丁　盼,劉金娟,周小琪,薛羚偉,孫　勇,蔣繼宏

(江蘇師范大學生命科學學院,江蘇省藥用植物生物技術重點實驗室,江蘇徐州 221116)

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酸漿五種部位醇提物的活性比較研究

丁盼,劉金娟,周小琪,薛羚偉,孫勇,蔣繼宏*

(江蘇師范大學生命科學學院,江蘇省藥用植物生物技術重點實驗室,江蘇徐州 221116)

目的:探討酸漿根、莖、葉、宿萼和漿果醇提物的抑菌、抗氧化、抗腫瘤和抑炎活性。方法:采用牛津杯法檢測酸漿五種部位醇提物對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的抑菌活性;DPPH清除法檢測其抗氧化活性;Alamar Blue法檢測其對人乳腺癌細胞株MCF-7、MDA-MB-231和肝癌細胞株Bel7402的抑制效果;一氧化氮檢測試劑盒測定其抗炎活性。結果:漿果對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌效果最好,葉對枯草芽胞桿菌抑菌活性較明顯,抑菌圈分別為(16.63±0.49)、(14.97±0.37)、(15.83±0.29) mm。宿萼的抗氧化活性最高,濃度為5 mg/mL時對DPPH的清除率為96.79%±2.09%,基本和同劑量的VC效果相當。酸漿各部位醇提物對腫瘤細胞的抑制作用呈現(xiàn)濃度依賴性,其中根對MCF-7的抑制活性較強,宿萼對MDA-MB-231和Bel7402的活性較強,IC50分別為(31.46±1.49)、(48.84±1.69)、(65.48±1.82) μg/mL。葉的抗炎效果最佳,莖抗炎效果較弱,10 μg/mL時NO產生量分別為11.01、27.73 μmol/L。結論:酸漿具有一定的抑菌、抗氧化、抗腫瘤和抗炎活性,為酸漿的功能開發(fā)及活性成分分離提供一定的理論依據(jù)。

酸漿,抑菌活性,抗氧化活性,抗腫瘤活性,抗炎活性

酸漿(PhysalisalkekengiL.)又名紅菇娘、掛金燈等,為茄科(Solanaceae)酸漿屬(Physalis)多年生草本植物。其適應性很強,耐寒、耐熱,喜涼爽濕潤氣候,遍布大江南北,東北地區(qū)產品質量較好。因其具有清熱、解毒、利尿、降壓、強心、抑菌等作用,可藥食兩用[1],備受廣大研究者的關注。

酸漿中主要含有苦素類、皂苷類和黃酮類等生物活性物質[2-5],具有廣泛的生物學功能。Li X[6]等發(fā)現(xiàn)酸漿苦素對大腸桿菌具有較強的抑制作用。Laczko-ZoldE[7]等利用DPPH法探究酸漿的干果和濕果抗氧化活性差別較大。He Hao、Wu SJ[8-9]等分別研究了酸漿苦素A和酸漿提取物誘導腫瘤細胞的凋亡作用。Ji L等[10]和Kwak CS[11]探討酸漿提取物對促炎因子等產生的影響,發(fā)現(xiàn)具有明顯的抗炎作用。酸漿以漿果供食用,然而其非可食部位(根、莖、葉和宿萼)利用率相對較低,有關酸漿不同部位的活性比較尚未見報道。本研究以酸漿根、莖、葉、宿萼和漿果為研究對象,比較其醇提物的抑菌、抗氧化、體外抗腫瘤和抗炎活性,篩選出其主要活性部位,為酸漿的進一步基礎研究與功能開發(fā)提供理論基礎和科學依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

酸漿采自東北黑龍江,經專業(yè)人士鑒定為茄科酸漿屬酸漿(PhysalisalkekengiL.);金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大腸桿菌(Escherichiacoli)和枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)購自徐州防疫站;人乳腺癌細胞株MCF-7、MDA-MB-231、肝癌細胞株Bel7402和小鼠單核巨噬細胞RAW264.7購自上海中科院細胞庫;Alamar Blue美國Sigma公司;青霉素、鏈霉素和胰蛋白酶等南京生興生物技術有限公司;胎牛血清北京全式金生物技術有限公司;DMEM和RPMI 1640培養(yǎng)基美國Gibco公司;一氧化氮檢測試劑盒碧云天生物技術研究所;DMSO及其余試劑為國產分析純。

KQ-500TDE高頻數(shù)控超聲清洗器昆山市超聲儀器有限公司;RE-52A旋轉蒸發(fā)儀上海亞容生化儀器廠;Forma Series II二氧化碳細胞培養(yǎng)箱美國Thermo公司;96孔細胞培養(yǎng)板美國Gibco公司;Synergy2多功能酶標儀美國BioTek。

1.2實驗方法

1.2.1酸漿各部位醇提物制備挑選無蟲蝕、果實成熟的酸漿全株,根、莖、葉、宿萼和漿果經干燥粉碎后,分別準確稱取48 g,置于500 mL錐形瓶中。加入95%乙醇,超聲提取30 min,4000 r/min離心20 min,取出上清液。重復3次,合并上清液后減壓濃縮得干燥浸膏分別為2.4、2.7、3.6、3.2、4.1 g,密閉冷藏,備用[12-13]。

1.2.2抑制病原細菌實驗采用牛津杯法[14],每平板倒入20 mL的LB培養(yǎng)基,凝固后,用移液槍取金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和枯草芽胞桿菌的菌液各200 μL均勻涂布于培養(yǎng)基上,涂布后以平板無可見水滴為準。將根、莖、葉、宿萼和漿果醇提物用丙酮制成40 mg/mL的受測液,分別加入牛津杯中。每個平板中放2個牛津杯,各加入同一藥液200 μL,同時以200 μL的丙酮作為陰性對照,200 μL的1 mg/mL青霉素作為陽性對照,每組設3個重復。將平板置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。觀察有無抑菌作用,游標卡尺測量抑菌圈大小,比較抑菌效果[15]。實驗重復3次。

1.2.3抗氧化活性實驗DPPH自由基清除法是一種重要的檢測天然植物提取物或化合物抗氧化活性的方法,其結構簡單、性質穩(wěn)定、反應容易控制,是未來抗氧化劑自由基清除活性篩選的首選方法[16]。本實驗采用DPPH法將根、莖、葉、宿萼和漿果的醇提取物用50%乙醇配成8、40、200、1000、5000 μg/mL不同濃度的受測液備用,每個濃度設3個復孔,517 nm處測各孔的吸光度。100 μL DPPH溶液+100 μL受測液吸光度(A0),100 μL DPPH溶液+100 μL 50%乙醇溶液的吸光度(A1),100 μL受測液+100 μL 50%乙醇溶液的吸光度(A2)。選用抗壞血酸(VC)作為陽性對照。按式(1)計算DPPH自由基清除率。實驗重復3次。

式(1)

1.2.4細胞培養(yǎng)與體外抗腫瘤細胞活性實驗采用Alamar Blue法檢測酸漿醇提物體外抗腫瘤細胞活性[17]。人乳腺癌細胞株MCF-7、MDA-MB-231和肝癌細胞株Bel7402用含10%胎牛血清的培養(yǎng)液于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的細胞制成細胞懸液,用血球計數(shù)板調整濃度約為5×104個/mL。實驗分為陽性對照組和酸漿實驗組。向96孔細胞培養(yǎng)板中每孔加100 μL細胞懸液,置于細胞培養(yǎng)箱中過夜,使細胞完全貼壁生長。

24 h后加藥,實驗組加入100 μL不同濃度(12.5、25、50、100、200、400 μg/mL)酸漿樣品,以5-氟尿嘧啶(5-FU,1.25、2.5、5、10、20、40 μg/mL)作為陽性對照,每個濃度設3個復孔。培養(yǎng)48 h后,棄去培養(yǎng)液,用PBS輕輕洗滌兩次。Alamar Blue貯存液用RPMI1640培養(yǎng)液以1∶10比例稀釋,每孔加200 μL,培養(yǎng)箱中孵育4 h后將96孔培養(yǎng)板放于530 nm的激發(fā)波長和590 nm的發(fā)射波長檢測熒光值。按式(2)計算細胞增殖抑制率,由此轉換成IC50。不同部位樣品抑制腫瘤細胞增殖活性以IC50衡量,IC50值為抑制率50%時的藥物濃度。實驗重復3次。

式(2)

式中:F代表陰性對照組的熒光值;F0代表樣品組的熒光值;F1代表空白組的熒光值。

1.2.5抗炎活性實驗采用AlamarBlue法檢測酸漿各提取物對小鼠單核巨噬細胞RAW264.7的毒力作用,選擇酸漿樣品的合適濃度范圍,以便進行后續(xù)的抗炎實驗。確定合適的濃度,取形態(tài)均勻狀態(tài)良好的RAW264.7細胞,胰酶消化后以5×104個/mL接種于96孔培養(yǎng)板,過夜培養(yǎng)使細胞完全貼壁。實驗分為空白組、陽性對照組(LPS組)和4個濃度的酸漿實驗組。實驗組濃度分別為1、2、5、10 μg/mL,空白組和LPS組則給以相同的DMEM培養(yǎng)基,每個濃度設3個復孔。培養(yǎng)2 h后,空白組加入DMEM培養(yǎng)基,LPS組和實驗組加1 μg/mL的LPS繼續(xù)培養(yǎng)24 h。取細胞培養(yǎng)上清液用于NO檢測。具體參照說明書進行。實驗重復3次。

表1　酸漿五個部位乙醇提取物的抑菌活性±s)

2　結果與分析

2.1酸漿醇提物抑菌活性的對比分析

由表1抑菌結果表明,酸漿根、莖、葉、宿萼和漿果醇提物對不同的菌種表現(xiàn)出不同程度的抑制作用。漿果對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑制效果最強,葉對有枯草芽胞桿菌的抑制效果明顯,抑菌圈分別為(16.63±0.49)、(14.97±0.37)、(15.83±0.29) mm。而莖對指示菌的抑制作用較弱。陰性對照丙酮對指示菌株的抑制作用不明顯,青霉素作為陽性對照效果良好,表明實驗結果較為可信。初步推測,酸漿的漿果對常見病原細菌有較好的抑制效果,而葉作為非可食用部位也值得進一步研究。

2.2酸漿醇提物的抗氧化活性

抗氧化研究發(fā)現(xiàn),酸漿五個部位醇提物活性呈現(xiàn)出良好的濃度依賴性,其中宿萼的抗氧化活性最高,這與Helvaci S等[18]研究發(fā)現(xiàn)宿萼具有較高的抗氧化活性結果相似。檢測顯示5 mg/mL的宿萼對DPPH·的清除率為96.79%±2.09%,基本和同劑量的VC效果相當,這可能與宿萼中的抗壞血酸和黃酮類化合物等抗氧化物質的含量較多有關[19],初步表明宿萼的抗氧化活性值得進一步探究。其次為葉、根和莖,果漿的抗氧化能力相對較弱(圖1)?？箟难?VC)作為陽性對照效果良好。

圖1　酸漿五個部位乙醇提取物的DPPH自由基清除活性比較Fig.1　Comparison of scavenging activity of ethanol extractsfrom five parts of P. alkekengi L. on DPPH free radicals

2.3酸漿醇提物對腫瘤細胞的影響

由表2可知,以抗腫瘤藥物5-FU作為陽性對照,其IC50顯示出抗腫瘤效果明顯,實驗較為可靠。酸漿醇提物對人乳腺癌細胞MCF-7,MDA-MB-231和肝癌細胞株Bel7402有一定的抑制作用,且呈現(xiàn)出良好的濃度依賴性。其中,根和葉對乳腺癌細胞株MCF-7的抑制活性較強,宿萼對乳腺癌細胞株MDA-MB-231抑制較明顯,宿萼對肝癌細胞株Bel7402的活性較佳,IC50分別為(31.46±1.49)、(35.24±1.55)、(48.84±1.69)、(65.48±1.82) μg/mL。初步提示酸漿的根、宿萼和葉可能會達到預防和治療腫瘤的效果,為今后酸漿的功能開發(fā)提供實驗思路。

表2　酸漿五個部位乙醇提取物的抗腫瘤活性(μg/mL)

2.4酸漿醇提物對炎癥細胞RAW264.7的影響

通過Alamar Blue法分析,濃度范圍不高于20 μg/mL的酸漿實驗組是沒有細胞毒性的。RAW264.7細胞經LPS處理形成炎癥細胞模型,通過Griess反應測定細胞培養(yǎng)上清中的亞硝酸鹽含量,間接地表現(xiàn)酸漿對LPS刺激的RAW264.7細胞NO產生的影響。

如圖2所示,陰性對照組的正常細胞NO產生較少,為10.89 μmol/L。RAW264.7細胞經過LPS處理過后NO產生量迅速升高為54.58 μmol/L,但經過1、2、5、10 μg/mL酸漿預處理后,NO的產生明顯降低。Kang H等[20]驗證了酸漿的甲醇提取物和氯仿分餾得到的提取物具有抗炎活性,本研究不僅探討出酸漿可能具有抗炎活性,而且表現(xiàn)出一定的濃度梯度依賴性和活性部位的差異性。葉的效果最佳,莖效果最弱,10 μg/mL時,NO產生量分別為11.01和27.73 μmol/L。預示酸漿的葉可能具有抗炎活性,為今后尋找低毒高效的藥食植物抗炎藥提供參考。

圖2　酸漿對LPS誘導的RAW264.7細胞中NO產生的影響Fig.2　Effects of P. alkekengi L. on NO productionin LPS-stimulated RAW264.7 cells

3　結論

酸漿具有一定的抑菌、抗氧化、抗腫瘤、抗炎活性,并具有量效關系。抑菌檢測顯示,酸漿醇提物對三株菌都有抑制作用,其中漿果對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌效果最明顯,葉對枯草芽孢桿菌的抑制活性最強。DPPH法檢測發(fā)現(xiàn)宿萼的抗氧化活性最高,濃度5 mg/mL時基本和同劑量的VC效果等同。Alamar Blue法檢測抗腫瘤活性發(fā)現(xiàn),酸漿根、宿萼和葉的量效關系最為明顯,根和葉對乳腺癌細胞株MCF-7的抑制活性最強,宿萼對乳腺癌細胞株MDA-MB-231,宿萼對肝癌細胞株Bel7402的抑制活性最強。抗炎檢測中,葉顯示出較高的抗炎活性,莖抗炎效果最弱。綜上所述,酸漿具有很好的生物學活性,值得進一步開發(fā),以制備低毒副作用小的藥品和功能食品。但酸漿各部位成分復雜,其具體活性成分和相關機理,還有待深入研究。

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Comparison study on activities of the ethanol extract from five parts ofPhysalialkekengiL.

DING Pan,LIU Jin-juan,ZHOU Xiao-qi,XUE Ling-wei,SUN Yong,JIANG Ji-hong*

(Key Laboratory of Biotechnology for Medicinal Plant of Jiangsu Province,School of Life Science, Jiangsu Normal University,Xuzhou 221116,China)

Objective:The antimicrobial,antioxidant,anticancer and anti-inflammatory activities of the different parts ofPhysalialkekengiL. were evaluated in this study. Methods:The antimicrobial activities againstStaphylococcusaureus,EscherichiacoliandBacillussubtilisof the alcohol extracts of different parts were investigated using Oxford cup method. The antioxidant activities were evaluated by 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH)scavenging assay. The inhibition effects of human cancer cell lines MCF-7,MDA-MB-231 and Bel7402 were detected by Alamar Blue assay. NO assay kit was used to determine the anti-inflammatory activity. Results:The alcohol extract of fruit showed the highest antimicrobial activity againstS.aureusandE.coli. Besides,the alcohol extract of leaves showed the highest antimicrobial activity againstB.subtilis. The diameters of antibacterial circle were(16.63±0.49),(14.97±0.37),(15.83±0.29) mm,respectively. The alcohol extract of calyx exhibited 96.79%±2.09% DPPH radical cavenging efficiency at the concentration of 5 mg/mL,which demonstrated the similar antioxidant activity with the same dose of VC. All alcohol extracts of five parts showed inhibition activities on human cancer cells in a dose-dependent manner. The alcohol extracts of leaves showed better inhibition activities against MCF-7. Furthermore,the calyx showed better inhibition activities against MDA-MB-231 and Bel7402. The IC50were(31.46±1.49),(48.84±1.69)and(65.48±1.82) μg/mL. In addition,the alcohol extract of leaves showed the highest anti-inflammatory activity and the stem was lowest. NO production were 11.01 and 27.73 μmol/L at the concentration of 10 μg/mL. Conclusion:P.alkekengiL. has antibacterial,antioxidant,anti-tumor and anti-inflammatory activity. These results provided theoretical basis for the functional development,further utilization ofP.alkekengiL.

PhysalisalkekengiL.;antibacterial activity;antioxidant activity;anti-tumor activity;anti-inflammatory activity

2016-01-20

丁盼(1986-)，女，碩士研究生，研究方向：藥用植物資源與利用，E-mail：dingpan0723@126.com。

蔣繼宏(1962-)，男，博士，教授，研究方向：生物技術，E-mail:jhjiang@jsnu.edu.cn。

國家自然科學基金資助項目(31370646)；江蘇師范大學自然科學基金(14XLA02)；江蘇省藥用植物生物技術重點實驗室開放課題(KLBMP1404)。

TS201.2

A

1002-0306(2016)16-0113-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.16.014