孫小雯,鄭之明,駱家玉,趙根海,劉　會(huì),*

(1.安徽大學(xué)物理與材料科學(xué)學(xué)院,安徽合肥 230601;2.中國(guó)科學(xué)院離子束生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,安徽合肥230031;3.安徽省國(guó)營(yíng)沙河集林業(yè)總場(chǎng)白米山林場(chǎng),安徽滁州239060)

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黑曲霉幾丁質(zhì)合成酶基因chs形態(tài)突變株的構(gòu)建

孫小雯1,鄭之明2,駱家玉3,趙根海2,劉會(huì)2,*

(1.安徽大學(xué)物理與材料科學(xué)學(xué)院,安徽合肥 230601;2.中國(guó)科學(xué)院離子束生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,安徽合肥230031;3.安徽省國(guó)營(yíng)沙河集林業(yè)總場(chǎng)白米山林場(chǎng),安徽滁州239060)

以一株產(chǎn)檸檬酸的黑曲霉菌株為研究材料,為了優(yōu)化菌株的深層發(fā)酵形態(tài),提高檸檬酸產(chǎn)量,采用RNA干擾的方法,使與形態(tài)建成相關(guān)的幾丁質(zhì)合成酶chs基因沉默。首先將酶切得到的chs基因片段與質(zhì)粒pJL43-RNAi連接,構(gòu)建成干擾載體。為提高干擾載體的轉(zhuǎn)化率,對(duì)原生質(zhì)體制備、再生和轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行了優(yōu)化。然后通過(guò)聚乙二醇(PEG)介導(dǎo),將構(gòu)建的干擾載體導(dǎo)入黑曲霉的原生質(zhì)體中,經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化,篩選出形態(tài)突變株,并進(jìn)行深層發(fā)酵。結(jié)果表明,在36.5 ℃培養(yǎng)16 h的幼嫩菌絲最利于原生質(zhì)體釋放;而5 mg/mL的溶菌酶,10 mg/mL的蝸牛酶和10 mg/mL的纖維素酶組成的混合酶系為最優(yōu)的酶組合;在30 ℃下,以100 r/min酶解3 h可使原生質(zhì)體的最大產(chǎn)量達(dá)到5.11×106/mL。最優(yōu)的再生培養(yǎng)基為完全培養(yǎng)基,可以使再生率達(dá)到35.33%。獲得的3株轉(zhuǎn)化株的chs基因表達(dá)量降低,同時(shí)在深層發(fā)酵過(guò)程中,菌球的分支頻率降低,分支縮短,離散菌絲減少,檸檬酸產(chǎn)量也分別提高12.33%,24.17%和19.61%。通過(guò)分子改造的形態(tài)突變株具有良好的產(chǎn)酸性能,對(duì)推動(dòng)檸檬酸發(fā)酵工業(yè)的進(jìn)步有重要意義。

黑曲霉,原生質(zhì)體,RNA干擾,幾丁質(zhì)合成酶,形態(tài)突變株

檸檬酸是種被廣泛的應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化妝品和化工行業(yè)中的重要有機(jī)酸。黑曲霉是檸檬酸發(fā)酵工業(yè)的主要菌種,作為一種常見(jiàn)的絲狀真菌,在深層發(fā)酵過(guò)程中,菌絲體的形態(tài)和檸檬酸的合成代謝密切相關(guān),因此通過(guò)形態(tài)基因的分子改造實(shí)現(xiàn)菌種發(fā)酵性能的優(yōu)化,具有十分重要的研究和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

構(gòu)建高效的遺傳轉(zhuǎn)化體系是菌種進(jìn)行基因改造的關(guān)鍵,目前常用的絲狀真菌的轉(zhuǎn)化方法包括孢子電轉(zhuǎn)化法、農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法、原生質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法等[1]。其中原生質(zhì)體具有操作簡(jiǎn)單和材料易獲得等特點(diǎn),在轉(zhuǎn)化體系的建立中有明顯的優(yōu)勢(shì)[2]。絲狀真菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成復(fù)雜,具有良好的完整性和機(jī)械強(qiáng)度,因此制備原生質(zhì)體最大的挑戰(zhàn)就是在保持質(zhì)膜完整性和細(xì)胞活性的前提下高效地移除細(xì)胞壁[3-4]。Mania和Sukumar等的研究發(fā)現(xiàn)影響原生質(zhì)體形成的因素有很多,其中主要包括菌齡、裂解酶、酶解時(shí)間、酶解溫度、滲透壓穩(wěn)定劑等[5-6]。

絲狀真菌的形態(tài)基因可調(diào)控菌絲體的形態(tài)建成,而發(fā)酵形態(tài)對(duì)產(chǎn)物的合成有重要的影響。絲狀真菌的細(xì)胞壁主要是由幾丁質(zhì)、甘露聚糖和葡聚糖等多糖類(lèi)物質(zhì)交聯(lián)而成[7],其中的關(guān)鍵酶幾丁質(zhì)合成酶可催化N-乙酰葡萄糖胺殘基通過(guò)β-1,4-糖苷鍵連接成幾丁質(zhì),以維持細(xì)胞壁的完整性和菌絲正常有序地極化生長(zhǎng)。近年來(lái),有大量關(guān)于絲狀真菌幾丁質(zhì)合成酶基因在形態(tài)建成過(guò)程中的作用的相關(guān)研究。例如,Fujiwara等研究發(fā)現(xiàn)在構(gòu)巢曲霉中chsA和chsC基因?qū)?xì)胞壁的完整性和分生孢子的正常發(fā)育有重要作用[8]。而在米曲霉中,chsB和chsC基因也對(duì)分生孢子和菌絲的發(fā)育有重要影響[9]。Liu等研究也發(fā)現(xiàn)調(diào)控chs4基因的表達(dá)可以?xún)?yōu)化產(chǎn)黃青霉的深層發(fā)酵形態(tài),進(jìn)而提高青霉素的產(chǎn)量[10]。但目前尚未有關(guān)于黑曲霉的幾丁質(zhì)合成酶基因?qū)z體形態(tài)以及檸檬酸合成影響的相關(guān)報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)法對(duì)黑曲霉原生質(zhì)體制備和再生的條件進(jìn)行優(yōu)化,獲得大量高質(zhì)量的原生質(zhì)體。然后采用RNAi技術(shù),沉默黑曲霉chs基因的表達(dá),將構(gòu)建的干擾載體通過(guò)PEG的介導(dǎo),成功地導(dǎo)入原生質(zhì)體中,篩選出檸檬酸高產(chǎn)的轉(zhuǎn)化株,并對(duì)轉(zhuǎn)化株的深層發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行進(jìn)一步地探究。同時(shí)初步建立一套高效的黑曲霉原生質(zhì)體遺傳轉(zhuǎn)化體系,為黑曲霉工業(yè)菌株選育工作奠定了基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

檸檬酸工業(yè)生產(chǎn)菌株黑曲霉(AspergillusnigerCBS 513.88)由日照金禾生化集團(tuán)股份有限公司提供;大腸桿菌(Escherchiacoli)DH5α購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司;質(zhì)粒載體pJL43-RNAi由INBIOTEC的Juan F Martín教授饋贈(zèng);博來(lái)霉素、溶菌酶(22800 U/mg)、蝸牛酶、T4 DNA 連接酶(5 U/μL)、Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒、Sanprep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒、Sanprep柱式DNA膠回收試劑盒、Sanprep柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒均購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司;纖維素酶(10000 U/g)上海阿拉丁生化科技股份有限公司;NcoI(10 U/μL)、Dream Taq DNA 聚合酶(5 U/μL)、O’GeneRuler 1kb DNA Ladder、O’GeneRuler 100 bp DNALadder Fermentas公司;其他試劑均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

TH4-200顯微鏡Olympus;2-16K冷凍高速離心機(jī)北京博勵(lì)行儀器有限公司;DK-80電熱恒溫三孔水槽搖床上海雙捷實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;HZ-2211K立式雙層振蕩培養(yǎng)箱華利達(dá)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler上海賓智生物科技有限公司;HWS型恒溫恒濕箱寧波東南儀器有限公司;DYY-6C型電泳儀北京市六一儀器廠;培清JS-2012自動(dòng)對(duì)焦凝膠成像分析儀上海培清科技有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1培養(yǎng)基的配制PDA產(chǎn)孢培養(yǎng)基:按文獻(xiàn)進(jìn)行配制[11]。

發(fā)酵培養(yǎng)基:200 g玉米粉溶解于1000 mL蒸餾水,121 ℃滅菌20 min,溫度降至60 ℃左右加入α-1,4-葡萄糖水解酶。

完全培養(yǎng)基:0.5% 胰蛋白胨,0.5% 酵母提取物,1% 葡萄糖,0.06% 硝酸鈉,1.5% 磷酸氫二鉀,0.52% 氯化鉀,0.52% 七水硫酸鎂,0.2% 微量元素溶液。

微量元素溶液(g/L)[12-13]:七水硫酸鋅5 g,六水合硫酸鐵銨1 μg,五水硫酸銅0.25 μg,四水合氯化錳0.06 μg,硼酸0.05 μg,二水合鉬酸鈉0.05 g。

再生培養(yǎng)基:完全培養(yǎng)基加入1 mol/L的蔗糖,上層培養(yǎng)基加1%的瓊脂,下層培養(yǎng)基加2%的瓊脂。

博來(lái)霉素(Zeocin,100 mg/mL):取1 mL無(wú)菌水溶解100 mg Zeocin粉末,過(guò)濾除菌(濾膜孔徑0.22 μm),制成母液,-20 ℃保存。

1.2.2原生質(zhì)體制備黑曲霉菌株在PDA斜面上,36.5 ℃培養(yǎng)7 d,收集孢子。刮取斜面上的孢子溶解于含有玻璃珠的無(wú)菌水中,100 r/min振蕩2 h,使孢子被充分打散,用三層無(wú)菌紗布過(guò)濾,制備成孢子懸液,對(duì)孢子濃度進(jìn)行計(jì)數(shù),以5×104/mL的孢子濃度接種到含有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中,在搖床上以36.5 ℃,270 r/min培養(yǎng)一定時(shí)間,獲得菌絲體。

將菌液用無(wú)菌濾紙過(guò)濾吸干,取200 mg菌絲體溶解于10 mL酶解液中。酶解液按一定濃度和組合(表1)溶解于KMP溶液(0.02 mol/L 磷酸鹽緩沖液,0.7 mol/L氯化鉀和0.8 mol/L甘露醇,pH6.3)。菌絲體酶解一定時(shí)間后,放入4 ℃冰箱15 min,終止酶解反應(yīng)。然后在得到的最佳酶組合的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步研究菌齡和酶解條件等因素對(duì)原生質(zhì)體形成過(guò)程的影響,正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表2。

表1　酶組合的正交實(shí)驗(yàn)的因素水平表(mg/mL)

表2　菌齡和酶解條件的正交實(shí)驗(yàn)的因素水平表

1.2.3原生質(zhì)體純化酶解結(jié)束后,用四層無(wú)菌擦鏡紙過(guò)濾,收集濾液,6000 r/min 離心5 min,棄上清液,用KMP溶液洗滌沉淀3次。將原生質(zhì)體沉淀重懸于2 mL原生質(zhì)體保存液(0.6 mol/L蔗糖,10 mmol/L氯化鈣,10 mmol/L Tris-HCl,pH7.5),用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。

1.2.4原生質(zhì)體再生向培養(yǎng)皿底部倒入10 mL原生質(zhì)體下層再生培養(yǎng)基,待其凝固,再將原生質(zhì)體與冷卻至40 ℃左右的原生質(zhì)體上層再生培養(yǎng)基輕輕混勻后,倒入上述平板中,置于36.5 ℃培養(yǎng)3 d,對(duì)平板上的再生菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)。原生質(zhì)體再生率的計(jì)算公式如下:

原生質(zhì)體再生率(%)=再生培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落數(shù)/涂布原生質(zhì)體數(shù)量×100

1.2.5原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化將純化后的原生質(zhì)體以1×106/mL的濃度重懸于KMPC溶液(使用前向KMP溶液中加入氯化鈣溶液至終濃度為50 mmol/L)。取100 μL原生質(zhì)體懸液,和5 μg載體混勻,再加入50 μL過(guò)濾除菌的PPC轉(zhuǎn)化溶液(40% PEG-MW3500,20 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.3),使用前加50 mmol/L氯化鈣),冰浴30 min。加入1 mL PPC轉(zhuǎn)化溶液,輕輕吸打混勻后加入冷卻至40 ℃ 左右,含有30 μg/mL博來(lái)霉素霉素的上層再生培養(yǎng)基中,輕輕混勻,倒入已凝固的底層再生培養(yǎng)基平板上,36.5 ℃培養(yǎng)7 d。

1.2.6干擾載體的構(gòu)建用Ezup真菌基因組DNA提取試劑盒提取黑曲霉霉全基因組,并以之為模板,以chsF(5′-CATGCCATGGCGACAAACCGCATAC TGAAC-3′)和chsR(5′-CATGCCATGGACAAGGGC AAGCCTCTAATC-3′)為引物進(jìn)行目的基因chs的PCR擴(kuò)增。將干擾載體pJL43-RNAi轉(zhuǎn)化到大腸桿菌后進(jìn)行質(zhì)粒提取后,用NcoI對(duì)質(zhì)粒和擴(kuò)增的chs基因進(jìn)行酶切,再用T4 DNA連接酶將回收純化的酶切載體與目的基因酶切片段連接,即為構(gòu)建的干擾載體。

1.2.7轉(zhuǎn)化株的mRNA表達(dá)水平檢測(cè)提取轉(zhuǎn)化株的總RNA,用M-MuLV第一鏈cDNA合成試劑盒將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA,再以cDNA為模板,分別用設(shè)計(jì)的內(nèi)參基因actin和chs基因兩對(duì)引物序列進(jìn)行PCR反應(yīng),actinF(5′-CATGCCATGGGGTCTGGAGAGCG GTGGTAT-3′)和actinR(5′-CATGCCATGGGAAGAA GGAGCAAGAGCAGT G-3′),擴(kuò)增出目的基因片段。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,并用Image J軟件處理電泳圖,根據(jù)電泳條帶亮度分析mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.8轉(zhuǎn)化株的深層發(fā)酵菌絲體形態(tài)觀察和檸檬酸產(chǎn)量測(cè)定向裝有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶按1×106/mL的接種量接種孢子懸液,在37 ℃下,250 r/min培養(yǎng)3 d,發(fā)酵結(jié)束后取100 μL發(fā)酵液用顯微鏡鏡檢觀察菌絲體形態(tài),并用斐林試劑法檢測(cè)發(fā)酵液的總酸含量。

1.3數(shù)據(jù)處理

采用Primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)目的基因的擴(kuò)增引物,采用正交設(shè)計(jì)助手II V3.1和ImageJ軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,采用Origin8.0軟件作圖。

2　結(jié)果與分析

2.1不同酶組合對(duì)原生質(zhì)體形成的影響

絲狀真菌細(xì)胞壁成分較為復(fù)雜,主要是由葡聚糖、甘露聚糖和幾丁質(zhì)等物質(zhì)組成,而單一的裂解酶不能酶解細(xì)胞壁的所有組分,進(jìn)而影響原生質(zhì)體的形成和再生過(guò)程。許多研究表明裂解酶的種類(lèi)和濃度是影響原生質(zhì)體產(chǎn)量和質(zhì)量的重要因素,而使用混合酶解液的效果優(yōu)于單獨(dú)使用一種酶[14-16]。蝸牛酶中由于含有幾丁質(zhì)酶,對(duì)裂解細(xì)胞壁有重要作用,而添加溶菌酶和纖維素酶可促進(jìn)細(xì)胞壁的酶解,提高原生質(zhì)體產(chǎn)量。最優(yōu)的酶解體系需要高效地裂解細(xì)胞壁,同時(shí)不能對(duì)細(xì)胞膜造成損傷。為研究最適合黑曲霉原生質(zhì)體形成的酶解體系,將溶菌酶、蝸牛酶、纖維素酶按一定的濃度組合成混合酶系,對(duì)菌絲體進(jìn)行酶解,由表3可知,RA>RC>RB,即溶菌酶對(duì)酶解體系的影響最顯著,纖維素酶次之,而蝸牛酶的影響最小;kA1>kA2表明A1是因素A是最優(yōu)水平,同理可以得出B2和C2分別是因素B和C的最優(yōu)水平;綜上所述,5 mg/mL的溶菌酶,10 mg/mL的蝸牛酶和10 mg/mL的纖維素酶組成的混合酶系為最優(yōu)的酶組合,原生質(zhì)體產(chǎn)量達(dá)到3.7×106/mL。本研究成功建立溶菌酶、蝸牛酶和纖維素酶的混合酶解體系,并優(yōu)化出合適的濃度用于黑曲霉原生質(zhì)體的制備。

表3　酶組合的正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果

2.2不同菌齡和酶解條件對(duì)原生質(zhì)體形成的影響

在優(yōu)化出的最優(yōu)酶組合的基礎(chǔ)上,對(duì)菌齡和酶解條件對(duì)原生質(zhì)體形成過(guò)程的影響進(jìn)行了進(jìn)一步研究。由表4可知,RC>RA>RB>RD,即這四個(gè)因素對(duì)原生質(zhì)體形成影響的重要性依次是:酶解時(shí)間>菌齡>酶解溫度>酶解轉(zhuǎn)速。制備原生質(zhì)體的最優(yōu)的條件是A2B2C2D2,即酶解時(shí)間3 h,菌齡16 h,酶解溫度30 ℃,酶解轉(zhuǎn)速100 r/min,以此條件制備的原生質(zhì)體產(chǎn)量可達(dá)到5.11×106/mL。

表4　菌齡和酶解條件的正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果

研究表明酶解時(shí)間是影響原生質(zhì)體制備和再生的最關(guān)鍵的因素,酶解時(shí)間不足2 h不能完全破壞細(xì)胞壁,釋放出原生質(zhì)體,而適當(dāng)?shù)难娱L(zhǎng)酶解時(shí)間可以有效地提高原生質(zhì)體產(chǎn)量,但并不是酶解時(shí)間越長(zhǎng)越好,酶解到4 h雖然原生質(zhì)體產(chǎn)量有所提高,但此時(shí)去壁原生質(zhì)體的細(xì)胞膜穩(wěn)定性差,酶解液會(huì)對(duì)細(xì)胞膜造成不可修復(fù)的損傷,使原生質(zhì)體的再生率顯著降低,直接影響后續(xù)轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)的效率。表4的結(jié)果表明酶解時(shí)間3 h最利于原生質(zhì)體的制備和再生,并且酶解結(jié)束后最好立刻將酶解液放置低溫環(huán)境終止反應(yīng),并及時(shí)過(guò)濾洗脫剩余的酶液,防止反應(yīng)過(guò)度。

菌齡對(duì)黑曲霉原生質(zhì)體的形成也起到重要的作用,隨著菌齡變化,菌絲體的細(xì)胞壁組分也有所差異,因此對(duì)裂解酶的敏感性也有所不同。一般幼嫩的菌絲比成熟的菌絲和菌球更易被裂解酶酶解,由于菌球比菌絲的結(jié)合更緊密,與酶解液的接觸面積也就相對(duì)減小,因此不利于原生質(zhì)體釋放。Mania等的研究表明培養(yǎng)10 h的構(gòu)巢曲霉最適合制備原生質(zhì)體[5],而產(chǎn)黃青霉培養(yǎng)24 h的效果最優(yōu)[6]。本研究發(fā)現(xiàn)黑曲霉菌株培養(yǎng)16 h的菌絲體最適宜原生質(zhì)體的釋放。

酶解溫度和酶解轉(zhuǎn)速也是影響原生質(zhì)體得率的因素,但是實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明影響效果不顯著,綜合考慮幾種酶的最適溫度,較溫和的反應(yīng)溫度利于酶解,低溫和高溫都會(huì)對(duì)酶活有不良的影響,最適宜的酶解溫度是30 ℃。將酶解的樣品放置在搖床上是為了使菌絲和酶解液充分接觸混合,100 r/min是最適宜的轉(zhuǎn)速,酶解轉(zhuǎn)速過(guò)低,造成體系中只有部分菌絲可以一直與酶液接觸,混合效果不理想,同時(shí)轉(zhuǎn)速也不能過(guò)高,因?yàn)殡S著酶解反應(yīng)的進(jìn)行,細(xì)胞壁逐漸移除,暴露在酶解液中的細(xì)胞膜較脆弱,容易破裂,溫和的混合體系最易于原生質(zhì)體的釋放和再生。

2.3不同種類(lèi)再生培養(yǎng)基對(duì)原生質(zhì)體再生的影響

原生質(zhì)體的再生過(guò)程不僅受酶解時(shí)間的影響,同時(shí)也受再生培養(yǎng)基種類(lèi)的影響。再生培養(yǎng)基在細(xì)胞壁再生過(guò)程中的作用除了是為細(xì)胞壁建成提供生長(zhǎng)底物以外,固體瓊脂還可避免可溶性的細(xì)胞壁物質(zhì)從原生質(zhì)體的表面擴(kuò)散而被保留下來(lái),作為有用的機(jī)體酶或自身組織而聚集成完整的細(xì)胞壁[17]。表5的結(jié)果表明,完全培養(yǎng)基是其中最優(yōu)的再生培養(yǎng)基,再生率可達(dá)到35.33%,而相同條件下的PDA作為再生培養(yǎng)基,再生率僅16.37%,玉米液化液的再生培養(yǎng)基再生率也僅17.85%。完全培養(yǎng)基的組分相對(duì)于PDA和玉米液化液更為豐富,碳氮源比例以及微量元素的添加都更利于細(xì)胞壁重建,使其再生效果明顯優(yōu)于后兩種再生培養(yǎng)基,再生率有顯著提高。

表5　再生培養(yǎng)基對(duì)再生率的影響

此外,在原生質(zhì)體再生過(guò)程中,單層平板的直接涂布法會(huì)使再生率降低,這是由于玻璃棒會(huì)對(duì)部分原生質(zhì)體造成機(jī)械損傷,與之相比,雙層平板法將原生質(zhì)體懸液與上層再生培養(yǎng)基先混合再倒平板的方法,有效地避免了機(jī)械損傷,對(duì)提高再生率起重要作用[18]。

2.4原生質(zhì)體形成過(guò)程的形態(tài)觀察

菌絲體的細(xì)胞壁在酶解過(guò)程中菌絲的頂端等部位的細(xì)胞膜出現(xiàn)外凸現(xiàn)象,并逐漸膨大變形形成小球,之后內(nèi)容物脫離菌絲成為原生質(zhì)體(圖1a)。經(jīng)過(guò)過(guò)濾可以將大量菌絲片段濾去,主要僅剩透明小球狀的破壁原生質(zhì)體和少量酶解的菌絲碎片。酶解2 h后(圖1c)可見(jiàn)大量原生質(zhì)體形成,但酶解4 h時(shí)(圖1e)發(fā)現(xiàn)雖然形成的原生質(zhì)體數(shù)量大,但其中包含大量形狀不規(guī)則的皺縮的原生質(zhì)體,可能此時(shí)的原生質(zhì)體不僅細(xì)胞壁被酶解,細(xì)胞膜也被酶解液造成不可逆的損傷,這也是該時(shí)期的原生質(zhì)體再生率低的主要原因。

圖1　原生質(zhì)體形成過(guò)程Fig.1　Process of protoplast release 注:a.菌齡和酶解條件優(yōu)化前,最優(yōu)酶組合條件下的原生質(zhì)體形態(tài);b. 酶解1 h;c. 酶解2 h;c. 酶解3 h;d. 酶解4 h;e. 酶解5 h。

圖2　質(zhì)粒載體酶切電泳圖Fig.2　Electropherogram of plasmid vector after NcoI digestion 注:M為O’GeneRulerT M 1kb DNA Ladder,1為酶切的pJL43-RNAi質(zhì)粒載體。

2.5干擾載體的構(gòu)建

pJL43-RNAi載體上含有一個(gè)博來(lái)霉素抗性基因(ble)和一個(gè)dsRNA表達(dá)盒,將載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌后進(jìn)行質(zhì)粒提取,載體中只有一個(gè)NcoI酶切位點(diǎn),對(duì)其進(jìn)行NcoI單酶切后變?yōu)榫€性,只有一條大小約為6 kb的條帶(圖2)。

以黑曲霉全基因組為模板,設(shè)計(jì)一對(duì)兩端加上NcoI酶切位點(diǎn)的引物,PCR擴(kuò)增出325 bp大小的chs目的基因片段,酶切后進(jìn)行膠回收(圖3),再將其與酶切質(zhì)粒連接構(gòu)建成待轉(zhuǎn)化的干擾載體。

圖3　目的基因酶切電泳圖 Fig.3　Electropherogram of chs fragment after NcoI digestion 注:M為O’ GeneRulerT M 100 bp DNA Ladder,1為酶切的chs基因片段。

2.6轉(zhuǎn)化株的chs基因沉默程度

RNAi是通過(guò)導(dǎo)入外源雙鏈RNA而降解同源mRNA的過(guò)程,因此mRNA的表達(dá)水平可以反映基因的沉默程度,從圖4可以看出挑選的3株形態(tài)突變株的chs基因的mRNA的表達(dá)水平比原始菌有不同程度的下降,說(shuō)明對(duì)chs的基因的干擾是有效果的。

圖4　反轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)各菌株chs基因表達(dá)水平Fig. 4　RT-PCR analysis of chs mRNA expression in the mutant strains

2.7chs基因?qū)z體的深層發(fā)酵形態(tài)的影響

絲狀真菌在深層發(fā)酵過(guò)程中,隨組織器官和培養(yǎng)條件的變化會(huì)出現(xiàn)不同的形態(tài),而菌絲體的形態(tài)對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)率有顯著的影響。其微觀形態(tài)的發(fā)展決定了菌絲體最終的宏觀形態(tài),而菌絲體的形態(tài)發(fā)生過(guò)程是受形態(tài)基因調(diào)控的。幾丁質(zhì)作為細(xì)胞壁的主要成分,其合成過(guò)程復(fù)雜,而其中的關(guān)鍵酶是幾丁質(zhì)合成酶,它的作用是催化 N-乙酰葡萄糖胺殘基通過(guò)β-1,4-糖苷鍵連接成幾丁質(zhì),維持細(xì)胞壁的完整性和菌絲正常有序地極化生長(zhǎng)。

圖5　顯微鏡觀察各菌株的菌絲體形態(tài)(100×)Fig.5　Mycelium morphology of strains observed by microscope(100×)

本研究采用RNAi技術(shù),使幾丁質(zhì)合成酶基因chs表達(dá)沉默,從圖5可以看出該培養(yǎng)條件下,菌株均形成直徑約80～100 μm的菌球,而chs基因沉默的轉(zhuǎn)化株的菌球比原始菌株的分支頻率小,并且沒(méi)有離散菌絲,菌球的邊緣較光滑。由此推斷出chs基因在黑曲霉的形態(tài)建成過(guò)程中,尤其對(duì)菌絲的生長(zhǎng)有重要作用。

2.8形態(tài)突變株的菌絲體形態(tài)和檸檬酸產(chǎn)量的相關(guān)性

檸檬酸深層發(fā)酵過(guò)程的菌絲體形態(tài)與檸檬酸產(chǎn)量密切相關(guān),一般致密的菌球形態(tài)利于檸檬酸的積累[19-21],反之,離散菌絲和松散的菌球會(huì)降低產(chǎn)酸量,圖6的結(jié)果也進(jìn)一步驗(yàn)證其中的相關(guān)性,3株chs基因表達(dá)沉默的形態(tài)突變株的檸檬酸產(chǎn)量較原始菌株分別提高了12.33%、24.17%、19.61%,離散菌絲,菌球的粗糙度和菌絲的分支頻率降低,都會(huì)降低發(fā)酵液的粘度,進(jìn)而提高發(fā)酵液的傳質(zhì)和傳氧效率,最終實(shí)現(xiàn)檸檬酸產(chǎn)量的顯著提高,由此可以推斷出chs基因沉默對(duì)檸檬酸的積累有很好的促進(jìn)作用。

圖6　chs基因?qū)幟仕岙a(chǎn)量的影響Fi g.6　Effect of chs gene on citric acid yield

3　結(jié)論

建立了黑曲霉原生質(zhì)體制備、再生和轉(zhuǎn)化體系,優(yōu)化的結(jié)果是:36.5 ℃培養(yǎng)16 h的幼嫩菌絲溶解于5 mg/mL的溶菌酶,10 mg/mL的蝸牛酶和10 mg/mL的纖維素酶組成的混合酶系中,在30 ℃下,以100 r/min酶解3 h可使原生質(zhì)體的最大產(chǎn)量達(dá)到5.11×106/mL,以完全培養(yǎng)基作為再生培養(yǎng)基,可以使再生率達(dá)到35.33%,當(dāng)原生質(zhì)體數(shù)量達(dá)到1×106/mL時(shí),利用PEG介導(dǎo)轉(zhuǎn)化,可成功獲得轉(zhuǎn)化菌株。同時(shí)采用RNAi技術(shù),構(gòu)建chs基因的干擾載體,并進(jìn)行轉(zhuǎn)化,抗性篩選出3株檸檬酸產(chǎn)量提高的形態(tài)突變株,發(fā)現(xiàn)菌絲體的離散菌絲減少,菌球的粗糙度和菌絲的分支頻率降低。揭示了黑曲霉深層發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸的過(guò)程中的菌絲體形態(tài)與檸檬酸產(chǎn)量之間的相關(guān)性,為檸檬酸工業(yè)生產(chǎn)中黑曲霉菌株的分子改造和代謝調(diào)控奠定了基礎(chǔ)。

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Optimization of protoplast formation,regenerationin and transformation inAspergillusniger

SUN Xiao-wen1,ZHENG Zhi-ming2,LUO Jia-yu3,ZHAO Gen-hai2,LIU Hui2,*

(1.School of Physics and Materials Science,Anhui University,Hefei 230601,China;2.Key Laboratory of Ion Beam Bioengineering,Chinese Academy of Sciences,Hefei 230031,China;3.White Rice Mountain Forest Farm State,Owned Shaheji Forestry General Station Anhui Province,Chuzhou 239060,China)

For improving the mycelial morphology and citric acid production ofA.niger,we construct a gene silencing vector by RNA interference technology to silence the chitin synthase gene. The fragments ofchsgene were amplified by PCR,which was ligated to plasmid pJL43-RNAi to generate the RNAi vector. In order to increase the transformation frequency,the effects of some factors on protoplast formation and regeneration from citric acid-producing fungusA.nigerwere investigated. The silencing vectors were introduced into purificatory protoplasts by a polyethylene glycol(PEG)-mediated transformation method. The results showed that the mycelia incubated for 16 h at 36.5 ℃ were most suitable for protoplast release,which digested by enzyme combination of 5 mg/mL lysozyme,10 mg/mL snailase and 10 mg/mL cellulase for 3 h as 100 r/min at 30 ℃,and a high yield of protoplasts(5.11×106/mL)were obtained. In addition,the maximum regeneration rate was 35.33%,while the complete medium as the regeneration media. After conversion,three morphological mutant strains are smoother and have less dispersed mycelia,which were distinct from the original strain in morphology. The transformantschs-1,chs-2 andchs-3 where citric acid production rise by 12.33%,24.17% and 19.61%,respectively. The morphological mutants of chs exhibited the excellent production potential during submerged culture,which had important significance for the development of the citric acid fermentation industry.

Aspergillusniger;protoplasts;RNAi;chitin synthase;morphological mutant

2016-03-04

孫小雯(1991-)，女，碩士研究生，研究方向：絲狀真菌的形態(tài)代謝工程，E-mail:sxw05580590@163.com。

劉會(huì)(1986-)，女，助理研究員，研究方向：微生物發(fā)酵，誘變育種，E-mail:lhazrael@126.com。

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(2014AA021704)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)18-0218-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.18.033