董微微，方洪壯，欒　芳,*

( 1．佳木斯大學 藥學院，黑龍江 佳木斯154007；2．黑龍江省鶴崗市食品藥品檢測中心，黑龍江 鶴崗 154100;3．黑龍江省生物藥制劑重點實驗室，黑龍江 佳木斯 154007)

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測定氨咖黃敏膠囊3種成分含量的新方法

董微微1,2，方洪壯1,3，欒芳1,3,*

( 1．佳木斯大學 藥學院，黑龍江 佳木斯154007；2．黑龍江省鶴崗市食品藥品檢測中心，黑龍江 鶴崗 154100;3．黑龍江省生物藥制劑重點實驗室，黑龍江 佳木斯 154007)

建立高效液相色譜法(HPLC)“一測多評”法測定氨咖黃敏膠囊中3種有效成分的含量，以對乙酰氨基酚為內(nèi)標物，建立該成分與咖啡因、馬來酸氯苯那敏的相對校正因子并計算此3種成分的含量。同時采用外標法測定，兩種測試結(jié)果無顯著差異，RSD<0.78%，表明建立的“一測多評”法測定氨咖黃敏膠囊中的對乙酰氨基酚、咖啡因、馬來酸氯苯那敏，準確可行。

高效液相色譜法(HPLC)；一測多評(QAMS)；氨咖黃敏膠囊；相對校正因子

“一測多評”法( quantitative analysis of multi-components by single marker，QAMS)[1]，是一種用于多組分質(zhì)量控制的研究方法，以樣品中某一組分作為內(nèi)標物，建立該內(nèi)標物與其它組分間的相對校正因子，并利用相對校正因子計算其它組分的含量，此方法在降低檢測成本的同時解決了對照品供需不足的問題。

氨咖黃敏膠囊為臨床常用抗感冒藥，是由咖啡因、馬來酸氯苯那敏、對乙酰氨基酚、人工牛黃及其它輔料組成的復方制劑，國家現(xiàn)行質(zhì)量標準中采用容量分析法測定咖啡因和對乙酰氨基酚的含量[2-3]，操作過程繁瑣，影響因素較多，測定結(jié)果誤差較大，而且該標準中沒有控制馬來酸氯苯那敏成分的含量[4]。

本研究建立了HPLC法同時測定氨咖黃敏膠囊中咖啡因、馬來酸氯苯那敏、對乙酰氨基酚3種成分的含量。為了提高檢測效率、降低檢測成本，應用“一測多評”法對氨咖黃敏膠囊進行多指標質(zhì)量控制，以對乙酰氨基酚對照品為內(nèi)標物，通過建立其與咖啡因、馬來酸氯苯那敏的相對校正因子，進行含量計算，結(jié)果準確可靠。

1　儀器與試藥

SHIMADZU LC-2010A HT高效液相色譜系統(tǒng)，LC solutionlite色譜工作站，Waters e2695高效液相色譜系統(tǒng)，Empower工作站；電子天平Mettler Toledo XS205；Waters symmetry C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)，Alltima C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)，Wates sunfire C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)，Agilent C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)；乙腈、磷酸為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。對乙酰氨基酚(100018-200408)、馬來酸氯苯那敏(100047-200606)和咖啡因(171215-200608)均購于中國藥品生物制品檢定所，7個批次氨咖黃敏膠囊樣品購于3個不同廠家。

2　方法與結(jié)果

2.1一測多評的方法學考察

2.1.1色譜條件

色譜柱:Waters symmetry C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)，Alltima C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)，Waters sunfire C18(4.6 mm×150 mm，5 μm), Agilent C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)。流動相:磷酸鹽緩沖液—乙腈(65:35)，柱溫30 ℃，流速1.0 mL·min-1，檢測波長(λ) 227 nm，進樣量10 μL。在上述色譜條件下，理論塔板數(shù)以各組分色譜峰計均不低于4 000，各組分之間的分離度大于1.5，對照品和供試品的HPLC圖見圖1。

圖1　對照品和供試品的HPLC圖Fig.1　HPLC chromatograms of reference and sample

2.1.2對照品溶液的制備

精密稱取對照品對乙酰氨基酚和咖啡因適量，置同一容量瓶中，用流動相溶解并定量稀釋制成1 mL中約含對乙酰氨基酚2.5 mg、咖啡因0.15 mg的溶液，作為對照品儲備液I；精密稱取對照品馬來酸氯苯那敏適量，用流動相溶解并定量稀釋使1 mL對照品儲備液II中約含馬來酸氯苯那敏0.01 mg。

2.1.3供試品溶液的制備

取氨咖黃敏膠囊內(nèi)容物，研細，精密稱取適量，加流動相適量溶解后定容至100 mL，搖勻濾過，精密量取濾液5 mL，用流動相稀釋并定容至25 mL，搖勻。

2.1.4專屬性試驗

取處方中除咖啡因、對乙酰氨基酚、馬來酸氯苯那敏外的其它原輔料，按照供試品溶液的制備方法制備陰性對照溶液，在上述色譜條件下進樣10 μL，取對照品溶液同法操作，結(jié)果表明其它原輔料對對乙酰氨基酚、咖啡因和馬來酸氯苯那敏的含量測定無干擾。

2.1.5線性范圍

精密量取2.1.2中制備的對照品儲備液I、II各1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL，用流動相稀釋并定容至10 mL，搖勻。取上述溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，按照2.1.1中的色譜條件，以峰面積(Y)對進樣濃度(x)進行線性回歸，得：對乙酰氨基酚Y=18 078x+281 408，r2=0.999 7，線性范圍2.405 2～7.215 6 μg；咖啡因Y=20 573x+19 189，r2=0.999 9，線性范圍0.159 1～0.477 3 μg；馬來酸氯苯那敏Y=17 835x-719，r2=0.999 8，線性范圍0.010 45～0.031 35 μg。

2.1.6穩(wěn)定性試驗

精密吸取供試品溶液10 μL，于配制后 0、2、4、8 、12 h 分別進行測定，對乙酰氨基酚、咖啡因、馬來酸氯苯那敏色譜峰峰面積RSD分別為0.34%、0.22%、0.25% (n=5)，表明供試品溶液在室溫12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.7精密度試驗

取同一供試品溶液，按照上述色譜條件，連續(xù)進樣6次，咖啡因、對乙酰氨基酚、馬來酸氯苯那敏在HPLC儀器上的色譜峰面積RSD分別為0.2%，0.1%， 0.5%，表明儀器精密度良好。

2.1.8重復性試驗

取同一批次氨咖黃敏膠囊(哈藥集團三精千鶴制藥有限公司，批號：20150402)6份，精密稱定，按2.1.3制備供試品溶液，在2.1.1色譜條件下進樣測定百分含量，咖啡因、對乙酰氨基酚、馬來酸氯苯那敏平均質(zhì)量分數(shù)分別為92.0%、100.1%、96.9% ，RSD分別為0.46%、0.45%、0.87%，表明此方法重復性良好。

2.1.9加樣回收率試驗

按照處方比例，精密稱取相當于處方量80%、100%和120%的對乙酰氨基酚、咖啡因、馬來酸氯苯那敏對照品，分別加入相應量的混合輔料及其它組分，按2.1.3制成供試品溶液，以2.1.1中色譜條件測得咖啡因、對乙酰氨基酚、馬來酸氯苯那敏的平均加樣回收率分別為99.9%、100.0%、99.8%；RSD值分別為0.46%、0.34%、0.82%，表明此方法加樣回收率較好。

2.2相對校正因子的確定

2.2.1相對校正因子計算

按2.1.2制成6組對照品儲備液，分別精密量取對照品儲備液I、II各1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL，用流動相稀釋并定容至10 mL，搖勻。取上述溶液各10 μL，分別注入液相色譜儀，測定各組分的峰面積。

按照相對校正因子的計算公式：fsi=fs/fi=AsCi/AiCs(式中Cs為內(nèi)標物濃度；Ci為待測成分i的濃度；As為內(nèi)標物峰面積；Ai為待測成分i的峰面積)[5]，分別計算內(nèi)標物對乙酰氨基酚與咖啡因、馬來酸氯苯那敏之間的相對校正因子。每組對照品儲備液稀釋成5個濃度，每個濃度分別計算出相對校正因子后，取平均值作為一個結(jié)果，結(jié)果見表1。

表1　咖啡因、馬來酸氯苯那敏與對乙酰氨基酚之間的相對校正因子

2.2.2不同色譜柱和儀器對校正因子的影響

考察SHIMADZU LC-2010A HT 和Waters e2695兩種高效液相色譜系統(tǒng)，選用Waters symmetry C18(4.6 mm×150 mm, 5 μm)，Alltima C18(4.6 mm×150 mm, 5 μm)，Wates sunfire C18(4.6 mm×150 mm, 5 μm)，Agilent C18(4.6 mm×150 mm, 5 μm)這4種色譜柱，測試并計算的結(jié)果見表2。

表2　不同色譜柱和儀器測得的相對校正因子

2.2.3相對校正因子的確定

綜合影響相對校正因子的上述因素，將各次實驗獲得的相對校正因子取平均值，確定內(nèi)標物對乙酰氨基酚與咖啡因、馬來酸氯苯那敏與之間的相對校正因子分別為1.108 3、1.402 8。

2.3待測組分色譜峰定位

利用相對保留值判斷出待測峰位置，相對保留值的計算公式為：ri/s=tR(i)/tR(s)(i為待測成分，s為內(nèi)標物)，實驗中分別考察不同色譜柱和不同高效液相系統(tǒng)中色譜峰相對保留值的重現(xiàn)性，表3中RSD<5%，說明利用相對保留值法定位待測成分色譜峰可行。

2.4QAMS與外標法結(jié)果比較

分別精密吸取照2.1.3中制備的供試品溶液各10 μL注入高效液相色譜儀進行測定，采用一測多評法和外標法分別計算氨咖黃敏膠囊中咖啡因、對乙酰氨基酚、馬來酸氯苯那敏的含量，并對結(jié)果進行比較(表4)。結(jié)果表明，2種方法測得的咖啡因和馬來酸氯苯那敏的含量沒有顯著差異，RSD<0.78%。

表3　待測組分色譜峰的定位(相對保留值)

表4　“一測多評”法與外標法測定氨咖黃敏膠囊中3種成分結(jié)果比較

注：A哈藥集團三精千鶴制藥有限公司;B亞寶藥業(yè)太原制藥有限公司；C太康海恩藥業(yè)有限公司。

3　討　論

對乙酰氨基酚是氨咖黃敏膠囊中的主要有效成分，且?guī)追N成分中含量最高，測定時產(chǎn)生的誤差相對較小，此外，對乙酰氨基酚對照品廉價易得，因此，本文選用對乙酰氨基酚作為內(nèi)標物對氨咖黃敏膠囊進行HPLC“一測多評”測試3種成分含量。

在一些文獻中，常將馬來酸峰誤認為馬來酸氯苯那敏峰，因此本文參照中國藥典2015年版[6]收載的馬來酸氯苯那敏片含量測定的方法，明確了色譜圖中的馬來酸峰和氯苯那敏峰，且本文中馬來酸氯苯那敏峰的面積均按氯苯那敏峰計算。

本試驗中利用內(nèi)標峰的保留時間和色譜峰保留時間的相對保留值來定位待測成分，能夠準確判斷出目標峰的位置，結(jié)果表明，上述方法進行峰的定位是有效可行的[7]。

4　結(jié)　論

本試驗利用HPLC“一測多評”的方法測定了氨咖黃敏膠囊中3種組分的含量，并討論其在不同濃度、不同色譜柱和不同高效液相色譜儀條件下的相對校正因子，RSD<1%，表明校正因子重復性良好。將校正因子應用于氨咖黃敏膠囊的含量計算，所得結(jié)果與外標法比較并無顯著差異，因此，將校正因子應用于氨咖黃敏膠囊的含量測定具有一定的實際意義。

[1]王智民,高慧敏,付雪濤,等.一測多評法中藥質(zhì)量評價模式方法學研究[J].中國中藥雜志,2006,23(33):1925-1928.

[2]國家藥品標準.化學藥品地方標準上升國家標準·第三冊[S].北京：國家藥典委員會出版社，2002：263.

[3]孫超,崔瀟,成秉辰,等.HPLC法同時測定氨咖黃敏膠囊中3種成分[J].哈爾濱商業(yè)大學學報,2013,29(2):145-147.

[4]范梅娟.HPLC法同時測定小兒氨酚烷胺顆粒中3種成分的含量[J].今日藥學,2011,21(5):291-294.

[5]張靜嬌,劉俊有,季雪.一測多評法測定香丹注射液中丹參素鈉、原兒茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B含量[J].遼寧中醫(yī)藥大學學報,2015,9(17):50-52.

[6]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典2015年版(二部)[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2015:63.

[7]王肖,潘偉東,楊明宇.一測多評法的應用及研究概況[J].承德醫(yī)學院學報,2015(2):157-159.

Quantitative analysis of three kinds of constituents in Ankahuangmin capsule by novel method

DONG Wei-Wei1,2, FANG Hong-Zhuang1,3,LUAN Fang1,3,*

(1．SchoolofPharmacy,JiamusiUniversity,Jiamusi154007,Heilongjiang,China；2．HegangFoodandDrugInspectionCenter,Hegang154100,Heilongjiang,China；3．TheProvincialKeyLaboratoryofBiologicalMedicineFormulation,Jiamusi154007,Heilongjiang,China)

An HPLC-QAMS method was established for quantitative analysis on multi-components by single marker in analysis on Ankahuangmin capsule for the simultaneous determination of three main constituents. Using paracetamol as an index, the relative factors of caffeine and chlorphenamine maleate were established by HPLC, which was used to calculate the content. It shows no significant difference between the results of QAMS method and those external standard methods, RSD<0.78%. It shows that this method is feasible and suitable which valuate the quality of paracetamol, caffeine and chlorphenamine maleate in Ankahuangmin capsule by QAMS.

high performance liquid chromatography(HPLC); quantitative analysis of multi-components by single marker (QAMS); Ankahuangmin capsule; relative correction factors (RCF)

10.13524/j.2095-008x.2016.02.026

2015-12-22

http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1566.T.20160615.1617.002.html

國家自然科學基金資助項目(51402092)

董微微(1989-)，女，吉林德惠人，碩士，研究方向：現(xiàn)代分離分析技術(shù)，E-mail: 394664475@qq.com;*通訊作者：欒芳(1975-)，女，黑龍江樺南人，副教授，博士，碩士研究生導師，研究方向：現(xiàn)代分離分析技術(shù)，E-mail:fangfang628628@126.com。

TQ460.7

A

2095-008X(2016)02-0052-06