竇冰然,郭會明,駱海燕,洪厚勝,3,*

(1.南京工業(yè)大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院,江蘇南京211816;2.南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院,江蘇南京211816;3.南京匯科生物工程設(shè)備有限公司,江蘇南京210009)

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耐高糖面包酵母發(fā)酵工藝優(yōu)化

竇冰然1,郭會明1,駱海燕2,洪厚勝2,3,*

(1.南京工業(yè)大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院,江蘇南京211816;2.南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院,江蘇南京211816;3.南京匯科生物工程設(shè)備有限公司,江蘇南京210009)

為了優(yōu)化耐高糖酵母發(fā)酵工藝,基于培養(yǎng)溫度、搖床轉(zhuǎn)速、裝液量、初始pH、菌體接種量五個因素的單因素實驗的結(jié)果,之后對裝液量、初始pH、菌體接種量進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化實驗。結(jié)果表明,最佳工藝條件為:培養(yǎng)溫度30 ℃,搖床轉(zhuǎn)速200 r/min,裝液量8.4%,pH4.7,接種量7.4%,在此條件下,酵母細(xì)胞干重提高了55.72%。同時,利用5.0 L機(jī)械攪拌罐以溶氧反饋流加、恒速流加、間歇流加三種糖蜜補(bǔ)充方式進(jìn)行酵母細(xì)胞培養(yǎng),繪制生長曲線,發(fā)現(xiàn)以溶氧反饋流加方式補(bǔ)充糖蜜更有利于酵母繁殖,最大酵母濕重達(dá)到143.95 g/L,達(dá)到了耐高糖面包酵母高密度發(fā)酵的實驗水平,確定了酵母最佳的流加補(bǔ)料方式。

耐高糖面包酵母,響應(yīng)面法,流加培養(yǎng),優(yōu)化

面包酵母是一種氨基酸含量較高的單細(xì)胞微生物,蛋白質(zhì)含量在50%左右,并且含有豐富的B族維生素,酶系與生理活性物質(zhì)[1]。早在幾千年前人類就使用面包酵母來發(fā)酵面包以及酒類,在現(xiàn)代食品工業(yè)中,也被廣泛用作人類主食的制作,如作為饅頭、面包、包子、餅干糕點等面制食品的優(yōu)良發(fā)酵劑與營養(yǎng)劑[2-4]。在多數(shù)情況下,烘烤制品是需要加糖的,有時蔗糖與面粉比高達(dá)25%,普通的酵母在這種高糖情況下生長會受到抑制,傳統(tǒng)的高糖類面包制作利用加大酵母的使用量來彌補(bǔ)發(fā)酵力的不足,但是為了降低制作成本,這就需要使用耐高糖的酵母來保證良好的發(fā)酵特性[5-7]。

近年來針對耐高糖面包酵母的研究,多主要集中于菌種的分離篩選及應(yīng)用方面,但對于其發(fā)酵過程的相關(guān)優(yōu)化研究則報道不多。劉青等[8]通過制備的耐高糖酵母單倍體發(fā)酵篩選出了具有高發(fā)酵力的菌株。杜鵑[9]通過椴樹蜜篩選分離出耐高糖酵母菌株,并將其應(yīng)用于發(fā)酵生產(chǎn)蜂蜜醋飲料。Saksinchai S等[10]通過從蜂蜜中篩選出耐高糖酵母菌種,并研究了所選菌種的基因序列相關(guān)性。本實驗利用市售耐高糖面包酵母分離篩選出菌株,并通過單因素與響應(yīng)面法進(jìn)一步優(yōu)化該菌株的搖瓶條件下發(fā)酵工藝參數(shù),通過分析確定最優(yōu)工藝參數(shù),有效提高酵母生物量并提供有效的理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

安琪牌耐高糖面包活性干酵母市售;斜面培養(yǎng)基(YPD固體培養(yǎng)基)葡萄糖2%,酵母膏1%,蛋白胨2%,瓊脂1.5%～1.7%;一級種子培養(yǎng)基(YPD液體培養(yǎng)基)葡萄糖2%,蛋白胨2%,酵母膏1%;二級種子培養(yǎng)基(糖蜜培養(yǎng)基)處理稀釋后含糖量25%的甘蔗糖蜜10%,MgSO40.1%,(NH4)2SO40.05%;發(fā)酵培養(yǎng)基處理稀釋后含糖量25%的甘蔗糖蜜37%,尿素(含氮量10 g/100 mL)14%,(NH4)H2PO4(含磷量以P2O5計10 g/100 mL)1.2%,MgSO47.5 g,維生素B10.2 g,維生素B50.2 g,維生素B60.2 g,生物素0.1 g。

UVmini-1240紫外可見分光光度計島津制作所;TGL-20B高速臺式離心機(jī)上海安亭科學(xué)儀器廠;MGF-5 5.0 L機(jī)械攪拌玻璃發(fā)酵罐南京匯科生物工程設(shè)備有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1種子液培養(yǎng)稱取1%活性干酵母于YPD 液體培養(yǎng)基中,30 ℃,200 r/min,振蕩培養(yǎng)24 h;取0.1 mL菌液,稀釋涂布于YPD固體培養(yǎng)基平板上,置于 30 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 d;挑取菌體劃線培養(yǎng),經(jīng)1次活化,挑取單菌落,斜面保藏。將斜面保藏的酵母菌接一環(huán)于YPD液體培養(yǎng)基中,30 ℃,200 r/min 培養(yǎng),作為發(fā)酵用種子液。

1.2.2初始發(fā)酵培養(yǎng)條件250 mL三角瓶裝40 mL培養(yǎng)基,接種量10%,初始pH4.8,30 ℃,220 r/min,搖瓶培養(yǎng)24 h。

1.2.3菌體生物量的測定比濁法:酵母菌體的生長引起發(fā)酵液混濁度的增高。通過紫外分光光度計測定一定波長下的OD值,以此判斷酵母的生長狀況。在600 nm下測定適當(dāng)稀釋的發(fā)酵液的OD值。

酵母濕重:取發(fā)酵液10 mL,10000 r/min離心兩次,每次10 min。

酵母干重:將上述離心后棄去上清液的酵母菌體,在105 ℃烘箱中干燥至恒重,即為酵母干重。

1.2.4酵母發(fā)酵時間的測定將酵母種子液按10%的接種量接種于裝有250 mL YPD液體培養(yǎng)基的三角瓶中,再分裝于15個50 mL三角瓶中,裝液量均為10 mL,搖床培養(yǎng),設(shè)置溫度30 ℃,轉(zhuǎn)速200 r/min。以剛放入搖床為0 h,每隔2 h取出一個三角瓶,測定發(fā)酵液的OD600 nm。以時間為橫坐標(biāo),OD600 nm值為縱坐標(biāo)繪制出酵母的生長曲線。

1.3實驗設(shè)計

1.3.1溫度單因素實驗在二級種子培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上,對酵母的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化,以溫度為單因素進(jìn)行實驗,設(shè)置五個水平,分別為26、28、30、32、34 ℃。其他培養(yǎng)條件為轉(zhuǎn)速200 r/min,裝液量16%,接種量10%,初始pH4.8。測定酵母細(xì)胞干重,繪制曲線進(jìn)行對比,設(shè)置3次重復(fù)。

1.3.2轉(zhuǎn)速單因素實驗以轉(zhuǎn)速為單因素,設(shè)置五個水平,分別為140、160、180、200、220 r/min。其他培養(yǎng)條件為溫度30 ℃,裝液量16%,接種量10%,初始pH4.8。測定酵母細(xì)胞干重,繪制曲線進(jìn)行對比,設(shè)置3次重復(fù)。

1.3.3裝液量單因素實驗以裝液量為單因素,設(shè)置五個水平,分別為4%、10%、16%、22%、28%。其他培養(yǎng)條件為溫度30 ℃,轉(zhuǎn)速200 r/min,接種量10%,初始pH4.8。測定酵母細(xì)胞干重,繪制曲線進(jìn)行對比,設(shè)置3次重復(fù)。

1.3.4初始pH單因素實驗以初始pH為單因素,設(shè)置五個水平,分別為4.2、4.5、4.8、5.1、5.4。其他培養(yǎng)條件為溫度30 ℃,轉(zhuǎn)速200 r/min,接種量10%,裝液量10%。測定酵母細(xì)胞干重,繪制曲線進(jìn)行對比,設(shè)置3次重復(fù)。

1.3.5接種量單因素實驗以接種量為單因素,設(shè)置五個水平,分別為4%、8%、12%、16%、20%。其他培養(yǎng)條件為溫度30 ℃,轉(zhuǎn)速200 r/min,初始pH4.8,裝液量10%。測定酵母細(xì)胞干重,繪制曲線進(jìn)行對比,設(shè)置3次重復(fù)。

1.3.6響應(yīng)面設(shè)計在單因素實驗的基礎(chǔ)上,選取對酵母生長影響大的三個因素:裝液量、pH、接種量,以酵母干重為響應(yīng)值利用Design-Expert8.0.5b軟件進(jìn)行3因素3水平的Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計,優(yōu)化耐高糖面包酵母培養(yǎng)條件。響應(yīng)面實驗的因素水平表見表1。

表1　響應(yīng)面設(shè)計因素水平表

1.3.7酵母流加方式對比實驗5.0 L罐中糖蜜流加策略對比實驗 取一環(huán)斜面保藏的酵母菌于一級種子培養(yǎng)基,以30 ℃,200 r/min,搖瓶培養(yǎng)24 h為條件制備一級種子液;取一級種子液30 mL以接種量7.4%制備二級種子液350 mL,pH4.7,其他培養(yǎng)條件與一級種子液相同。將二級種子液以10%接種量接于5.0 L機(jī)械攪拌罐中,分別以恒速流加、間歇流加、溶氧反饋流加三種方式流加糖蜜,發(fā)酵26 h后,以時間為橫坐標(biāo),酵母菌體濕重為縱坐標(biāo),繪制酵母發(fā)酵曲線。

1.4數(shù)據(jù)處理

實驗所用到的數(shù)據(jù)分析軟件:Design-Expert(8.0.5b),SPSS Statistics(17.0)。

2　結(jié)果與討論

2.1酵母發(fā)酵時間的確定

從圖1可知,耐高糖活性干酵母在YPD液體培養(yǎng)基中,0～6 h處于遲滯期,6～24 h處于對數(shù)生長期,24 h之后達(dá)到平穩(wěn)期,因此將優(yōu)化實驗的發(fā)酵時間設(shè)為24 h。

圖1　酵母生長曲線Fig.1　Growth curve of yeast

2.2單因素實驗

2.2.1培養(yǎng)溫度對酵母干重的影響由圖2中可以看出,當(dāng)培養(yǎng)溫度由26～30 ℃,隨著溫度的升高,酵母的細(xì)胞干重隨之增加,當(dāng)培養(yǎng)溫度達(dá)到30 ℃時,酵母干重達(dá)到最大值,當(dāng)培養(yǎng)溫度大于30 ℃,酵母干重逐漸下降,但26～32 ℃之前酵母干重變化不大,隨著溫度的增加,酵母干重并沒有較大的改變,當(dāng)溫度為34 ℃時,酵母干重下降明顯,因此選擇酵母培養(yǎng)的最佳溫度30 ℃作為響應(yīng)面實驗培養(yǎng)溫度。

圖2　溫度對酵母干重的影響Fig.2　Effect of temperature on dry weight of yeast

2.2.2轉(zhuǎn)速對酵母干重的影響由圖3可以看出,當(dāng)轉(zhuǎn)速由140 r/min增加到200 r/min時,酵母的干重隨之增加,但轉(zhuǎn)速在140～200 r/min之間變化趨勢較為平穩(wěn);當(dāng)轉(zhuǎn)速大于200 r/min時,酵母干重逐漸下降,當(dāng)轉(zhuǎn)速增加到220 r/min時,酵母干重低于180 r/min時的酵母干重,因此選擇酵母培養(yǎng)的最佳轉(zhuǎn)速200 r/min作為響應(yīng)面實驗搖床轉(zhuǎn)速。

圖3　轉(zhuǎn)速對酵母干重的影響Fig.3　Effect of rotational speed on dry weight of yeast

2.2.3搖瓶裝液量對酵母干重的影響由圖4可以看出,當(dāng)搖瓶裝液量從4%～10%時酵母的干重隨之增加,在10%時達(dá)到最大值;當(dāng)裝液量大于10%,酵母干重逐漸下降。從裝液量4%～16%的變化過程中,酵母干重有一個明顯的先增加后減少的趨勢,故選擇搖瓶裝液量為10%較為合理。

圖4　裝液量對酵母干重的影響Fig.4　Effect of broth content on dry weight of yeast

2.2.4初始pH對酵母干重的影響由圖5中可以得出,當(dāng)初始pH由4.2～4.8時,酵母的干重隨之增加,在pH4.8時達(dá)到最大值;當(dāng)初始pH大于4.8時,酵母干重逐漸降低。因此,選擇培養(yǎng)基初始pH為4.8較為適宜。

圖5　pH對酵母干重的影響Fig.5　Effect of pH on dry weight of yeast

2.2.5接種量對酵母干重的影響由圖6可以看出,當(dāng)接種量從4%～8%時,酵母的干重隨之增加,在8%時達(dá)到最大值;當(dāng)菌體接種量大于8%時,酵母干重逐漸下降。因此,選擇菌體接種量8%較為適宜。

圖6　接種量對酵母干重的影響Fig.6　Effect of inoculation amount on dry weight of yeast

表2　響應(yīng)面實驗設(shè)計方案與結(jié)果

2.3響應(yīng)面優(yōu)化實驗

2.3.1實驗結(jié)果與模型建立響應(yīng)面優(yōu)化實驗方案與結(jié)果見表2。利用Design-Expert 8.0.5對表2數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元多元回歸擬合,得到以酵母干重對編碼自變量A、B、C的二次多項回歸方程:酵母干重(g/L)=16.79-1.20A-0.50B-0.18C+3.72AB+0.68AC-0.05BC-4.29A2-2.75B2-1.22C2。對數(shù)學(xué)模型進(jìn)行的方差分析及顯著性結(jié)果見表3。由表3可知,此回歸方程模型極顯著(p<0.0001<0.05),失擬項p=0.8755>0.05,說明該模型失擬性檢驗結(jié)果不顯著,此模型對于實驗數(shù)據(jù)的擬合度較高,實驗誤差較小,該模型可以用于分析和預(yù)測酵母干重的結(jié)果[11]。對于模型回歸方程系數(shù)的顯著性實驗表明,一次項系數(shù)A、B、C,交互系數(shù)AB、AC,二次項系數(shù)A2、B2、C2影響極顯著。F值反映了各個因子對于響應(yīng)值得重要性,F(A)>F(B)>F(C),說明3個影響因子對于酵母干重的影響強(qiáng)弱順序為:裝液量>pH>接種量。

注:*:表示差異顯著,p<0.05;**:表示差異極顯著,p<0.01。

2.3.2響應(yīng)面分析與優(yōu)化根據(jù)上述擬合出的回歸方程繪制響應(yīng)面分析圖,以確定裝液量、pH、接種量3個因素對酵母細(xì)胞干重的影響,響應(yīng)面曲面和等高線圖見圖7～圖9。由圖7～圖9可知,搖瓶裝液量和初始pH、裝液量和接種量的交互作用較強(qiáng),pH與接種量交互作用較弱。該模型預(yù)測的最佳搖瓶發(fā)酵工藝條件為:裝液量8.39%,pH4.69,接種量7.42%,此條件下酵母細(xì)胞干重的預(yù)測值為17.0325 g/L。

圖7　pH、裝液量及其交互作用對酵母干重影響的響應(yīng)面圖Fig.7　Response surface for the effect of pH and liquid volume on dry weight of yeast

圖8　接種量、裝液量及其交互作用對酵母干重影響的響應(yīng)面圖Fig.8　Response surface for the effect of inoculation amount and liquid volume on dry weight of yeast

圖9　接種量、pH及其交互作用對酵母干重影響的響應(yīng)面圖Fig.9　Response surface for the effect of inoculation amount and pH on dry weight of yeast

2.3.3最佳搖瓶發(fā)酵工藝條件的驗證在預(yù)測出最佳工藝條件的基礎(chǔ)上,考慮到實際操作中的簡便性等問題將該條件修正為:培養(yǎng)溫度30 ℃,搖床轉(zhuǎn)速200 r/min,裝液量8.4%,pH4.7,接種量7.4%,在此工藝條件下,重復(fù)實驗3次,得到酵母細(xì)胞干重16.88 g/L,驗證值和模擬值較為接近,說明采用響應(yīng)面法得到的該模型結(jié)果較為可靠[12],擁有一定實用價值。與初始發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)果酵母細(xì)胞干重10.84 g/L相比,優(yōu)化后結(jié)果提高了55.72%。

2.45 L罐中糖蜜流加策略對比實驗

將工藝優(yōu)化后的二級種子液接種于5 L機(jī)械攪拌罐中,通過三種不同的糖蜜流加方式進(jìn)行培養(yǎng),繪制酵母生長曲線實驗結(jié)果見圖10,由圖10可知,0～7 h流加方式不同對于酵母生長沒有產(chǎn)生明顯差別,7 h之后,通過在使用溶氧反饋流加方式補(bǔ)充糖蜜條件下,酵母的生長情況明顯優(yōu)于恒速流加與間歇流加方式,在26 h發(fā)酵結(jié)束時,利用溶氧反饋流加培養(yǎng)的酵母最大濕重為143.95 g/L。

圖10　三種不同流加方式對酵母菌體濃度的影響Fig.10　The effects of three different feedingmethods on yeast concentration

溶氧反饋式流加是一種底物限制性流加方式。在糖蜜限制培養(yǎng)的條件下,補(bǔ)入的葡萄糖很快會被菌體利用,根據(jù)菌體的底物比消耗速率的改變,溶氧也隨之改變。因此,隨著糖蜜的不斷流加,溶氧處于振蕩狀態(tài),能夠給予菌體生長一定的氧氣,有利于菌體的快速增殖,同時可有效避免副產(chǎn)物積累。與恒溶氧流加比較,恒速流加方式下,菌體增長較慢,酵母濕重稍小[13]。這是因為補(bǔ)料初期糖蜜濃度充足,有利于細(xì)胞生長,但補(bǔ)料后期,糖蜜濃度較低,菌體生長所需要的碳源無法及時供應(yīng),使得在細(xì)胞生長最旺盛時,沒有及時補(bǔ)加充足的營養(yǎng)和氧氣,從而導(dǎo)致酵母菌體的生產(chǎn)強(qiáng)度減弱,效率降低[14]。而間歇流加方式是一種每隔一段時間一次性補(bǔ)入較多的糖蜜的方式,其在罐內(nèi)的糖濃度容易產(chǎn)生殘留,且瞬時殘?zhí)禽^高,波動較大,造成底物抑制,菌體生長也就變得緩慢且生產(chǎn)效率低[15]。

3　結(jié)論

對耐高糖面包酵母的培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化,在單因素實驗的基礎(chǔ)上,利用響應(yīng)面優(yōu)化的方法確定了其二級種子最佳工藝條件:培養(yǎng)溫度30 ℃,搖床轉(zhuǎn)速200 r/min,裝液量8.4%,pH4.7,接種量7.4%,在此工藝條件下,與優(yōu)化前的初始發(fā)酵條件下培養(yǎng)的酵母細(xì)胞干重10.84 g/L相比,優(yōu)化后結(jié)果提高了55.72%。而在酵母上罐培養(yǎng)階段,實驗發(fā)現(xiàn)相比于恒速流加和間歇流加,以溶氧反饋流加方式補(bǔ)充糖蜜更有利于酵母的快速繁殖,上罐過程中最大菌體濕重為143.95 g/L。

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Optimization of fermentation process of sugar-tolerant bread yeast

DOU Bing-ran1,GUO Hui-ming1,LUO Hai-yan2,HONG Hou-sheng2,3,*

(1.Nanjing Tech University,College of Chemistry and Molecular Engineering,Nanjing 211816,China;2.Nanjing Tech University,College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering,Nanjing 211816,China;3. Nanjing Highke Bioengineering Equipment Co.,Ltd.,Nanjing 210009,China)

In order to optimize the sugar-tolerant bread yeast fermentation process,the conditions including fermentation temperature,rotation speed,liquid volume,initial pH,inoculation amount were optimized by experiment of single factor at first. Based on the experimental result,liquid volume,initial pH,inoculation amount were chosen to study on response surface optimization. The experimental results indicated that the optimum conditions were as follows:temperature at 30 ℃,rotation speed 200 r/min,8.4% liquid volume,pH4.7,7.4% inoculation amount. The condition increased dry weight of yeast by 55.72%. At the same time,by making growth curve to compare three methods including dissolved oxygen feedback feeding,constant feeding,intermittent feeding in 5.0 L mechanical stirring fermentation tank. It showed that the dissolved oxygen feedback feeding is best and the maximum wet yeast weight reached 143.95 g/L,the experiment reached the level of high density fermentation of sugar-tolerant bread yeast,and determine the optimal feeding mode of yeast.

sugar-tolerant bread yeast;response surface method;feeding cultivation;optimization

2016-03-24

竇冰然(1991-)，女，碩士研究生，研究方向：食品發(fā)酵與分析檢測，E-mail:835066485@qq.com。

洪厚勝(1965-)，男，博士，教授，研究方向：生物過程及生化反應(yīng)設(shè)備， E-mail:hhs@njtech.edu.cn。

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃(863計劃)-生物過程關(guān)鍵技術(shù)及裝備開發(fā)(2012AA021201)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)18-0208-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.18.031