孫玉英,嚴(yán)　翠,王淑軍,張繼泉,趙　宏,趙斌元

(1.淮海工學(xué)院海洋學(xué)院,江蘇連云港 222005;2.江蘇省海洋資源開發(fā)研究院,江蘇連云港 222000;3.中國(guó)科學(xué)院海洋研究所,山東青島 266071)

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Microbacteriumsp.OU01殼聚糖酶Glu51和Asp69定點(diǎn)突變對(duì)酶活性的影響

孫玉英1,2,嚴(yán)翠1,王淑軍2,張繼泉3,趙宏2,趙斌元2

(1.淮海工學(xué)院海洋學(xué)院,江蘇連云港 222005;2.江蘇省海洋資源開發(fā)研究院,江蘇連云港 222000;3.中國(guó)科學(xué)院海洋研究所,山東青島 266071)

為確定Microbacteriumsp.OU01殼聚糖酶特定氨基酸與酶活性間的關(guān)系,以含殼聚糖酶基因的pCT7-CHISP6H-mMschito質(zhì)粒為模板,利用反向PCR的方法對(duì)殼聚糖酶兩個(gè)可能的酶活性位點(diǎn)Glu51(突變成Gln51)和Asp69(突變成Asn69)進(jìn)行突變,從而構(gòu)建了兩個(gè)單位點(diǎn)突變,突變質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化至EscherichiacoliBL21(DE3)并經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá),測(cè)定突變前后酶的比活性,突變酶(Asp69→Asn69)比活力與野生型相比幾乎不變,而突變酶(Glu51→Gln51)比活力大約為野生型的10%。通過(guò)測(cè)定動(dòng)力學(xué)常數(shù)發(fā)現(xiàn),突變酶和天然酶Km幾乎沒(méi)有很明顯的變化,但是突變酶(Glu51→Gln51)的Vmax與上述兩種酶的Vmax相比有很明顯的變化。采用DNA Star和Deep view分析軟件,預(yù)測(cè)突變前后殼聚糖酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu),結(jié)果表明,Microbacteriumsp. OU01殼聚糖酶Glu51極有可能是維持酶的催化活力的必需氨基酸,它的突變可能導(dǎo)致酶蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)組件及氫鍵網(wǎng)絡(luò)的改變,從而導(dǎo)致酶活力的喪失。

殼聚糖酶,定點(diǎn)突變,比活力,必需氨基酸

殼寡糖是殼聚糖進(jìn)一步降解形成的產(chǎn)物,具有較低的分子量,呈水溶性,容易被機(jī)體吸收,作為一種功能性低聚糖,具有抗菌、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫、抗腫瘤及促進(jìn)農(nóng)作物增產(chǎn)等功效,在醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域中具有廣泛的應(yīng)用前景[1],是近幾年糖類研究和應(yīng)用開發(fā)的熱點(diǎn)之一。目前制備殼寡糖的方法主要有化學(xué)降解法和酶解法。利用殼聚糖酶降解殼聚糖制備殼寡糖具有專一性強(qiáng),反應(yīng)條件溫和,寡糖得率高,不造成環(huán)境污染等優(yōu)點(diǎn),是制備殼寡糖的首選方法。目前關(guān)于殼聚糖酶高產(chǎn)菌株的篩選,酶的分離純化與酶學(xué)特征,以及利用基因工程菌異源表達(dá)殼聚糖酶的研究比較多[2-11],關(guān)于殼聚糖酶的結(jié)構(gòu)和功能方面的研究主要集中在鏈霉菌(Streptomycessp.)[12]、腐皮鐮刀菌(Fusariumsolani)[13]、桿菌(Bacillussp.)[12]、松江殼聚糖降解菌(Mitsuariachitosanitabida)[14]、類芽孢桿菌[15-16]和曲霉菌(Aspergillussp.)[17]等所產(chǎn)的殼聚糖酶,其中鏈霉菌(Streptomycessp. N174)的研究更加詳細(xì)。

在前期研究中,已從自然界中分離到一株殼聚糖酶活性較高的微桿菌(Microbacteriumsp. OU01),克隆了該殼聚糖酶的全長(zhǎng)基因序列(序列注冊(cè)號(hào):EF159153),并在大腸桿菌中成功實(shí)現(xiàn)了其重組表達(dá),并獲得了具有生物學(xué)活性的重組殼聚糖酶[18]。本文在前期的基礎(chǔ)上,利用反向聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)的方法對(duì)殼聚糖酶兩個(gè)可能的酶活性位點(diǎn)Glu51(突變成Gln51)和Asp69(突變成Asn69)分別進(jìn)行突變,通過(guò)測(cè)定動(dòng)力學(xué)常數(shù)和結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的方法,初步研究了殼聚糖酶的結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系,探討微桿菌(Microbacteriumsp. OU01)殼聚糖酶的酶活作用機(jī)制,為殼聚糖酶的分子設(shè)計(jì)和改造提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

菌種與宿主菌微桿菌(Microbacteriumsp.OU01)殼聚糖酶基因保存在pCT7-CHISP6H-mMschito(見圖1)質(zhì)粒上,由中國(guó)科學(xué)院海洋研究所動(dòng)物生殖與遺傳工程課題組保存?？寺∷拗鱁scherichiacoli(E.coli)TOP10F’,表達(dá)宿主E.coliBL21(DE3);LB培養(yǎng)基酵母提取物5 g/L、胰蛋白胨10 g/L、NaCl 10 g/L,用NaOH 調(diào)pH至7.0;氨芐西林(Ampicillin,Amp)/LB培養(yǎng)基含有100 μg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基;酵母提取物、胰蛋白胨英國(guó)Oxiod公司;殼聚糖浙江澳興生物科技有限公司;高保真PrimeSTAR? HS DNA聚合酶、異丙基-β-D-乳糖苷(isopropylthio-β-D-galactoside,IPTG)日本Takara公司;質(zhì)粒提取試劑盒上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司;其他試劑國(guó)產(chǎn)分析純。

170-6701 PCR儀美國(guó)伯樂(lè)公司;FLUOSTAR OMEGA全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀德國(guó)BMG LABTECH公司。

圖1　質(zhì)粒pCT7-CHISP6H-mMschito的特征Fig.1　Characterization of the plasmidpCT7-CHISP6H-mMschito注:T7啟動(dòng)子:堿基20～36;T7啟動(dòng)子引物位點(diǎn):堿基20～39;核糖體結(jié)合位點(diǎn):堿基87～90;起始ATG:堿基100～102;信號(hào)肽區(qū)域:堿基100～177;多聚組氨酸(6xHis)區(qū)域:堿基178～195;目標(biāo)基因(mMschito)區(qū)域:堿基196～925;T7反向引物區(qū)域:堿基982～1001;T7轉(zhuǎn)錄終止區(qū)域:堿基944～1073;f1起始區(qū)域:堿基1144～1599;青霉素抗性基因:堿基1730～2590;pUC起始區(qū):堿基2735～3408。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1PCR引物設(shè)計(jì)及突變體構(gòu)建利用軟件Primer Premier 5.0,根據(jù)已克隆的Microbacteriumsp. OU01殼聚糖酶基因序列設(shè)計(jì)引物[18]。以pCT7-CHISP6H-mMschito質(zhì)粒為模板進(jìn)行反向PCR擴(kuò)增目標(biāo)產(chǎn)物。

突變子1(MUT1):Glu51-Gln51,將位點(diǎn)GAG突變成CAG,引物設(shè)計(jì)如下:

MUT1-F:CAGAACTCATCGACGGACT(5′磷酸化)

MUT1-R:GAAGCTGGACACGAGCGAC(5′磷酸化)

突變子2(MUT2):Asp69-Asn69,將位點(diǎn)GAC突變成AAC,引物設(shè)計(jì)如下:

MUT2-F:AACGGCCGAGGGTACACCG(5′磷酸化)

MUT2-R:TGCGATGTCCTCAAGGTAG(5′磷酸化)

以MUT1-F/MUT1-R為引物對(duì),以質(zhì)粒pCT7-CHISP6H-mMschito為模板,利用高保真PrimeSTAR? HS DNA聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增。

PCR反應(yīng)體系為50 μL,如下:

5×PrimeSTAR buffer 10 μL;三磷酸脫氧核糖核苷酸(deoxy-ribonucleoside triphosphate,dNTPs)(10 mmol/L)1 μL;MUT1-F(10 μmol/L)1 μL;MUT1-R(10 μmol/L)1 μL;PrimeSTAR? HS DNA聚合酶0.5 μL;質(zhì)粒pCT7-CHISP6H-mMschito(100 ng/μL)1 μL;ddH2O 35.5 μL。

PCR擴(kuò)增程序:94 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸3 min,共30個(gè)循環(huán);最后72 ℃延伸10 min。

同理,突變子2(MUT2)的構(gòu)建(Asp69-Asn69)僅僅將引物對(duì)由MUT1-F/MUT1-R換成MUT2-F/MUT2-R,其余條件均不變。

利用1%的瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳,切膠回收與預(yù)測(cè)大小一致的片段,片段大小約為3.5 kb,擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收后,在T4 DNA連接酶的作用下自連,轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞TOP10F’,涂布含有100 μg/mL氨芐青霉素的LB固體平板,37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜,以T7-F/T7-ter為引物對(duì),利用PCR方法對(duì)LB平板上的單克隆進(jìn)行檢測(cè),將PCR檢測(cè)陽(yáng)性克隆搖菌后進(jìn)行DNA測(cè)序,由此篩選到構(gòu)建的突變體MUT1和MUT2,分別命名為pCT7-CHISP6H-mschito-MUT1和pCT7-CHISP6H-mschito-MUT2。

1.2.2質(zhì)粒的提取將含質(zhì)粒pCT7-CHISP6H-mMschito及構(gòu)建的突變體(測(cè)序正確)的E.coliTOP10F’按照1%接種量接種于LB/Amp培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600為0.6～0.8,按照說(shuō)明書提取質(zhì)粒。

1.2.3Microbacteriumsp.OU01殼聚糖酶的誘導(dǎo)表達(dá)和純化將上述提取的重組表達(dá)質(zhì)粒(pCT7-CHISP6H-mMschito、-MUT1和-MUT2)分別轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中,轉(zhuǎn)化產(chǎn)物接種于LB/Amp液體培養(yǎng)基中37 ℃搖床中培養(yǎng),測(cè)定OD600值到0.6～0.8之間,加入IPTG,使其終濃度為1 mmol/L,誘導(dǎo)表達(dá)6 h。然后8000×g離心5 min,收集上清液作為粗酶液。粗酶液用Ni金屬親和層析柱純化。

1.2.4殼聚糖酶的酶活力測(cè)定參見文獻(xiàn)[6]。

1.2.5酶的Km和Vmax的測(cè)定用0.2 mol/L pH5.6的HAc-NaAc緩沖液配制不同的底物殼聚糖溶液并使其倒數(shù)1/[S]成等差級(jí)數(shù),依次為10～500 mg/mL的殼聚糖溶液,將殼聚糖酶和突變酶分別與不同濃度的殼聚糖溶液在45 ℃、pH5.6下測(cè)定酶活力。采用雙倒數(shù)作圖法(Lineweaver-Burk)來(lái)測(cè)定殼聚糖酶和突變酶的Km和Vmax。即以殼聚糖溶液的濃度的倒數(shù)1/[S]為橫坐標(biāo),反應(yīng)速度的倒數(shù)1/V為縱坐標(biāo)作圖,繪出直線并外推至與橫坐標(biāo)相交,在橫坐標(biāo)的截距為-1/Km,在縱坐標(biāo)的截距為1/Vmax。

2　結(jié)果與分析

2.1突變質(zhì)粒的構(gòu)建

利用反向PCR的方法分別構(gòu)建了兩個(gè)突變體,突變位點(diǎn)分別為Glu51-Gln51和Asp69-Asn69。由圖2可以看出,在突變體MUT1中,編碼第51個(gè)氨基酸的三連體密碼子由GAG(編碼谷氨酸)變成CAG(編碼谷氨酰胺);在突變體MUT2中,編碼第69個(gè)氨基酸的三連體密碼子由GAC(編碼天冬氨酸)變成AAC(編碼天冬酰胺),兩個(gè)突變體的構(gòu)建正確。

圖2　原始質(zhì)粒及及突變體部分測(cè)序結(jié)果Fig.2　Partial sequence of the primary plasmidand the mutant plasmids注:CHI代表非突變體;MUT-1表示編碼第51個(gè)氨基酸的密碼子由GAG突變成CAG;MUT-2表示編碼第69個(gè)氨基酸的密碼子由GAC突變成AAC。

2.2殼聚糖酶的活性測(cè)定

將構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒(pCT7-CHISP6H-mMschito)及其突變體(pCT7-CHISP6H-mschito-MUT1和pCT7-CHISP6H-mschito-MUT2)分別轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3),誘導(dǎo)表達(dá)并利用親和層析分離純化后,由圖3可以看出,酶蛋白被吸附在親和層析柱上后,進(jìn)行線性梯度洗脫,隨著洗脫液中咪唑濃度的逐漸升高,洗脫下來(lái)的目的蛋白濃度逐漸升高。分析誘導(dǎo)后所產(chǎn)殼聚糖酶的比活力,結(jié)果發(fā)現(xiàn);突變體MUT2與未突變的酶活力大致相等(1543 U/mg和1498 U/mg),而突變體MUT1所產(chǎn)殼聚糖酶活力僅為147 U/mg,大約為未突變酶活力的10%,初步說(shuō)明Glu51極有可能是維持該殼聚糖酶的催化活力的必需氨基酸。

圖3　SDS-PAGE分析來(lái)自Microbacterium sp. OU01的重組酶Fig.3　SDS-PAGE analysis of recombinant chitosanasefrom Microbacterium sp. OU01.注:M:蛋白markers;1:IPTG誘導(dǎo)前的懸浮液;2:IPTG誘導(dǎo)4 h后的懸浮液;3～7:不同濃度的咪唑洗脫親和層析純化重組殼聚糖酶。

2.3酶的Km和Vmax測(cè)定

天然酶和突變酶的表觀米氏常數(shù)Km和Vmax值如表1所示。通過(guò)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,可以發(fā)現(xiàn)兩種突變酶與自然酶的表觀米氏常數(shù)Km值差異不顯著(p>0.05);突變體MUT1殼聚糖酶Vmax值與自然酶差異極其顯著(p<0.01),而突變體MUT2殼聚糖酶Vmax值與自然酶差異不顯著(p>0.05)。上述比較說(shuō)明殼聚糖酶Glu51極有可能是維持酶催化活力的必需氨基酸,它的突變導(dǎo)致Vmax的急劇降低,從而導(dǎo)致酶活力的喪失。而Asp69的突變使酶的動(dòng)力學(xué)常數(shù)Km和Vmax幾乎沒(méi)有很明顯的變化,所以Asp69可能跟酶的活力沒(méi)有直接關(guān)系。

表1　天然酶和突變酶的Km和Vmax

2.4突變前后殼聚糖酶二級(jí)結(jié)構(gòu)的比較

利用DNAStar軟件,通過(guò)Garnier-Robson法計(jì)算特定氨基酸在特定結(jié)構(gòu)內(nèi)部的可能性來(lái)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)分子中的α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角以及無(wú)規(guī)則卷曲等二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)域[19]。如圖4所示,殼聚糖酶Glu51突變成Gln51,α螺旋數(shù)目減少一個(gè),β-轉(zhuǎn)角的數(shù)目沒(méi)有變化,但在約50～60氨基酸處β-轉(zhuǎn)角的長(zhǎng)度明顯發(fā)生了變化,β-無(wú)規(guī)則卷曲在約50～60氨基酸處減少一個(gè),但是其長(zhǎng)度明顯發(fā)生了變化。殼聚糖酶Asp69突變成Asn69,α螺旋數(shù)目增加一個(gè),β-折疊的數(shù)目減少兩個(gè),β-無(wú)規(guī)則卷曲數(shù)目減少一個(gè)。

圖4　Microbacterium sp.OU01殼聚糖酶二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)Fig.4　Prediction of secondary structure of Microbacterium sp.OU01 chitosanase注:A:α-螺旋;B:β-折疊;T:β-轉(zhuǎn)角;C:β-無(wú)規(guī)則卷曲;a:突變前Microbacterium sp.OU01殼聚糖酶二級(jí)結(jié)構(gòu);b:突變后Microbacterium sp.OU01殼聚糖酶(Glu51-Gln51)二級(jí)結(jié)構(gòu);c:突變后Microbacterium sp.OU01殼聚糖酶(Asp69-Asn69)二級(jí)結(jié)構(gòu)。

2.5突變前后三級(jí)結(jié)構(gòu)的比較

通過(guò)Swiss-model構(gòu)建Microbacteriumsp.OU01殼聚糖酶突變前后的立體結(jié)構(gòu),結(jié)果發(fā)現(xiàn)突變前后殼聚糖酶的整體三維結(jié)構(gòu)基本一致,Gln51和Asn69都位于酶分子表面β-轉(zhuǎn)角上。利用DeepView軟件分析51和69位點(diǎn)突變前后氫鍵的變化(圖5),由于51位點(diǎn)的Glu變?yōu)镚ln,氫鍵的數(shù)目由4個(gè)變?yōu)?個(gè),而且與之形成氫鍵的氨基酸種類及氫鍵距離大部分都發(fā)生了改變。突變前,Glu51與Val47(鍵間距離為2.83 A)、Arg234(2.93 A和2.98 A)、Ser48(3.35 A)形成氫鍵;突變后,51Gln分別與Ser47(2.83 A)、Ser48(3.35 A)和Asn52(2.60 A)形成氫鍵。由于69位點(diǎn)的Asp變?yōu)锳sn,氫鍵由3個(gè)變?yōu)?個(gè),且與之形成氫鍵的氨基酸種類及氫鍵距離均發(fā)生了改變。突變前,Asp69與Gly70(鍵間距離為3.25 A)、Arg71(2.92 A和3.16 A)形成氫鍵;突變后,69Asn僅僅與Arg71(鍵間距離為2.79 A)形成氫鍵。

圖5　Microbacterium sp.OU01殼聚糖酶三級(jí)結(jié)構(gòu)突變前后放大圖Fig.5　Tertiary structures of Microbacterium sp.OU01chitosanase with and without mutation

3　討論

目前,部分微生物產(chǎn)殼聚糖酶的空間結(jié)構(gòu)已經(jīng)獲得了解析,截至2016年1月13日,在Protein Data Bank(PDB)中公布的殼聚糖酶(chitosanase)結(jié)構(gòu)有7個(gè)(1CHK、1QGI、1V5C、1V5D、2D05、4ILY和4OLT)。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn):其中1V5C和1V5D,1QGI和2D05系重復(fù)結(jié)構(gòu)。因此,在PDB數(shù)據(jù)庫(kù)中公布的chitosanase空間結(jié)構(gòu)實(shí)際上應(yīng)該是5個(gè)。為了深入研究殼聚糖酶結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系,開展催化機(jī)理、底物特異性和穩(wěn)定性等方面研究,定點(diǎn)突變技術(shù)被應(yīng)用于殼聚糖酶的研究中。論文作者前期獲得的Microbacteriumsp. OU01殼聚糖酶基因編碼氨基酸序列與已經(jīng)公布空間結(jié)構(gòu)(1CHK)Streptomyces N174的殼聚糖酶序列具有62%相似性。

Fukamizo等對(duì)StreptomycesN174殼聚糖酶結(jié)構(gòu)和功能研究發(fā)現(xiàn),對(duì)Glu-22和Asp-40這兩個(gè)催化中心殘基的任何一個(gè)進(jìn)行功能保守上的氨基酸取代,會(huì)導(dǎo)致酶的活力降低到小于1%[20]。根據(jù)晶體結(jié)構(gòu)和定點(diǎn)突變結(jié)果,可以推斷Glu22是質(zhì)子供體而Asp40活化水分子,攻擊催化位點(diǎn)附近的糖殘基上的C-1原子。Mitsuariachitosanotabidus3001殼聚糖酶的保守氨基酸Glu121和Glu141是催化的活性氨基酸殘基,M.chitosanotabidus[21]殼聚糖酶的兩個(gè)必需谷氨酸(Glu-121和Glu-141)被天冬氨酸取代后,酶活力不足野生型活力的0.2%。這些結(jié)果說(shuō)明,在細(xì)菌殼聚糖酶中,與底物相關(guān)的羧酸基團(tuán)位置對(duì)于催化活力來(lái)說(shuō)是極其重要的。為探索Microbacteriumsp. OU01殼聚糖酶的活力中心,論文作者比對(duì)了GH46家族的殼聚糖酶氨基酸序列,發(fā)現(xiàn)Glu51和Asp69在所有已報(bào)道殼聚糖酶的氨基酸序列中是保守的。因此本文通過(guò)反向PCR法,置換了對(duì)應(yīng)的兩個(gè)氨基酸(Glu51→Gln51,Asp69→Asn69),結(jié)果發(fā)現(xiàn)突變Glu51后殼聚糖酶的比活力很明顯地受到影響,通過(guò)測(cè)定突變酶的動(dòng)力學(xué)常數(shù)Km和Vmax,初步說(shuō)明Glu51是酶的活性中心必需基團(tuán),而Asp69對(duì)酶的活力影響不大,這與同為GH46家族的StreptomycesN174殼聚糖酶是不同的。

由實(shí)驗(yàn)得到Microbacteriumsp. OU01殼聚糖酶的結(jié)構(gòu)還未見報(bào)道,突變效應(yīng)的分析在一定程度上受到了制約,通過(guò)模型模擬的方法預(yù)測(cè)該酶分子結(jié)構(gòu)將有助于對(duì)該酶分子結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的理解,從而實(shí)現(xiàn)對(duì)酶分子的結(jié)構(gòu)改造。Microbacteriumsp.OU01所產(chǎn)殼聚糖酶Glu51定點(diǎn)突變后只保持初始生物活性的10%,突變后氨基酸的種類、氨基酸殘基之間形成的氫鍵網(wǎng)絡(luò)和氫鍵之間的距離、二級(jí)結(jié)構(gòu)組件的含量與長(zhǎng)度等多個(gè)因素都發(fā)生了改變,有可能對(duì)酶折疊構(gòu)象所對(duì)應(yīng)的自由能產(chǎn)生影響,從而改變酶的生物活性[22]。

運(yùn)用定點(diǎn)突變法,向殼聚糖酶的基因中引入突變堿基之后,發(fā)現(xiàn)Glu51是維持催化活力的必需氨基酸。這對(duì)于進(jìn)一步在分子水平上研究該殼聚糖酶的分子結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制以及進(jìn)行改造奠定了基礎(chǔ),對(duì)于獲得比天然酶活力更高、穩(wěn)定性更好的工業(yè)用酶具有重要的應(yīng)用價(jià)值。更進(jìn)一步的確定酶的催化作用機(jī)制,需要制備Microbacteriumsp.OU01殼聚糖酶的晶體結(jié)構(gòu),進(jìn)一步研究該酶的結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系。

4　結(jié)論

本文以含殼聚糖酶基因的pCT7-CHISP6H-mMschito質(zhì)粒為模板,利用反向PCR的方法對(duì)殼聚糖酶兩個(gè)可能的酶活性位點(diǎn)Glu51(突變成Gln51)和Asp69(突變成Asn69)進(jìn)行突變,構(gòu)建了兩個(gè)點(diǎn)突變,突變質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)并經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá),測(cè)定突變前后酶的比活性,突變酶(Asp69→Asn69)比活力與野生型相比幾乎不變,而突變酶(Glu51→Gln51)比活力大約為野生型的10%;通過(guò)測(cè)定動(dòng)力學(xué)常數(shù)發(fā)現(xiàn),突變酶和天然酶Km幾乎沒(méi)有很明顯的變化,但是突變酶(Glu51→Gln51)的Vmax與上述兩種酶的Vmax相比有很明顯變化。采用DNAStar和Deepview分析軟件,預(yù)測(cè)突變前后殼聚糖酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu),結(jié)果表明,Microbacteriumsp. OU01殼聚糖酶Glu51極有可能維持酶的催化活力的必需氨基酸,它的突變可能導(dǎo)致酶蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)組件及氫鍵網(wǎng)絡(luò)的改變,從而導(dǎo)致酶活力的喪失。

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Effect of site-directed mutagenesis of Glu51 and Asp69 on activity ofMicrobacteriumsp.OU01chitosanase

SUN Yu-ying1,2,YAN Cui1,WANG Shu-jun2,ZHANG Ji-quan3,ZHAO Hong2,ZHAO Bin-yuan2

(1.College of Marine Science,Huaihai Institute of Technology,Lianyungang 222005,China；2.Jiangsu Institute of Marine Resources,Lianyungang 222000,China;3.Institute of Oceanology,Chinese Academy of Sciences,Qingdao 266071,China)

In order to determine the relationship between amino acid residues at the special site and specific activity ofMicrobacteriumsp.OU01 chitosanase,pCT7-CHISP6H-mMschito plasmid was used as a template for the site-directed mutagenesis from Asp69 to Asn69 and Glu51 to Gln51. The specific activity of chitosanase with and without mutation was measured. Mutation of Glu51 into Gln51 resulted in a drastic loss of specific activity. Through the determination of kinetic constants of enzyme,it was found that the mutant enzyme hadalmostthe same Kmvalue as the native enzyme,but the Vmaxvalue from the mutant enzyme(Glu51→Gln51)varied obviously compared with that of the native enzyme. According to the difference between per-mutant and mutant cDNA sequences,the secondary structure and three-dimensional structure of chitosanase were also predicted using DNA Star and Deep view analysis software. The results showed that the amino acid Glu51 was critical significant for maintaining the activity of chitosanase fromMicrobacteriumsp. OU01. The site-directed mutagenesis ofMicrobacteriumsp. OU01 chitosanase at position 51 changed the properties of secondary structure as well as hydrogen-bonding networks,thus probably resulting in the loss of specific activity.

chitosanase;site-directed mutagenesis;specific activity;essential amino acid

2015-12-29

孫玉英(1974-)，女，博士，副教授，研究方向：微生物酶工程，E-mail：sunyuying125@163.com。

碳谷-江蘇海資院海洋先進(jìn)材料聯(lián)合研究中心開放課題(TG-201402)；江蘇省科技項(xiàng)目產(chǎn)學(xué)研聯(lián)合創(chuàng)新資金——前瞻性聯(lián)合研究項(xiàng)目(BY2014085)；連云港市中小企業(yè)技術(shù)創(chuàng)新項(xiàng)目(CK1419)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)16-0167-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.16.025