度為16 ℃時,相對酶活最高;當(dāng)誘導(dǎo)溫度繼續(xù)升高時,外源蛋白表達(dá)速率加快,形成的不溶性包含體增多,因而酶活逐漸降低。從圖6 SDS-PAGE電泳圖中可以看出,當(dāng)誘導(dǎo)溫度為16 ℃時的蛋白表達(dá)量最高,這一結(jié)果與圖5結(jié)果相符合,說明16 ℃是該酶表達(dá)蛋白的最佳誘導(dǎo)溫度。因此,本實(shí)驗(yàn)確定誘導(dǎo)溫度為16 ℃。

圖5　不同誘導(dǎo)溫度對菌株產(chǎn)酶的影響Fig.5　The effect of different induced temperature on the production of enzyme

圖6　不同誘導(dǎo)溫度樣品蛋白的SDS-PAGE條帶Fig.6　SDS-PAGE analysis of the protein by different induce temperature注:M:標(biāo)準(zhǔn)蛋白;1～5:8、16、22、30、37 ℃誘導(dǎo)的樣品。

2.1.6誘導(dǎo)時間對產(chǎn)酶的影響如圖7所示,當(dāng)誘導(dǎo)時間為6～14 h時,菌體密度逐漸升高,蛋白合成旺盛,酶活隨誘導(dǎo)時間的延長而提高,在14 h時達(dá)到最高值,當(dāng)誘導(dǎo)時間超過14 h時,菌體由于生長時間過長而衰退,酶活逐漸降低。SDS-PAGE分析結(jié)果如圖8所示,當(dāng)誘導(dǎo)時間為14 h時的蛋白含量最高,說明誘導(dǎo)總時間為14 h時可以較好的表達(dá)重組酶蛋白。因此,本實(shí)驗(yàn)確定誘導(dǎo)時間為14 h。

圖7　不同誘導(dǎo)時間對菌株產(chǎn)酶的影響Fig.7　The effect of different induced time on the production of enzymy

圖8　不同誘導(dǎo)時間下樣品蛋白的SDS-PAGE條帶Fig.8　SDS-PAGE analysis of the protein by different induce time注:M:標(biāo)準(zhǔn)蛋白;1～9:誘導(dǎo)6、8、10、12、14、16、18、20、22 h的目的條帶。

2.1.7不同搖床轉(zhuǎn)速對產(chǎn)酶的影響如圖9所示,當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速從80 r/min增加到200 r/min時,發(fā)酵液中的溶氧隨轉(zhuǎn)速增加而升高,菌體生長速度加快,酶活逐漸增加,當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速為200 r/min時酶活最高,轉(zhuǎn)速繼續(xù)增加后,發(fā)酵液中泡沫增多,影響溶氧,菌體生長減緩,酶活降低。因此,本實(shí)驗(yàn)確定搖床轉(zhuǎn)速為200 r/min。

圖9　不同搖床轉(zhuǎn)速對菌株產(chǎn)酶的影響Fig.9　The effect of different rotation speed on enzyme production

2.2響應(yīng)面法優(yōu)化產(chǎn)酶條件

2.2.1Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)篩選主要影響因素PB實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3,方差分析見表4。從表4可以看出,誘導(dǎo)劑添加時間、誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時間的p值均小于0.05,是顯著影響因子,三者貢獻(xiàn)值之和達(dá)89.31%,其中誘導(dǎo)劑添加時間的貢獻(xiàn)值為58.24,是最顯著的影響因子。

表4　PB實(shí)驗(yàn)分析

表3　PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.2.2Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)法確定最佳配方本實(shí)驗(yàn)在單因素實(shí)驗(yàn)及PB實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上,以Bohai sea-9145脂肪酶酶活作為響應(yīng)值Y,采用多元二次回歸方程擬合各因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系,設(shè)計(jì)三因素三水平的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn),通過回歸方程,優(yōu)化工藝參數(shù),預(yù)測響應(yīng)值,并對影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的因子及其交互作用進(jìn)行評價(jià),確定最佳發(fā)酵表達(dá)條件。每組實(shí)驗(yàn)做三組平行,取其平均值,實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表5所示。

表6　響應(yīng)面模型的方差分析表

表5　Box-Behnken設(shè)計(jì)方案及結(jié)果

從表6可以看出該響應(yīng)面模型是顯著的,F值為829.46表示僅有0.01%的可能是由噪音引起的,其中,A、B、C、AB、AC、A2、B2、C2的p值均小于0.05，是顯著模型項(xiàng),同時失擬F值為3.85(p=0.1127)表示該模型的失擬項(xiàng)不顯著,方程的R2等于0.9979,說明酶活實(shí)測值與預(yù)測值擬合度較好,該模型能較好的解釋菌株產(chǎn)酶量的變化。二次多項(xiàng)式回歸方程為:

Y=1170.74+82.79A+25.65B+43.46C-14.28AB+29.43AC+9.23BC-357.54A2-140.63B2-165.36C2

根據(jù)上面的方程繪制的響應(yīng)面分析如圖10所示,從圖10中可以看出AB、AC的曲面較明顯,交互作用較大,A-誘導(dǎo)劑添加時間和B-誘導(dǎo)溫度與酶活的關(guān)系呈標(biāo)準(zhǔn)的拋物線型,且有一極大值點(diǎn),說明酶活隨誘導(dǎo)溫度升高和誘導(dǎo)劑添加時間的增加而提高,當(dāng)誘導(dǎo)劑添加時間為3.5 h,誘導(dǎo)溫度為16 ℃時的酶活達(dá)到其極大值點(diǎn),當(dāng)誘導(dǎo)劑添加時間繼續(xù)延長,誘導(dǎo)溫度繼續(xù)升高時酶活降低,說明此時的誘導(dǎo)劑添加時間及溫度不適宜外源蛋白的表達(dá),對AC的交互作用同理可分析。

圖10　兩因子之間相互作用的3D圖Fig. 10　Contour plot of effects of the interaction of two factors on the production of lipase

2.2.3驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)對回歸方程求導(dǎo)可以得到模型的極值點(diǎn),理論上當(dāng)誘導(dǎo)劑添加時間為3.68 h,誘導(dǎo)溫度為16.54 ℃,誘導(dǎo)時間為15.16 h時,單位酶活達(dá)到其最大響應(yīng)值,理論最大酶活為1180.38 U/mL。

為方便實(shí)驗(yàn)操作,將實(shí)驗(yàn)條件定為:誘導(dǎo)劑添加時間為3.5 h,誘導(dǎo)溫度16 ℃,誘導(dǎo)時間15 h,在該條件下進(jìn)行搖瓶發(fā)酵,實(shí)際測定的平均單位酶活為1170.56 U/mL,該值與理論值相接近,證明此響應(yīng)面模型是可靠的,可以有效優(yōu)化該基因工程菌的發(fā)酵表達(dá)條件。

3　結(jié)論

本文以單因素實(shí)驗(yàn)、Plackett-Burman和Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的方法,對影響B(tài)ohai sea-9145重組脂肪酶工程菌產(chǎn)酶的各因素進(jìn)行分析,得出的結(jié)論如下:

Bohai sea-9145重組脂肪酶工程菌的最佳發(fā)酵表達(dá)條件為：調(diào)整培養(yǎng)基的初始pH為8.0,按1.5%的接種量接種,在種子液培養(yǎng)3.5 h后加入終濃度為0.5 mmol/L的誘導(dǎo)劑IPTG,在16 ℃、200 r/min的條件下誘導(dǎo)15 h。經(jīng)過上述優(yōu)化后，該基因工程菌所產(chǎn)重組脂肪酶的酶活最高為1170.56 U/mL,是優(yōu)化前的9.72倍,該結(jié)果極大提高了Bohai sea-9145海洋重組脂肪酶的制備效率,為該酶的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

[1]宋欣.微生物酶轉(zhuǎn)化技術(shù)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2004:143.

[2]王庭,秦剛.脂肪酶及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用[J].肉類研究,2010(1):1001-8124.

[3]劉海洲,吳小飛,牛佰慧,等.脂肪酶在食品工業(yè)中的應(yīng)用與研究進(jìn)展[J].糧食加工,2008,33(5):55-57.

[4]陳代杰.微生物藥物學(xué)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2008,5:587-594.

[5]宋欣,曲音波.有機(jī)相中脂肪酶催化作用的應(yīng)用[J].微生物學(xué)通報(bào),1999,26(4):296-299.

[6]姚慶龍,高傳福.堿性脂肪酶在驢馬制革中的應(yīng)用研究[J].中國皮革,2006,35(9):4-5.

[7]王智,茍小軍,曹淑桂.脂肪酶在生物化工中的應(yīng)用[J].成都大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2003,22(1):1-7.

[8]邵鐵娟,孫謐,鄭家聲,等.Bohaisea-9145海洋低溫堿性脂肪酶研究[J].微生物學(xué)報(bào),2004,44(6):789-793.

[9]董宏偉,孫謐,王躍軍,等.海洋微生物低溫堿性脂肪酶的純化與性質(zhì)研究[J].海洋與湖沼,2004(4):376-383.

[10]李忠磊,王躍軍,盛軍,等.Bohaisea-9145海洋耶氏酵母堿性脂肪酶基因的克隆、異源表達(dá)和重組酶酶學(xué)性質(zhì)[J].海洋與湖沼,2012(2):230-236.

[11]Hatzinikolaou D G,Kourentzi E,Stamatis H,et al. A novel lipolytic activity of Rhodotorula glutinis cells:production,partial characterization and application in the synthesis of esters[J]. Journal of Bioscience and Bioengineering,1999,88(1):53-56.

[12]Gupta N,Mehra G,Gupta R. A glycerol-inducible thermostable lipase fromBacillussp.:medium optimization by a Plackett-Burman design and by response surface methodology[J].Canadian Journal of Microbiology,2004,50(5):361-368.

[13]Ariane Leites Larentis,Júlia Fabiana Monteiro Quintal Nicolau,Gabriela dos Santos Esteves,et al. Evaluation of pre-induction temperature,cell growth at induction and IPTG concentration on the expression of a leptospiral protein in E. coli using shaking flasks and microbioreactor[J]. BMC Research Notes,2014,7:671.

Optimization of fermentation and expression conditions for production of marine lipase by Bohai sea-9145

RAN Fan-jiao1,2,SUN Mi1,*,BAO Jing1,HAO Jian-hua1

(1.Key Laboratory of Sustainable Development of Marine Fisheries,Ministry of Agriculture,Qingdao Key Laboratory of Marine Enzyme Engineering,Yellow Sea Fisheries Research Institute,Chinese Academy of Fishery Sciences,Qingdao 266071,China;2.College of Food Science & Technology,Shanghai Ocean University,Shanghai 201306,China)

To effectively improve the production of the Bohai sea-9145 lipase,single factor experiment,PB experiment and BB surface response experiment were used to optimize the fermentation conditions of the recombinant strain Bohai sea-9145. The optimal conditions were as follows:the initial pH value of the medium was 8.0,the inoculation amount was 1.5%,and after 3.5 hours of incubation,the expression of the lipase was induced by adding IPTG to a final concentration of 0.5 mmol/L at 16 ℃ for 15 hours with the shaking speed of 200 r/min. After optimization,the final activity of the recombinant lipase was increased by 9.72 times.

Bohai sea-9145 recombined lipase;genetic engineering bacteria;fermentation conditions;analysis of response surface

2016-03-11

冉凡嬌(1991-)，女，碩士研究生，研究方向：食品工程， E-mail:ranfanjiao@sina.com。

孫謐(1962-)，女，研究員，研究方向：海洋產(chǎn)物資源與酶工程，E-mail:sunmi@ysfri.ac.cn。

國家自然科學(xué)基金-聯(lián)合基金項(xiàng)目(U1406402-5)；國際科技合作與交流專項(xiàng)(2014DFG30890)資助。

TS201.3

A

1002-0306(2016)16-0178-07

10.13386/j.issn1002-0306.2016.16.027