蔣德生，李海英，于　冰，陳思學(xué)，馬春泉,*

(黑龍江大學(xué) a. 生命科學(xué)學(xué)院; b. 黑龍江省普通高等學(xué)校分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；c. 農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心，哈爾濱 150080)

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甜菜M14品系BvM14-APX、BvM14-DHAR3、BvM14-MDAR基因響應(yīng)NaCl脅迫的表達(dá)分析

蔣德生a,b,c，李海英a,b,c，于冰a,b,c，陳思學(xué)a,b,c，馬春泉a,b,c,*

(黑龍江大學(xué) a. 生命科學(xué)學(xué)院; b. 黑龍江省普通高等學(xué)校分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；c. 農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心，哈爾濱 150080)

甜菜M14品系是在二倍體栽培甜菜染色體組上附加野生白花甜菜第9號(hào)染色體的單體附加系，具有耐鹽性、無(wú)融合生殖等優(yōu)良性狀，是發(fā)掘優(yōu)質(zhì)基因資源的良好研究材料。實(shí)驗(yàn)室前期已利用 iTRAQ串聯(lián)LC-MS/MS技術(shù)獲得0、200、400 mM NaCl脅迫下葉中差異表達(dá)蛋白質(zhì)76個(gè)；與利用Hiseq 2000高通量測(cè)序技術(shù)構(gòu)建的NaCl(0、200、400 mM)脅迫下甜菜M14品系轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)相匹配，得到了3條參與抗氧化酶系統(tǒng)的BvM14-APX、BvM14-DHAR3及BvM14-MDAR的Unigenes序列。對(duì)3條Unigenes序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析；采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)0、200、400 mM NaCl脅迫下葉和根中的3條基因進(jìn)行組織特異性分析，探究3條基因在葉和根中的表達(dá)趨勢(shì)，并比較了葉中3條基因在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平的表達(dá)量變化是否一致，借以評(píng)估3條基因?qū)aCl脅迫的響應(yīng)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果表明，BvM14-APX基因在200 mM NaCl脅迫下葉和根中分別上調(diào)21.56、3.56倍；400 mM NaCl脅迫下葉和根中分別上調(diào)51.27、11.47倍。BvM14-DHAR3基因在200 mM NaCl脅迫下葉和根中分別上調(diào)14.52、1.83倍；400 mM NaCl脅迫下葉和根中分別上調(diào)22.78、5.1倍。BvM14-MDAR基因在200 mM NaCl脅迫下葉和根中分別上調(diào)29.04、1.33倍；400 mM NaCl脅迫下葉和根中分別上調(diào)59.3、3.81倍。3條基因在響應(yīng)NaCl脅迫過(guò)程中，葉中的表達(dá)量變化均顯著于根，同時(shí)葉中轉(zhuǎn)錄水平與蛋白表達(dá)水平的變化具有一致性，說(shuō)明這3條基因在抗氧化酶系統(tǒng)中起到了重要的作用，這也為進(jìn)一步探究BvM14-APX、BvM14-DHAR3及BvM14-MDAR基因間互作關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。

甜菜M14品系；NaCl脅迫；實(shí)時(shí)熒光定量PCR

甜菜M14品系是在二倍體栽培甜菜(BetavulgarisL.)染色體組上附加野生白花甜菜(BetacorollifloraZoss.)第9號(hào)染色體的甜菜單體附加系[1]。經(jīng)鑒定甜菜M14品系具有野生白花甜菜的一些優(yōu)良性狀，如耐鹽性、無(wú)融合生殖等[2-5]，是發(fā)掘優(yōu)質(zhì)基因資源的良好研究材料。

APX(Ascorbate perxidase，APX)作為抗壞血酸谷胱甘肽循環(huán)中的關(guān)鍵酶，直接還原植物細(xì)胞內(nèi)過(guò)度積累的H2O2，從而消除植株體內(nèi)ROS積累所帶來(lái)的損傷[6]；DHAR(Dehydroascorbate reductase，DHAR)作為此循環(huán)中的限速酶調(diào)控抗壞血酸(Ascorbic acid，AsA)的含量，同時(shí)維持著植株體內(nèi)氧化還原平衡[7]；MDAR(Monodehydroascorbate reductase，MDAR)調(diào)控植株中AsA的含量，并保持其抗氧化特性[8]。APX、DHAR及MDAR作為抗壞血酸谷胱甘肽循環(huán)中清除H2O2的主要酶類，也同時(shí)調(diào)節(jié)著植物體內(nèi)抗壞血酸的含量。3者直接參與植物體內(nèi)過(guò)量積累ROS的清除機(jī)制(圖1)。

圖1　APX、DHAR及MDAR參與植物的ROS清除機(jī)制 Fig.1　ROS scavenging mechanism including ascorbate peroxidase, dehydroascorbate reductase, monodehydroascorbate reductase in plant

課題組前期對(duì)甜菜M14品系蛋白質(zhì)組及轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了深入研究，利用iTRAQ串聯(lián)LC-MS/MS 技術(shù)定性和定量研究了甜菜M14品系NaCl(0、200、400 mM)脅迫下差異表達(dá)蛋白質(zhì)，在葉中鑒定出76個(gè)差異表達(dá)蛋白[9-10]。同時(shí)，利用Hiseq 2000高通量測(cè)序技術(shù)構(gòu)建了NaCl(0、200、400 mM)脅迫下甜菜M14品系葉和根的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)。綜合上述研究得出NaCl脅迫下甜菜M14品系參與活性氧(Reactive oxygen species，ROS)清除機(jī)制的BvM14-APX、BvM14-DHAR3及BvM14-MDAR基因的蛋白表達(dá)量變化最為顯著。

本研究通過(guò)將3個(gè)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)序列與前期獲得的甜菜M14品系轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)相匹配，篩選出甜菜M14品系BvM14-APX、BvM14-DHAR3及BvM14-MDAR的Unigenes序列并進(jìn)行生物信息學(xué)分析；采用實(shí)時(shí)熒光定量對(duì)NaCl(0、200、400 mM)脅迫下甜菜M14品系葉和根中基因的表達(dá)量進(jìn)行組織特異性分析，探究3條基因在甜菜M14品系葉和根中表達(dá)量的變化趨勢(shì)，并比較3者在葉中蛋白水平及轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)量變化趨勢(shì)的一致性，評(píng)估這3條基因在抗氧化酶系統(tǒng)中的重要作用。

1　材料與方法

1.1植物材料

甜菜M14品系(專利號(hào)：CN1263695A)種植于黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)田。

1.2主要試劑

SYBR Premix EXTaqTMII(Perfect Real Time)試劑盒與RNA PCR Kit(AMV)Ver 3.0 試劑盒均購(gòu)自TaKaRa公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物由上海生物工程有限公司合成。

1.3基因功能預(yù)測(cè)

利用NCBI本地化BLAST軟件，以前期甜菜M14品系蛋白質(zhì)及轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)為基礎(chǔ)，篩選出BvM14-APX、BvM14-DHAR3及BvM14-MDAR的Unigenes序列，并利用NCBI與UniProt在線網(wǎng)站進(jìn)行基因功能預(yù)測(cè)。

1.4基因熒光定量設(shè)計(jì)引物

通過(guò)使用AlleleID 6.0軟件設(shè)計(jì)BvM14-APX、BvM14-DHAR3及BvM14-MDAR基因的cDNA全長(zhǎng)序列實(shí)時(shí)熒光定量特異引物：

BvM14-APXs(正向引物)：5′-GTATGGAAGAGTGGAGGTGAC-3′

BvM14-APXas(反向引物)：5′-TAGATGTTGAGCAGGTGAAGG-3′

BvM14-DHAR3s(正向引物)：5′-CGGTTCCTGACTCACTTCC-3′

BvM14-DHAR3as(反向引物)：5′-CAGCCAGCAACGACATCC-3′

BvM14-MDARs(正向引物)：5′-CTGATATTGTGATTGTTGGTGTTG-3′

BvM14-MDARas(反向引物)：5′-AAGGCATCGGTCTTGATTCC-3′

根據(jù)吳川等[11]設(shè)計(jì)用于作為內(nèi)參的18S rRNA管家基因熒光定量特異引物：

18S-s：5′-TGACGGAGAATTAGGGTTCG-3′

18S-as：5′-CCCCAATGGATCCTCGTTA-3′

1.5甜菜M14品系葉及根RNA提取

采用TRIzol一步法提取0、200、400 mM NaCl處理下甜菜M14品系葉和根的總RNA[12]。利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA樣品260 nm和280 nm下的吸光值，并通過(guò)1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行完整性驗(yàn)證。

1.6反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA

使用RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0分別擴(kuò)增并合成0、200、400 mM NaCl脅迫下甜菜M14品系葉和根cDNA。反轉(zhuǎn)錄PCR程序如下：30 ℃，10 min；42 ℃，30 min；99 ℃，5 min；5 ℃，5 min；1 cycle。

1.7實(shí)時(shí)熒光定量PCR

使用SYBR Premix EXTaqTMII(Perfect Real Time)試劑盒進(jìn)行3條基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR，實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系(35.0 μL)如下：SYBR Premix EXTaqTMII(2×)17.5 μL、甜菜M14品系葉和根cDNA模板3.5 μL、正向及反向引物各1.4 μL、ddH2O補(bǔ)至35.0 μL。擴(kuò)增反應(yīng)：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s；59 ℃ 1 min；72 ℃ 30 s循環(huán)40次。每組同時(shí)進(jìn)行陰性及陽(yáng)性對(duì)照，反應(yīng)體系同上。

1.8數(shù)據(jù)的處理及分析

通過(guò)比較-ΔΔCt值對(duì)NaCl脅迫下甜菜M14品系葉和根中的熒光定量數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)算公式為ΔΔCt =(Ct.差異基因-Ct.內(nèi)參基因)Timex-(Ct.差異基因 - Ct.內(nèi)參基因)Time0，并通過(guò)計(jì)算2-ΔΔCt值來(lái)反映NaCl脅迫下BvM14-APX、BvM14-DHAR3及BvM14-MDAR基因在葉及根中的相對(duì)表達(dá)量。每個(gè)反應(yīng)體系均設(shè)有3次技術(shù)重復(fù)及3次生物學(xué)重復(fù)。

2　結(jié)果與分析

2.1甜菜M14品系BvM14-APX、BvM14-DHAR3及 BvM14-MDAR基因的生物信息學(xué)分析

課題組前期利用iTRAQ串聯(lián)LC-MS/MS技術(shù)定性和定量研究甜菜M14品系NaCl(0、200、400 mM)脅迫下差異表達(dá)蛋白質(zhì)的信息見(jiàn)表1。利用NCBI本地化BLAST軟件，以前期得到的甜菜M14品系轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)為底庫(kù)，篩選并獲得BvM14-APX、BvM14-DHAR3及BvM14-MDAR的 Unigenes序列，通過(guò)使用NCBI BLASTn在線預(yù)測(cè)BvM14-APX的Unigene序列(gi|118572830, Unigene15519_R)功能，其完整開(kāi)放閱讀框753 bp，共編碼250個(gè)氨基酸，使用UniProt在線預(yù)測(cè)BvM14-APX基因所編碼的蛋白位于葉綠體類及線粒體，屬于一類L型抗壞血酸過(guò)氧化物酶，并以AsA為電子供體來(lái)實(shí)現(xiàn)H2O2的還原反應(yīng)[13]，并可將AsA氧化為不穩(wěn)定的單脫氫抗壞血酸(Monodehydroascorbate，MDA)，因而，此酶的活性高低可在一定程度上影響AsA表達(dá)程度的高低[14]；同理預(yù)測(cè)BvM14-DHAR3 的Unigene序列(gi|75330001, Unigene15550_R)功能，其完整開(kāi)放閱讀框807 bp，共編碼268個(gè)氨基酸，在線預(yù)測(cè)所編碼的蛋白位于葉綠體，其可利用谷胱甘肽(Glutathione，GSH)將脫氫抗壞血酸(Dehydroascorbate reductase，DHA)還原為AsA，維持細(xì)胞內(nèi)AsA再生，同時(shí)也是維持細(xì)胞并使其處于還原狀態(tài)的限速酶，控制細(xì)胞內(nèi)AsA的總量及維持植物體氧化還原平衡[15-16]；同理預(yù)測(cè)BvM14-MDARUnigene序列(gi|50400860, Unigene16472_R)功能，其完整開(kāi)放閱讀框1 302 bp，共編碼433個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)其所編碼的蛋白質(zhì)位于細(xì)胞質(zhì)，其可進(jìn)一步將MDA還原再生成AsA，并作為AsA回補(bǔ)途徑的關(guān)鍵酶，借以維持植物細(xì)胞內(nèi)抗壞血酸的平衡[16-17]。通過(guò)NCBI BLASTp在線預(yù)測(cè)BvM14-APX、BvM14-DHAR3及BvM14-MDAR氨基酸序列的保守結(jié)構(gòu)域，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可見(jiàn)，BvM14-APX具有抗壞血酸過(guò)氧化物酶結(jié)構(gòu)域，屬于植物過(guò)氧化物酶類超家族；BvM14-DHAR3屬于谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶家族，具有其N-末端及C-末端保守結(jié)構(gòu)域；BvM14-MDAR具有吡啶二硫酸核苷酸氧化還原酶結(jié)構(gòu)域。

表1利用iTRAQ串聯(lián)LC-MS/MS技術(shù)鑒定NaCl脅迫下甜菜M14品系抗氧化酶系統(tǒng)中表達(dá)量顯著的3種酶

Table 1Significantly expression three enzymes in antioxidant enzyme system of sugar beet M14 identified by iTRAQ LC-MS/MS in antioxidase system under NaCl stress

NCBI蛋白質(zhì)注冊(cè)編號(hào)蛋白質(zhì)名稱物種蛋白質(zhì)定位200mM蛋白上調(diào)變化倍數(shù)400mM蛋白上調(diào)變化倍數(shù)gi|118572830Chloroplastic/mitochondrialL-ascorbateperoxidaseSArabidopsisthali-anaChloroplastMitochondrion0.610.73gi|75330001GlutathioneS-transferaseDHAR3Arabidopsisthali-anaChloroplastic-2.10gi|50400860Monodehydroascorbatereduc-taseSolanumlycopersi-cumCytoplasm-1.49

A：BvM14-APX 氨基酸序列; B：BvM14-DHAR3氨基酸序列; C：BvM14-MDAR氨基酸序列圖2　BvM14-APX、BvM14-DHAR3、BvM14-MDAR氨基酸序列保守結(jié)構(gòu)域分析Fig. 2　Analysis of amino acid conservative regions of BvM14-APX, BvM14-DHAR3 and BvM14-MDAR

2.2甜菜M14品系葉和根RNA的提取

0、200、400 mM NaCl脅迫下甜菜M14品系葉及根RNA濃度分別為1.563、1.752、1.694、2.103、1.983、1.864 μg/μL，A260/A280比值分別為1.801、1.874、1.882、1.903、1.857、1.896。通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)葉及根RNA進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果見(jiàn)圖3，條帶清晰明顯，說(shuō)明甜菜M14品系葉和根中RNA濃度及純度可用于反轉(zhuǎn)錄cDNA。

圖3　0、200、400 mM NaCl脅迫下甜菜M14品系葉及根RNA鑒定Fig.3　Total RNA in M14 leaves and roots under 0, 200, 400 mM NaCl stress

2.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR熔解曲線

以甜菜M14品系BvM14-18S為內(nèi)參基因，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-Time PCR)技術(shù)鑒定BvM14-APX、BvM14-DHAR3及BvM14-MDAR基因在0、200、400 mM NaCl脅迫下甜菜M14品系葉和根中實(shí)時(shí)熒光定量PCR轉(zhuǎn)錄表達(dá)的溶解曲線見(jiàn)圖4。

圖4　BvM14-APX, BvM14-DHAR3和BvM14-MDAR基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR溶解曲線Fig.4　Real-time PCR melting curve of BvM14-APX, BvM14-DHAR3 and BvM14-MDAR

隨著溫度的升高，雙鏈漸變?yōu)閱捂?，?dǎo)致熒光染料的分離，整個(gè)過(guò)程所產(chǎn)生的峰型單一且無(wú)雜峰，證明特異性熒光引物沒(méi)有產(chǎn)生二聚體或發(fā)卡結(jié)構(gòu)，且操作過(guò)程中未出現(xiàn)雜質(zhì)污染的現(xiàn)象(圖3)，說(shuō)明甜菜M14葉和根cDNA模板及實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物可用于3條基因的組織特異性表達(dá)。

2.4BvM14-APX、BvM14-DHAR3及 BvM14-MDAR基因的組織特異性表達(dá)

通過(guò)對(duì)0、200、400 mM NaCl脅迫下甜菜M14品系葉和根BvM14-APX、BvM14-DHAR3及BvM14-MDAR基因的表達(dá)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，根據(jù)輸出得到的Ct值，計(jì)算獲得-ΔΔCt值，借以反應(yīng)不同基因在NaCl脅迫下葉和根的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果見(jiàn)圖5。

(a)、(c)、(e)：葉中BvM14-APX、BvM14-DHAR3、BvM14-MDAR基因相對(duì)表達(dá)量;(b)、(d)、(f)：根中BvM14-APX、BvM14-DHAR3、BvM14-MDAR基因相對(duì)表達(dá)量圖5　NaCl脅迫下甜菜M14品系葉和根中BvM14-APX、BvM14-DHAR3、BvM14-MDAR基因的組織特異性表達(dá)Fig.5　Detection the expression level of M14 line BvM14-APX、BvM14-DHAR3、BvM14-MDAR in leaves and roots under NaCl stress

根據(jù)所得實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，相比于0 mM NaCl脅迫組，200 mM NaCl脅迫組葉中BvM14-APX基因的表達(dá)量上調(diào)21.56倍，而400 mM NaCl脅迫組葉中的表達(dá)量上調(diào)51.27倍；200 mM NaCl脅迫組根中BvM14-APX基因的表達(dá)量上調(diào)3.56倍，400 mM NaCl脅迫組根中的表達(dá)量上調(diào)11.47倍。BvM14-APX基因在葉中表達(dá)量變化的趨勢(shì)要比在根中的變化趨勢(shì)明顯，且隨著NaCl脅迫濃度的升高，葉中轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)量呈上升趨勢(shì)，這與實(shí)驗(yàn)室前期得到的甜菜M14品系葉中BvM14-APX基因蛋白水平的表達(dá)量變化趨勢(shì)相一致。

相比于0 mM NaCl脅迫組，200 mM NaCl脅迫組葉中BvM14-DHAR3基因的表達(dá)量上調(diào)14.52倍，400 mM NaCl脅迫組葉中表達(dá)量上調(diào)22.78倍；200 mM NaCl脅迫組根中BvM14-DHAR3基因的表達(dá)量上調(diào)1.83倍，400 mM NaCl脅迫組根中的表達(dá)量上調(diào)5.1倍。BvM14-DHAR3基因在葉中表達(dá)量的變化趨勢(shì)比根中表達(dá)量變化趨勢(shì)明顯，葉中BvM14-APX基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)量變化趨勢(shì)與葉中蛋白水平的表達(dá)量變化趨勢(shì)相一致。

BvM14-MDAR基因相比于0 mM NaCl脅迫組，在200 mM NaCl脅迫組葉中的表達(dá)量上調(diào)29.04倍，而在400 mM NaCl脅迫組葉中的表達(dá)量上調(diào)59.3倍；根中200 mM NaCl脅迫組上調(diào)1.33倍，400 mM NaCl脅迫組上調(diào)3.18倍，葉中表達(dá)量變化趨勢(shì)較根中要更加明顯，且葉中蛋白水平表達(dá)量的變化趨勢(shì)與轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)量變化趨勢(shì)相符。

3　結(jié)　論

Ishikawa K等人[18]研究表明葉綠體內(nèi)源產(chǎn)生的H2O2是通過(guò)APX酶分解的，即在葉綠體基質(zhì)及類囊體表面作為還原劑清除H2O2，而DHAR和MDAR也作為抗壞血酸谷胱甘肽循環(huán)(AsA-GSH)中的關(guān)鍵酶調(diào)控抗壞血酸的再生并維持抗壞血酸的抗氧化特性，借以保護(hù)葉綠體維持正常的光合能力[19]。甜菜M14品系葉和根中BvM14-APX、BvM14-DHAR3及BvM14-MDAR基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)量變化均隨著NaCl脅迫濃度的增加而呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，且葉中上調(diào)趨勢(shì)較根中顯著。筆者認(rèn)為BvM14-DHAR3作為葉中高效表達(dá)抗壞血酸谷胱甘肽循環(huán)中的限速酶調(diào)控BvM14-MDAR以回補(bǔ)AsA，這為BvM14-APX清除植物體內(nèi)過(guò)量積累的H2O2提供了先決條件，從而使得甜菜M14品系具有較強(qiáng)的抗鹽能力。

隨著NaCl脅迫濃度的增高，甜菜M14品系葉中BvM14-APX、BvM14-DHAR3及BvM14-MDAR基因轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)量與前期實(shí)驗(yàn)室定量蛋白質(zhì)組學(xué)獲得的葉中差異蛋白表達(dá)量表現(xiàn)出一致的上升趨勢(shì)，推測(cè)這3條基因可能通過(guò)降解葉中活性氧含量，借以降低細(xì)胞膜的通透性，從而抑制過(guò)量Na+與細(xì)胞膜上Ca2+間的置換[19]，進(jìn)而抑制Na+由導(dǎo)管運(yùn)輸作用進(jìn)入植株，實(shí)現(xiàn)植株抵御NaCl脅迫產(chǎn)生的次級(jí)氧化脅迫的目的。

綜合BvM14-APX、BvM14-DHAR3及BvM14-MDAR基因在轉(zhuǎn)錄組水平及蛋白質(zhì)水平的結(jié)果，甜菜M14品系抗氧化酶系統(tǒng)中的3條基因在響應(yīng)NaCl脅迫中起到了重要的作用，這為進(jìn)一步探討甜菜M14品系NaCl脅迫下3條基因間互作關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。

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Expression analysis of BvM14-APX，BvM14-DHAR3 and BvM14-MDAR responsive to NaCl stress in sugar beet M14 line

JIANG De-Shenga,b,c，LI Hai-Yinga,b,c，YU Binga,b,c，CHEN Si-Xuea,b,c，MA Chun-Quana,b,c,*

(HeilongjiangUniversitya.CollegeofLifeSciences;b.KeyLaboratoryofMolecularBiologyofHeilongjiangProvince;c.EngineeringResearchCenterofAgriculturalMicrobiologyTechnology,Harbin150080,China)

Sugar beet monosomic addition line M14 is a unique germplasm, which contains theBetavulgarisL. genome with the addition of chromosome 9 ofBetacorollifloraZoss.. The M14 line exhibits some good phenotypes such as tolerance to salt stress and apomixes. It is a high quality genetic material to explore good genes resources. In previous study, iTRAQ LC-MS/MS had been employed to identify 76 differential expression proteins in leaves under 0, 200, 400 mM NaCl stress. Combining a new generation of Hiseq 2000 high-throughput sequencing technology, transcriptome database of M14 under 0, 200 and 400 mM NaCl had been built and matched each other. ThreeBvM14-APX,BvM14-DHAR3 andBvM14-MDARUnigenes involved in antioxidant enzyme system had been obtained. This study, three unigenes sequences had been analyzed by bioinformatics method. The tissue specificity analysis of three genes in M14 leaves and roots under 0, 200 and 400 mM NaCl stress had been detected by Real-time PCR. In order to explore the expression trend of three genes in leaves and roots, we compared the transcription level and protein expression level whether were consistent or not, which evaluated the level of three genes response to salt stress. The conclusion of Real-time PCR have showed that compared with control, the expression ofBvM14-APXgene was upregulated 21.56 and 3.56 times respectively in leaves and roots under 200 mM NaCl stress. What is more, it also had the same trend under 400 mM NaCl treatment with the times of 51.27, 11.47. And the expression ofBvM14-DHAR3 gene was also up-regulated 14.52 times and 1.83 times in leaves and roots under 200 mM NaCl treatment. As the same trend under 400 mM NaCl stress treatment, it was up-regulated 22.78 times and 5.1 times. Moreover, the expression ofBvM14-MDARgene showed 29.04 times and 1.33 times increase under 200 mM NaCl treatment. Under 400 mM NaCl treatment, the multiples are 59.3 and 3.81. To three genes in response to NaCl stress, the expression trends of the three genes in leaves were more significant compared in roots and the trends of transcription level and protein expression level of the three genes in leaves were consistent, which illuminated that three genes played an important role in the antioxidant enzyme system. The research opened a new path for the interaction relationship amongBvM14-APX,BvM14-DHAR3 andBvM14-MDARgenes.

Sugar beet M14; NaCl stress; Real-time PCR

10.13524/j.2095-008x.2016.02.028

2016-04-30

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31471552、31401441、31501359)；黑龍江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(C2015026、C201202)；黑龍江省高校創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)計(jì)劃項(xiàng)目(2014TD004)；黑龍江大學(xué)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)計(jì)劃項(xiàng)目(hdtd2010-05)；黑龍江省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(201510212909)

蔣德生(1991-)，男，江蘇南京人，碩士研究生，研究方向：植物分子生物學(xué)，E-mail:jiangdesheng50@163.com；*通訊作者：馬春泉(1980-)，男，黑龍江呼蘭人，副教授，博士，研究方向：植物分子生物學(xué)，E-mail：chqm0913@163.com。

O436

A

2095-008X(2016)02-0064-08